Введение

Диагностика грибковых тел околоносовых пазух (ОНП) может в ряде случаев представлять определенные сложности: клиническая картина этой патологии неспецифична [1], данные современных методов визуализации околоносовых пазух бывают неоднозначными по своей трактовке [2], и даже операционные находки в виде бесструктурных масс, заполняющих пазуху, не всегда оказываются проявлением грибкового поражения [3]. Как правило, для диагностики грибкового процесса в пазухах требуется использование нескольких методов верификации процесса: микроскопии, культурального, молекулярно-генетического, серологического методов, патоморфологического исследования. При этом молекулярные, серологические и патоморфологические методы выявления грибковых микроорганизмов характеризуются максимальной чувствительностью и специфичностью [4].

Цель исследования — сопоставить результаты патоморфологического и микробиологического методов исследования грибковых тел, удаленных во время эндоскопического вскрытия околоносовых пазух.

Материал и методы

Изучен операционный материал 148 больных, оперированных по поводу грибковых тел ОНП. По локализации грибковые тела распределялись следующим образом: у 116 больных — в верхнечелюстной пазухе, у 22 — в клиновидной, у 7 — в решетчатой, у 3 — в лобной. Диагноз установлен на основании результатов компьютерной томографии ОНП и обнаружения грибов при патоморфологическом исследовании содержимого пазух. Бесструктурные массы, заполнявшие пазуху, подвергались первичной нативной микроскопии и микроскопии препаратов, окрашенных калькофлуором белым, гематоксилином и эозином, по Граму, по Гомори—Грокотту, а также использовали ШИК-метод — окраску на выявление полисахаридов с применением фуксинсернистой кислоты (PAS-реакция).

Забор материала для культурального исследования осуществляли интраоперационно в стерильные контейнеры с последующим посевом на специальные и элективные питательные среды. Выделенные культуры микроорганизмов идентифицировали с помощью стандартных тестов (культуральных, морфологических, тинкториальных и биохимических). Статистический анализ проводили с использованием критерия Пирсона χ² с поправкой Мантеля—Хензеля, критерия Крамера, рангового коэффициента корреляции Спирмена и коэффициента сопряжения (программа Statistica 10.0).

Результаты

Изучение препаратов методом светооптической микроскопии показало наличие фазовых изменений в грибковых телах, обусловленных различными циклами их жизни: в материале присутствовали участки молодого, зрелого и дегенерирующего мицелия (рис. 1 на цв. вклейке). Участки мицелия, находящиеся в разных стадиях развития, располагались слоями, образуя плотную, компактную структуру (рис. 2 на цв. вклейке). Молодые гифы нередко обнаруживали признаки деления с формированием конидиальных головок (рис. 3, а на цв. вклейке), в то время как по мере старения гифы грибов утолщались и лизировались, что приводило к формированию детрита (рис, 3, б на цв. вклейке). В участках детрита отмечалось скопление колоний бактерий. В прилегающей к грибковому телу слизистой оболочке не было признаков инвазии грибов, но отмечалась воспалительная лимфо-макрофагальная инфильтрация с небольшим количеством нейтрофилов.

Рис. 1. Грибковое тело. Выраженные дегенеративные изменения мицелия грибов Aspergillus spp.

Окраска гематоксилином и эозином. ×400.

Рис. 2. Грибковое тело. Мицелий и споры гриба Aspergillus spp.

Окраска гематоксилином и эозином. ×400

Рис. 3. Грибковое тело.

а — споровые конидиальные головки; б — дегенерация мицелия гриба Aspergillus spp.; в — колонии бактерий в детрите. а — окраска по Гомори—Грокотту; б, в — окраска гематоксилином и эозином. ×400.

Рост грибов на элективных средах обнаружен у 26 (17,6%) из 148 больных, причем в 8 (30,8%) случаях грибы выделены в виде монокультуры, а в 18 (69,2%) — в составе грибково-бактериальных ассоциаций. При анализе родовой и видовой принадлежности отмечено преобладание грибов рода Aspergillus (в 16 случаях): Aspergillus niger — в 5 посевах, Aspergillus flavus и Aspergillus terreus — по 2 случая, Aspergillus fumigatus и Aspergillus oryzae — по 1 случаю, в 5 случаях видовую принадлежность Aspergillus spp. определить не удалось. В составе бактериально-грибковых и грибковых ассоциаций высевались грибы рода Candida в 2,02% случаев. Кроме того, в единичных случаях выделены грибы рода Alternaria spp., Fusarium spp., Sporotrichum spp., Rhizopus spp., Bipolaris spicifera, Arthrographis kalrae и недифференцируемый плесневый гриб.

Аэробная и анаэробная бактериальная микробиота идентифицирована в 76 (62,3%) и 39 (32%) случаях соответственно, в основном в виде многокомпонентных ассоциаций, содержащих 2 и более видов. Анаэробная микробиота в монокультуре представлена родом Bacteroides и обнаружена в 7 (5,7%) случаях.

Среди выделенных бактериальных микроорганизмов отмечено преобладание Staphylococcus spp. и Pseudomonas aeruginosa (69 и 49 случаев соответственно), кроме того, обнаруживались Klebsiella spp. (34 случая), Escherichia coli (29 случаев), Enterobacter cloacae (24 случая), реже высевались Acinetobacter spp., Streptococcus spp., Achromobacter и другие микроорганизмы.

Таким образом, частота обнаружения грибов при культуральном исследовании оказалась значительно ниже, чем при патоморфологическом исследовании. Мы предположили, что причиной такого различия показателей может быть подавляющее воздействие сопутствующей бактериальной микробиоты на рост грибов, о чем свидетельствуют немногочисленные исследования [5], а также известные данные о биологических свойствах бактериальных микроорганизмов. Для подтверждения нашей гипотезы мы провели статистический анализ результатов микологического и бактериологического исследования с оценкой сопряжения (контингенции) между высеваемостью грибов и каждого из выделенных бактериальных возбудителей. Достоверные признаки подавления грибов обнаружены у Pseudomonas aeruginosa. Это свойство не утрачивалось и в ассоциациях, представленных Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus spp. (таблица). Для остальных микроорганизмов значения показателей сопряжения были статистически незначимыми.

Оценка контингенции между высеванием грибов и присутствием бактериальной флоры

Примечание. 1 — критерий Пирсона χ² с поправкой Мантеля—Хензеля; 2 — критерий Крамера; 3 — ранговый коэффициент корреляции Спирмена; 4 — коэффициент контингенции (сопряжения); * — статистически значимые показатели (p<0,05).

Обсуждение

Наше исследование подтверждает имеющиеся в литературе данные о том, что грибковое тело проходит в своем развитии несколько стадий: от первичной колонизации преформированной полости до гибели этиологически значимых грибковых патогенов. Это может объяснить низкую чувствительность культурального метода выявления грибов: в нашем исследовании грибы высеяны в 17,6% случаев, по данным других авторов, их высеваемость не превышает 30% [5]. Возможно, в ряде случаев мы сталкивались с грибковыми телами, состоящими из утративших жизнедеятельность грибковых микроорганизмов, или забор материала производился в участке дегенерации грибкового тела. Следует отметить, что даже погибшее грибковое тело может оказывать неблагоприятное влияние на формирование иммунных реакций организма в силу сохранения погибшим грибковым телом антигенных свойств [6], поэтому и в этих случаях требуется его удаление.

Еще одно важное обстоятельство, которое может влиять на результативность микологического исследования, это способность некоторых бактерий ингибировать рост грибов [7]. В нашем исследовании в подавляющем большинстве случаев обнаруживается присутствие бактериальной микробиоты в виде многокомпонентных бактериальных и бактериально-грибковых ассоциаций, что согласуется с данными других работ [8]. Конгломераты бактерий в участках дегенерации грибковых тел идентифицированы и при поведении микроскопического исследования. Логично предположить, что рост грибов зависит от свойств бактериальной составляющей этих ассоциаций. Статистический анализ выявил статистически значимое подавление роста грибов в присутствии Pseudomonas aeruginosa, обнаруженной в 33,1% случаев. Синегнойная палочка является продуцентом ряда веществ с ярко выраженной антагонистической активностью в отношении грибов: пиоцианинов [9], пиовердина [10], четырех типов феназинов [11].

Возможную причину низкой высеваемости грибов указывали J.U. Ponikau и соавт. [12], которые считали, что причина ее кроется в слизи, покрывающей гифы грибов и препятствующей их контакту с питательной средой. Применение муколитических средств перед посевом увеличивало выявляемость грибов до 96%.

Заключение

При культуральном исследовании грибковых тел, удаленных из околоносовых пазух, рост грибов обнаружен в 17,6% случаев. Аэробная и анаэробная микробиота в содержимом пазух представлена в виде многокомпонентных бактериальных и грибково-бактериальных ассоциаций. С помощью статистического анализа контингенции между высеванием грибов и присутствием бактериальной флоры доказано достоверное ингибирующее влияние синегнойной палочки на рост грибов, что может быть одной из причин их низкой высеваемости. Патоморфологическое исследование грибковых тел выявило стадийность их развития, что также может объяснить низкую чувствительность культурального метода.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Бойко Н.В.

Сбор и обработка материала — Бойко Н.В., Стагниева И.В., Банников С.А.

Написание текста — Бойко Н.В., Гуров А.В.

Редактирование — Бойко Н.В., Гуров А.В.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.