Обоснование
Использование низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ) в медицине оправдано сложившимися представлениями об отсутствии побочных действий, безболезненностью процедур и возможностью четкого контроля за дозой облучения. При этом возможны фотоиндуцированная диссоциация оксигемоглобина с выделением молекулярного кислорода, светокислородный и фотодинамический эффекты, связанные с образованием синглетного кислорода, и локальный бионагрев тканей, связанный с поглощением излучения и безизлучательной потери энергии молекулами гемоглобина. Все эти процессы будут определяться длиной волны НИЛИ и плотностью потока облучения. Самая сильная полоса резонансного поглощения кислорода находится в области 1270 нм, где отсутствует поглощение конкурентных хромофоров. Рядом экспериментальных работ подтверждена гипотеза инициации образования активных форм кислорода при длине волны от 1264 до 1270 нм [1—3].
Установлено, что в клетках, не имеющих эффективных фоторецепторных систем, фотодинамическое действие, запускающее механизмы окислительного стресса, играет сигнальную функцию, активируя экспрессию генов и синтез каскада ферментов, ответственных за защитные реакции клеток [1]. Возможно, этим объясняются некоторые биологические и терапевтические эффекты, вызванные действием НИЛИ на клетки и ткани, не содержащие экзогенных красителей. Установлено, что для НИЛИ доза 30 Дж/см2 активирует микроциркуляцию, доза 70 Дж/см2 и выше — ее расстройство, доза 0,005—0,05 Дж/см2 стимулирует пролиферацию клеток, доза 0,1—1,0 Дж/см2 — метаболизм тканей и функции органов, доза 0,1—3,0 Дж/см2 — метаболизм тканей и аналгезию.
Воздействие инфракрасного НИЛИ на кожу используется в косметологических процедурах, при заживлении ран за счет антимикробного, противовоспалительного и репаративного эффектов [4]. Обширное рецепторное поле кожи обусловливает системное влияние на организм. Показано, что инфракрасное лазерное излучение в дозе от 5 до 40 Дж/см2 часто используют для локальной лазерной гипертермии новообразований: излучение обеспечивает коагуляционный некроз опухоли при минимальном повреждении окружающих здоровых тканей. В доступной литературе отсутствуют данные, позволяющие предполагать отсроченный негативный эффект НИЛИ инфракрасного диапазона на кожу.
Цель исследования — изучить влияние НИЛИ инфракрасного диапазона с длиной волны 1270 нм на кожу мышей линии Balb/cNude.
Методы
Дизайн исследования
Проведено проспективное интервенционное контролируемое нерандомизированное исследование на линейных иммунодефицитных мышах Balb/cNude (питомник лабораторных животных «Пущино» филиала ФГБУН «Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАН). Животные однократно получали НИЛИ инфракрасного диапазона. Для оценки гипотезы о влиянии НИЛИ на кожу облученных участков и участков кожи, не подвергшихся облучению, того же животного проводили морфологические и генетические исследования.
Критерии соответствия
В исследование были включены животные одинакового пола, возраста и массы.
Условия проведения
Исследование выполнено на базе Научно-исследовательского медико-биологического центра и Научно-образовательного центра лазерных и волоконно-оптических технологий Ульяновского государственного университета. Самцы массой 30±3 г в возрасте 3 мес находились в условиях специализированного вивария. В качестве источника излучения был использован лазер, излучающий в ближнем инфракрасном диапазоне и работающий в непрерывном режиме с длиной волны 1270 нм, мощностью 1,96 мВт.
Продолжительность исследования
Общая продолжительность исследования составила 16 сут, из которых 14 сут животные адаптировались к условиям содержания вивария, на 15-е сутки проводили однократное облучение волоконным лазером в течение 2 мин. На 16-е сутки животные были выведены из эксперимента.
Описание медицинского вмешательства
Экспериментальные животные были разделены на две группы: опытную и контрольную. Животных опытной группы однократно облучали волоконным лазером вынужденного комбинационного рассеивания с длиной волны 1270 нм, мощностью 1,96 мВт, экспозицией 2 мин, интенсивностью 10 мВт/см2, плотность потока энергии составила 1,2 Дж/см2. Животных контрольной группы также фиксировали в держателе на 2 мин, но не подвергали НИЛИ.
Основной исход исследования
Гистологическое исследование включало определение количества кератиноцитов базального слоя эпидермиса на единицу площади. Определяли наличие митозов в кератиноцитах и диффузной лимфо-лейкоцитарной инфильтрации в соединительной ткани подкожной жировой клетчатки и в эндомизии после воздействия НИЛИ. Оценивали уровень экспрессии микроРНК-31, -21, 200с и -218.
Этическая экспертиза
Комиссия по этике биомедицинских исследований Института медицины, экологии и физической культуры Ульяновского государственного университета на своем заседании в соответствии с правилами GCP рассмотрела документы по планированию и проведению исследований в рамках работы по влиянию лазерного излучения инфракрасного диапазона с длиной волны 1270 нм на мышей линии Balb/cNude и сделала заключение № 11 от 30 ноября 2016 г. о том, что работа не противоречит этическим нормам.
Методы регистрации исходов
Морфологические методы исследования. Для гистологического исследования брали аутоптат кожи мышей диаметром 0,5 см в участке, подвергшемся лазерному воздействию. Тот же участок кожи забирали у мышей контрольной группы. Фиксацию материала проводили в 10% нейтральном формалине. Серийные парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Морфометрию структур кожи проводили с помощью видео-тест-системы, включающей микроскоп Motic, цифровую видеокамеру JVC (Япония) и компьютерную программу денситофотометрии «Мекос-С1» (Россия) при увеличении 10, 40. Количественный анализ проводили на условной единице площади среза. Морфометрические данные статистически обрабатывали с определением критерия значимости (t) по Стьюденту, уровень значимости (p) был принят <0,05.
Молекулярно-генетические методы. Дизайн праймеров для исследуемых микроРНК осуществляли с помощью программы miRprimer2. Среди микроРНК, для которых было проведено исследование паттерна экспрессии, были выбраны те молекулы, относительно которых в литературе представлены данные, доказывающие их роль в физиологических процессах, протекающих в коже: микроРНК-21, -31, -130а, -191, -200с, -205 и -218. Фиксированную в растворе RNA-later (ООО «Евроген») кожу размером 0,5×0,5 см тонко нарезали для последующего выделения тотальной РНК с использованием магнитных частиц («РеалБест экстракция 100» ООО «Вектор Бест»). Реакцию обратной транскрипции проводили сразу после выделения (MMLV Kit, ООО «Евроген»). Реакцию обратной транскрипции и полимеразную цепную реакцию в реальном времени с зондами и праймерами TaqMan (ООО «Синтол») выполняли на амплификаторе нуклеиновых кислот CX96 (BioRad, США). Для нормализации данных в качестве гена-рефери для клеток кожи была выбрана микроРНК-191 (ThermoFisherScientific, США). Расчет относительной экспрессии проводили по протоколу Qiagen: ΔΔСt=ΔCt1 (опыт)—ΔCt2 (норма). Normalised target gene expression level =2–ΔΔCt.
Статистический анализ
Для расчета минимально необходимого объема выборки в целях обеспечения ее репрезентативности была использована формула Лера. При мощности критерия 80% и двустороннем уровне значимости 0,05 при сравнении двух групп (предварительная оценка величины эффекта была выбрана равной 1,4 среднеквадратичного отклонения) необходимый размер выборки в опытной и контрольной группах равен 8.
Биоинформационный анализ сигнальных путей при участии микроРНК-21, -31, -200c и 218, подтвержденных функциональными исследованиями, проводили с помощью базы данных DIANA miRPath v.3.0. (с применением TargetScan v.7.0).
Статистическую значимость полученных результатов оценивали с помощью непараметрического U-критерия Манна—Уитни. Различия между группами считали достоверными при р<0,05.
Результаты
Основные результаты исследования
Гистологический анализ показал, что кожа спины мышей опытной группы после воздействия НИЛИ имеет мелкоскладчатый рельеф и тонкий эпидермис, как и в контрольной группе. Гистоархитектоника кожи не нарушена (рис. 1, 2).
При проведении морфометрии у мышей опытной группы определялось достоверное повышение количества кератиноцитов базального слоя (7,92±0,26 против 7,22±0,22 в контроле) на условную единицу площади. Результаты исследований указывают на роль микроРНК в регуляции процессов пролиферации, дифференцировки и апоптоза в коже [5]. МикроРНК — относительно новый класс эндогенных, некодирующих одноцепочечных малых РНК, которые участвуют в регуляции экспрессии генов на посттранскрипционном уровне [6]. Паттерн экспрессии микроРНК тканеспецифичен. В результате проведенных исследований нами установлено повышение экспрессии микроРНК-31 и -21 (рис. 3),
Обсуждение
Повышение количества базальных эпителиоцитов, вероятно, произошло за счет более высокого уровня митотической активности клеток этого слоя после воздействия лазерного излучения. Отсутствие значимого количества фигур митоза объясняется забором экспериментального материала спустя сутки после воздействия лазером. Митотическое деление длится около 6—8 ч. Поэтому спустя 24 ч обнаружено более частое расположение ядер на единице площади.
МикроРНК-31 — это ключевой регулятор пролиферации и миграции кератиноцитов, дифференциации и роста волос [7]. Повышенная экспрессия микроРНК-31 отмечается при ряде кожных заболеваний, характеризующихся избыточной пролиферацией кератиноцитов: псориаз, хроническое воспалительное заболевание кожи, длительное заживление ран [8] и плоскоклеточная карцинома [9].
МикроРНК-21 — онкомикроРНК, принимающая участие в регуляции клеточной пролиферации, апоптоза, метастатического поведения ряда злокачественных опухолей, в частности меланомы, в регулировании экспрессии белка и ядерных функций внутри клеток. Данная микроРНК обладает мощным стимулирующим действием, способствуя росту и пролиферации опухолевых клеток глиом через ингибирование экспрессии опухолевого супрессора PTEN, что приводит к активации Akt-зависимых сигнальных путей, связанных с усиленным синтезом проонкогенных рецепторов EGFR, IGFR и VEGFR [10]. Кроме того, возможно, микроРНК-21 регулирует гены, вовлеченные в процессы миграции клеток.
МикроРНК-200с и -205 участвуют в регуляции клеточного цикла, а также в эпителиально-мезенхимальном переходе и процессе приобретения клеткой эмбрионального фенотипа посредством прямой (для микроРНК-200с) и через посредника (для микроРНК-205) регуляции экспрессии генов ZEB1 и ZEB2, подавляющие транскрипцию гена E-кадгерина [11]. В ряде экспериментов показано, что снижение экспрессии микроРНК-218 приводит к стимуляции пролиферации клеток кожи [12].
Как показал биоинформационный анализ, микроРНК-21 и -31 участвуют в регуляции таких важных сигнальных путей при канцерогенезе, как PI3K-Akt signaling pathway, Jak-STAT signaling pathway, MAPK signaling pathway, mTOR signaling pathway, а также имеют сигнальное значение при развитии меланомы, почечного рака, рака простаты и глиомы (см. таблицу).
МикроРНК выступают в качестве регуляторов посттранскрипционной активности генов в коже, которые осуществляют контроль за делением кератиноцитов, и дифференцировки других клеточных элементов кожи. Усиление процессов пролиферации, связанное с повышением активности микроРНК-21 и -31, а также изменение профиля экспрессии микроРНК-200с и -218 могут свидетельствовать о возможности возникновения биостимулирующего эффекта на кожу.
Заключение
Таким образом, полученные результаты позволяют предполагать активацию специфических для опухолевых клеток, а также базовых процессов в коже иммунодефицитных мышей линии Balb/cNude под влиянием НИЛИ с длиной волны 1270 нм в дозе 1,2 Дж/см2.
Дополнительная информация
Источник финансирования. Исследование проведено на личные средства авторского коллектива.
Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.
Участие авторов: Долгова Д.Р. — постановка эксперимента и полимеразной цепной реакции; Воронова О.С. — подбор потока энергии для облучения, получение экспериментального материала; Генинг Т.П. — обобщение результатов; Абакумова Т.В. — постановка эксперимента; Золотовский И.О. — создание лазерной установки и обеспечение ее использования в эксперименте; Слесарева Е.В. — описание гистологических препаратов; Полуднякова Л.В. — подготовка биоматериала для проведения полимеразной цепной реакции; Смирнова Е.В. — постановка гистологических исследований; Песков А.Б. — проведение статистической обработки экспериментальных данных. Все авторы внесли значимый вклад в проведение исследования и подготовку публикации, прочли и одобрили финальную версию статьи.
Благодарности. Авторы выражают благодарность к.б.н. Т.И. Кузнецовой за техническую помощь в подготовке гистологических препаратов.
Сведения об авторах
Генинг Татьяна Петровна, д.б.н., профессор, академик РАЕН [Tatyana P. Gening, PhD, Professor]; адрес: Россия, 432017, Ульяновск, ул. Арх. Ливчака, 2 [address: 2, Arch. Livchak str., 432017 Ulyanovsk, Russia]; https://orcid.org/0000-0002-5117-1382; eLibrary SPIN: 7285-8939; e-mail: naum-53@yandex.ru
*Долгова Динара Ришатовна, к.б.н. [Dinara R. Dolgova, PhD]; https://orcid.org/0000-0001-5475-7031; eLibrary SPIN: 7093-3564; e-mail: dolgova.dinara@yandex.ru
Абакумова Татьяна Владимировна, к.б.н., доцент [Tatyana V. Abakumova, PhD]; https://orcid.org/0000-0001-7559-5246; eLibrary SPIN: 7093-3564; e-mail: taty-abakumova@yandex.ru
Воронова Ольга Сергеевна, к.б.н. [Olga S. Voronova, PhD]; https://orcid.org/0000-0001-9249-9678; eLibrary SPIN: 6662-1846; e-mail: baby13.87@mail.ru
Смирнова Евгения Валерьевна, к.б.н. [Evgeniya V. Smirnova, PhD]; https://orcid.org/0000-0002-6603-7864; eLibrary SPIN: 7968-6648; e-mail: ev.val.smirnova@mail.ru
Золотовский Игорь Олегович, к.ф.-м.н., доцент [Igor O. Zolotovskii, PhD]; https://orcid.org/0000-0002-1793-5211; eLibrary SPIN: 6976-8044; e-mail: rafzol.14@mail.ru
Полуднякова Людмила Викторовна, к.б.н. [Ludmila V. Poludnyakova, PhD]; https://orcid.org/0000-0002-1096-444X; eLibrary SPIN: 8627-7750; e-mail: ya-mila-33@ya.ru
Слесарева Елена Васильевна, д.м.н., профессор [Elena V. Slesareva, MD, PhD]; https://orcid.org/0000-0003-3326-7863; eLibrary SPIN: 5944-9148; e-mail: gistology2@mail.ru
Песков Андрей Борисович, д.м.н., профессор [Andrey B. Peskov, MD, PhD; https://orcid.org/0000-0001-7323-9934; eLibrary SPIN: 9011-4322; e-mail: abp_sim@mail.ru