Ультраструктурные изменения клеток Сертоли семенников крыс при применении питьевой минеральной воды в сочетании с микроэлементами цинком и кремнием в условиях стресса

Экспериментально установлено, что профилактическое применение питьевой сульфатной минеральной воды (МВ), особенно в сочетании с другими адаптогенными средствами, в частности микроэлементами (МЭ) цинком и кремнием, ограничивает развитие стрессорных нарушений в семенниках крыс [1]. Эффект такого действия связан с формированием потенциально более мощных механизмов адаптации, которые структурно проявлялись развитием регенераторно-гиперпластических реакций [2—5]. Для выявления особенностей этих реакций необходимо проведение электронно-микроскопических исследований с оценкой выраженности противоположно направленных процессов — деструкции (некробиоза) и регенерации (гиперплазии).

В семенниках эти процессы целесообразно изучать в клетках Сертоли (сустентоцитах), которые являются наиболее крупными соматическими клетками этого органа, выполняющими важные функции в регуляции процессов сперматогенеза. С позиций профилактики полученная информация позволит более обоснованно подойти к пониманию усиления механизмов внутриклеточной адаптации, направленных на повышение устойчивости структур клетки к действию стресса, а также на восстановление утраченного гомеостаза.

Цель исследования — выявить в динамике ультраструктурные нарушения и проявления регенераторно-гиперпластических реакций в клетках Сертоли крыс в условиях иммобилизационного стресса и при профилактическом применении питьевой сульфатной МВ в сочетании с МЭ цинком и кремнием.

Исследования были проведены на 20 белых беспородных крысах-самцах массой 180—200 г. Работа с животными проводилась в соответствии с Хельсинской декларацией, «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ Минздрава СССР от 12.04.87 №755) и Федеральным законом РФ от 01.01.97 «О защите животных от жестокого обращения». До воздействия стресса крыс разделили на группы. В 1-й опытной группе животные получали питьевую сульфатную магниево-кальциевую МВ (концентрация сульфата 1,93 мг/л, минерализация 3,05 г/л) в сочетании с МЭ цинком и кремнием (18 процедур поения). После приема МВ крысы дополнительно (через 15—20 мин) получали водные растворы цинка и кремния, 1 мл которых соответственно содержали 0,11 мг цинка и 0,3 мг кремния. Во 2-й опытной группе (группа сравнения) крысы получали ту же питьевую сульфатную магниево-кальциевую МВ, что и в 1-й группе, но вместо раствора цинка и кремния применялась водопроводная вода. В 3-й группе (контрольная) животные получали только водопроводную воду. 4-ю группу составляли интактные крысы, которые никаким воздействиям не подвергались. МВ и водопроводную воду вводили крысам внутрижелудочно 1 раз в день по 3 мл, водные растворы цинка и кремния — по 1 мл каждого через иглу с оливой на конце. На следующий день после окончания курсов поения крысы опытных и контрольной групп подвергались воздействию иммобилизационного стресса по методике Селье однократным привязыванием крыс в течение 6 ч в положении на спине [6]. Животных декапитировали через 1,7 и 14 сут после действия стресса.

Для электронно-микроскопических исследований семенники фиксировали в 4% параформальдегиде, приготовленном на фосфатном буфере (рН 7,4), постфиксировали в 1% ОsО4. После обезвоживания в серии спиртов и ацетона образцы заключали в смесь эпон-аралдит. На ультратоме Reichert (Австрия) получали ультратонкие срезы, которые просматривали в электронном микроскопе Libra (Германия). Морфометрический анализ митохондрий (Мх) и рибосом выполняли с помощью автоматизированной системы MOP-Videoplan (Австрия). Полученные данные обрабатывали методом вариационной статистики с применением критерия Стьюдента.

У животных контрольной группы через 1 сут после стресса в клетках Сертоли обнаруживались явления дезорганизации цитоплазмы, уменьшение числа органелл и их деструкция, некоторые признаки ослабления внутриклеточных резервов. Об этом свидетельствовали локальные просветления и отечность цитоплазмы, деструкция Мх в виде утраты крист и матрикса, фрагментация и расширение профилей гранулярной и агранулярной эндоплазматической сети (рис. 1, а).

Рисунок 1. Ультраструктурные изменения клеток Сертоли семенников крыс контрольной группы (поение водопроводной водой + стресс). а — 1 сут. Выраженное расширение и слияние цистерн гранулярной и агранулярной эндоплазматической сети с образованием вакуолей и крупной полости; деструкция органелл (стрелки), уменьшенное число рибосом; б — 14 сут. Деструкция органелл (стрелки), расширение просветов эндоплазматической сети; формирование структур гранулярной эндоплазматической сети (двойная стрелка). Здесь и на рис. 2: СО — собственная оболочка семенного канальца; ГЭС — гранулярная эндоплазматическая сеть; Р — рибосомы и полисомы; ×18 000.

Число рибосом снижалось на 71,5% (р<0,01) по сравнению с таковым у интактных животных. При этом со стороны Мх проявлялась слабая тенденция к увеличению их числа, однако этот адаптационный механизм не смог оказать существенного влияния на биоэнергетику клетки: как средняя, так и суммарная площадь Мх снизилась фактически в 2 раза (р<0,01). К 7-м суткам после стресса явления отечности цитоплазмы в части клеток Сертоли становились более выраженными, активизировались лизосомальные структуры. Регенерация и новообразование органелл проявлялись в слабой форме. Через 14 сут процессы регенерации усиливались, однако и в этот срок в отдельных клетках продолжали сохраняться явления деструкции органелл (см. рис. 1, б).

В отличие от контроля, предварительное применение питьевой сульфатной МВ через 1 сут после стресса снижало по ряду показателей уровень ультраструктурных нарушений в клетках Сертоли. Это относилось в первую очередь к ослаблению явлений отечности и процессов деструкции органелл, в частности со стороны мембран гранулярной эндоплазматической сети. Вместе с тем содержание рибосом, как и в контрольной группе, было снижено (интактные животные — 36,20±0,98; контроль — 21,10±1,33; р<0,01; МВ — 22,70±1,29). Возрастала суммарная площадь Мх (на 35,7%; р<0,01) в связи с тенденцией к увеличению их числа и средней площади (см. таблицу).

Однако к 7-м суткам происходил определенный спад в биоэнергетическом обеспечении клеток, особенно по сравнению с предыдущим сроком исследования (1 сут). Усиление биоэнергетических процессов происходило в более позднем периоде постстрессорного воздействия (к 14-м суткам): число Мх по сравнению с таковым в контрольной группе возрастало на 37,8% (р<0,01), а суммарная площадь — на 48,5% (р<0,01). При этом наблюдалось также увеличение числа рибосом (контроль 20,9±0,09; МВ — 27,63±0,64; р<0,01) и признаки гиперплазии мембранных структур комплекса Гольджи.

При применении МВ в сочетании с МЭ цинком и кремнием изменения Мх через 1 сут после стресса носили сходный характер с действием МВ: суммарная их площадь также возрастала (на 39,3%; р<0,01), при этом количество Мх становилось самым низким среди всех групп животных (см. таблицу). Местами обнаруживались деструктивно измененные Мх, а также расширенные цистерны гранулярной эндоплазматической сети, однако в целом наблюдалась значительно лучшая сохранность органелл по сравнению с контролем и действием МВ (рис. 2, а).

Рисунок 2. Ультраструктурные изменения клеток Сертоли семенников крыс при применении питьевой сульфатной МВ в сочетании с МЭ цинком и кремнием с последующим действием стресса. а — 1 сут. Более высокая сохранность гранулярной эндоплазматической сети и рибосом по сравнению с контролем. Деструкция единичных Мх (стрелка); б — 7 сут. Формирование новой гранулярной эндоплазматической сети (стрелки), укрупнение Мх и расширение просветов крист, активация лизосом (Л) и фагосом (Ф), расширение межклеточного пространства (двойная стрелка); в — 14 сут. Гиперплазия рибосом и полисом.

В дальнейшем через 7 сут (см. таблицу) происходило выраженное увеличение численности Мх (на 35,1%; р<0,01), их средней (на 12,5%) и суммарной площади (на 46,2%; р<0,05) по сравнению с предыдущим сроком и в еще большей степени — по сравнению с действием МВ (соответственно на 45,2%, р<0,01, на 50,0%, р<0,01 и на 111,1%, р<0,001). Кроме того, в клетках Сертоли наблюдалось также формирование новой гранулярной эндоплазматической сети, увеличение числа рибосом и лизосом (см. рис. 2, б). Подобные адаптационные сдвиги в этот срок в контрольной группе и при действии МВ не обнаруживались. Поэтому следует подчеркнуть, что этот период усиления синтетических процессов структурно выражался в увеличении числа органелл, их гиперплазии и гипертрофии и наступал раньше, чем при применении МВ, что являлось характерной особенностью сочетанного действия МВ и МЭ.

В дальнейшем, к 14-м суткам, синтетические процессы по ряду показателей продолжали нарастать, что проявлялось в еще большем увеличении количества Мх: на 52,5% по сравнению с предыдущим сроком (р<0,01) и более чем в 2 раза по сравнению с начальным сроком наблюдения (р<0,001). Суммарная площадь Мх была увеличена по сравнению с таковой в контрольной группе и приблизительно соответствовала действию МВ. Более высоким становилось содержание свободных рибосом и полисом: контроль — 20,9±0,69; МВ — 27,63±0,64 (р<0,01); МВ+МЭ — 30,1±0,60 (р<0,01). Иногда они заполняли большие участки цитоплазмы (см. рис. 2, в). Наблюдалось также новообразование гранулярной эндоплазматической сети с удлиненными цистернами. Местами хорошо был развит пластинчатый комплекс Гольджи с различными по размеру диктиосомами, содержащими иногда хлопьевидную субстанцию. Все эти сдвиги указывали на усиление внутриклеточных регенераторно-гиперпластических процессов. Вместе с тем в клетках Сертоли иногда выявлялись мелкие локальные деструктивные изменения, в основном со стороны отдельных Мх, а также расширенные межклеточные пространства.

Таким образом, в условиях иммобилизационного стресса наиболее выраженные нарушения в ультраструктуре клеток Сертоли обнаружены у животных контрольной группы. В основном они проявлялись в виде дезорганизации цитоплазмы, нарушений тонкой структуры Мх и уменьшения их численности, редукции гранулярной эндоплазматической сети, значительного снижения числа рибосом. При этом признаки стимуляции внутриклеточной регенерации, особенно в ранний постстрессорный период, развивались в слабой степени и были не способны структурно компенсировать стрессорные нарушения. У животных опытных групп в большей части клеток Сертоли обнаруживался иной комплекс сдвигов — деструктивные процессы в той или иной степени ослаблялись, а регенераторно-гиперпластические реакции, наоборот, усиливались.

В наибольшей мере эти сдвиги наблюдались при сочетанном применении МВ и МЭ цинка и кремния. Вначале, в ранний постстрессорный период, они проявлялись в повышении устойчивости и соответственно в лучшей сохранности ультраструктур клеток Сертоли. Это, в свою очередь, предопределило и дальнейший ход развития регенераторно-гиперпластических процессов — их более раннее и выраженное развитие по сравнению с таковым в контрольной группе и при действии МВ. Следовательно, сочетанное действие МВ и МЭ цинка и кремния в большей мере, чем при действии монофактора — МВ, повышает устойчивость (надежность) механизмов адаптации, что способствует более эффективному развитию защитно-адаптационных реакций в клетках Сертоли в ответ на действие стресса.