Плейоморфизм цитокинового профиля в ткани полипов в зависимости от фенотипа полипозного риносинусита

Полипозный риносинусит (ПРС) характеризуется интенсивным воспалительным процессом, связанным с локальной продукцией целого ряда медиаторов и цитокинов и рядом структурных изменений. Под воздействием триггерных факторов активированные эпителиальные клетки являются первоначальным источником синтеза определенных цитокинов, индуцирующих хемотаксис в слизистую оболочку носа и околоносовых пазух (ОНП) воспалительных клеток, чаще всего эозинофилов, с последующей пролиферацией и активацией фибробластов и в конечном итоге с образованием полипов. Кроме эозинофилов в ткани полипов определяются нейтрофилы, плазматические, тучные клетки, макрофаги и лимфоциты, которые также играют свою роль в патологическом процессе. Одновременно происходит пролиферация эпителия и утолщение базальной мембраны с накоплением внеклеточного матрикса [1, 2].

Основным подходом в персонализированной медицине является разделение пациентов на подгруппы на основе их специфических фенотипов или эндотипов и подбор лечения в каждой из них. Первоначально это было применено при оценке бронхиальной астмы (БА), затем изучено при других патологических процессах, в том числе при ПРС. Считается, что дифференциация позволит более эффективно и результативно лечить эти воспалительные состояния, а также позволит улучшить анализ результатов лечения.

По эндотипам ПРС можно классифицировать на основе поляризации типа иммунного ответа. Иммунный ответ 1-го типа поддерживается Th1-поляризацией, связанной с нейтрофильной инфильтрацией и избыточной продукцией IFN-γ; этот эндотип наиболее распространен в Азии. Воспалительный ответ 2-го типа определяется интерлейкинами (IL)-4, IL-5 и IL-13 и преобладанием эозинофилов, тучных клеток, базофилов и Т-хелперных 2 (Th2) клеток в ткани носовых полипов и часто сопровождается сопутствующей патологией в виде бронхиальной астмы (БА) и респираторной аллергией (РА). Иммунный ответ 3-го типа характеризуется повышенным высвобождением цитокинов семейства IL-17, он связан с частыми обострениями. Следует отметить, что ПРС является плейоморфным заболеванием и при нем часто отмечается смешанный локальный иммунный ответ — 1-го и 2-го типов с периодическим наложением воспаления 3-го типа. Этот плейоморфизм в основном зависит от пластичности врожденных лимфоидных клеток 2-го типа, которые усиливают воспаление 2-го типа независимо от сопутствующей РА [3].

Поэтому, с одной стороны, идентификация биомаркеров может быть полезна для точного выявления конкретных биологических механизмов, лежащих в основе патологического процесса, но, с другой стороны, эти исследования являются экспериментальными и не могут применяться в повседневной практике ввиду технической сложности, отсутствия стандартизированных методик и необходимости финансовых затрат [2]. Гетерогенность воспалительного процесса привела к неудачным попыткам разработать универсальные схемы ведения этого контингента больных, а ранжирование пациентов с единым механизмом развития полипозного процесса в отдельные группы оказалось невозможным из-за отсутствия утвержденных показателей конкретных биомаркеров, исследование которых было бы возможным в медицинских учреждениях любого уровня. Поэтому выделение клинических фенотипов полипозного риносинусита по наличию или отсутствию определенной коморбидной патологии является наиболее приемлемым в условиях реальной медицинской практики. Ранее при исследовании уровня экспрессии генов в ткани носовых полипов методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР РВ) нами выявлены разные воспалительные паттерны при ПРС в зависимости от наличия или отсутствия аллергического ринита (АР), аллергической (аБА) и неаллергической бронхиальной астмы (нБА) [4]. Одновременно статистически значимые различия установлены при изучении клинического течения, анализе данных лабораторных и патоморфологических исследований, что доказывает различия в характере течения патологического процесса при фенотипах ПРС [5]. Определение экспрессии генов цитокинов позволяет дать оценку потенциальным возможностям клеток к синтезу определенных биомолекул. Но определение реального содержания непосредственно самих рассматриваемых цитокинов при предложенных нами фенотипах ПРС позволит более детально изучить механизм локального воспалительного процесса у этих пациентов.

Цель исследования — сравнить особенности воспалительного ответа у пациентов с разными фенотипами ПРС по уровню секреции ключевых цитокинов в ткани носовых полипов.

В ГБУЗ МО «МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского» за период 2016—2019 гг. проведено обследование 292 больных ПРС (средний возраст 52,12±13,04 года), из них 126 мужчин и 166 женщин. Диагноз двустороннего ПРС подтвержден данными компьютерной томографии ОНП, эндоскопическим исследованием полости носа и результатами патоморфологического исследования.

Критерии невключения в исследование: односторонний процесс, наличие генетических синдромов (аллергический эозинофильный или гранулематозный ангиит, муковисцидоз, синдром Черджа—Стросс), онкологической и аутоиммунной патологии. В ФГБУ «ФНКЦ ФМБА России» всем пациентам проведено аллергологическое обследование, которое включало сбор анамнеза, скарификационные кожные пробы с атопическими аллергенами, и выполнена диагностика БА методом спирометрии (модель спирографа MS-IOS Digital, Jaeger, Viasys Healthcare GmbH, Германия) с проведением теста с бронхолитиком для определения обратимости бронхиальной обструкции.

По результатам обследования больные разделены на четыре фенотипические группы: группа 1 — ПРС без сопутствующей БА и сенсибилизации к атопическим аллергенам, 100 человек, средний возраст 51,58±1,49 года; группа 2а — ПРС в сочетании с аБА и АР, 49 человек, средний возраст 50,39±2,42 года; группа 2б — ПРС в сочетании с АР без аБА, 46 человек, средний возраст 51,37±3,25 года; группа 3 — ПРС в сочетании с нБА, 97 человек, средний возраст 54,71±2,49 года. В группу контроля вошли больные с гипертрофическим ринитом на фоне длительного приема сосудосуживающих препаратов при отсутствии непереносимости нестероидных противовоспалительных препаратов, РА, БА и другой хронической оториноларингологической патологии в анамнезе — 36 человек (19 женщин и 17 мужчин, средний возраст 43±11,7 года). Хирургическое лечение проведено пациентам в состоянии ремиссии — в объеме эндовидеоскопической полипотомии носа у пациентов с ПРС и резекции задних концов нижних носовых раковин у пациентов с гипертрофическим ринитом. Резецированную ткань очищали от крови, гомогенизировали, центрифугировали и собирали супернатант. Последний помещали в пластиковую микропробирку и замораживали при температуре –60°C. Перед проведением исследования в иммунологической лаборатории ИИФ УрО РАН производили единовременное быстрое размораживание всего материала, после чего пробирки центрифугировали 10 мин со скоростью 1500 об/мин. В надосадочной жидкости методом мультиплексного анализа на иммуноанализаторе MAGPIX-100 (Luminex Corporation, США) с использованием системы мультиплексного анализа Bio-Plex (Bio-Rad, США) выполнили исследование уровня IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, IFN-γ, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3. Одновременно пирогаллоловым методом определяли содержание общего белка с последующим перерасчетом содержания цитокинов на концентрацию белка 1 мг/мл для стандартизации метода [6].

Статистические расчеты выполнены при помощи программы IBM SPSS Statistics 23.0 (SPSS Inc., США). При определении средних значений использовали методы непараметрической статистики, показатели указаны в виде медианы и межквартильного интервала (Me [Q1; Q3]). При сравнении двух групп между собой использовали критерий Манна—Уитни, при множественном сравнении — критерий Краскела—Уоллиса. Различия при p<0,05 рассматривались как статистически значимые.

При исследовании уровней содержания изучаемых нами цитокинов в тканях носовых полипов при разных фенотипах ПРС выявлены статистически значимые различия. У пациентов группы контроля выявлены минимальные уровни всех определяемых цитокинов, которые статистически значимо ниже по сравнению с показателями пациентов с ПРС всех групп. Повышение уровней провоспалительных цитокинов IL-1β, IL-6 и IFN-γ в ткани носовых полипов свидетельствует о локальном персистирующем хроническом воспалительном процессе даже у пациентов с ПРС вне периода обострения. Уровни IL-1β (3,33 [1,2; 5,71] пг/мг) и IFN-γ (1,6 [0,93; 1,9] пг/мг) статистически значимо ниже у пациентов группы 2а, а уровень IL-6 статистически значимо выше у пациентов группы 2б (2,66 [1,18; 3,16] пг/мг) (таблица). Остальные группы по этим показателям не различаются между собой. Наибольшее содержание Т2/Th2-белков — цитокинов IL-5 (22 [1,8; 3,39] пг/мг) и IL-13 (8,69 [1,86; 17,0] пг/мг) в ткани носовых полипов выявлено у пациентов группы 1. У пациентов группы 3 уровень IL-5 (2,15 [0,13; 3,84] пг/мг) статистически значимо выше по сравнению с пациентами групп 2а и 2б. По содержанию IL-13 пациенты групп 2б и 3 статистически значимо не различаются.

Таблица. Уровень цитокинов в ткани носовых полипов при фенотипах полипозного риносинусита

Примечание. * — статистически значимая разница между референсными показателями и показателями у пациентов групп 1 и 3; ^# — статистически значимая разница между показателями у пациентов группы 1 и пациентов групп 2 и 3; ^& — статистически значимая разница между показателями у пациентов группы 2а и пациентов групп 2б и 3; ^£ — статистически значимая разница между показателями у пациентов группы 2б и пациентов группы 3.

Напротив, наименьшее содержание трансформирующего фактора роста TGF-β1 и TGF-β2 выявлено у пациентов группы 1 (3,43 [2,11; 4,29] пг/мг и 9,02 [6,2; 11,84] пг/мг соответственно). При сравнении фенотипических групп ПРС с сопутствующей патологией статистически значимая разница относительно этих двух изоформ трансформирующего фактора роста найдена между группами пациентов с БА, причем с меньшими значениями в группе 2а: 3,54 [2,6; 4,71] пг/мг TGF-β1 и 14 [8,2; 17,5] пг/мг TGF-β2. Статистически значимых различий между группами 2б и 3 относительно TGF-β1 (4,76 [3,33; 5,94] пг/мг и 5,68 [3,75; 8,79] пг/мг соответственно) и TGF-β2 (17 [11,02; 25,69] пг/мг и 24,12 [14,11; 40,12] пг/мг соответственно) не выявлено. По максимальному уровню TGF-β3 статистически значимо от групп 1 и 2а отличается группа 3 (7,97 [4,68; 17,8] пг/мг); у пациентов группы 2б также выявлено статистически значимо более высокое содержание TGF-β3 (7,81 [3,9; 10,0] пг/мг) по сравнению с пациентами групп 1 и 2а.

ПРС — это многогранное заболевание, часто характеризующееся множеством фенотипов и эндотипов, которые могут смешиваться между собой. Вектор течения воспалительного процесса при ПРС зависит не от единственной конкретной клеточной единицы, а от одновременного взаимодействия нескольких клеточных субпопуляций, синтезирующих определенный, характерный для каждой клетки набор цитокинов. Поскольку основой патологического процесса является именно локальное воспаление слизистой оболочки ОНП, исследование уровня цитокинов крови в отличие от цитокинов непосредственно в ткани полипов не имеет большой диагностической ценности. IL-1β, IL-6 и IFN-γ являются провоспалительными цитокинами, которые синтезируются в фибробластах, эндотелиальных и эпителиальных клетках. Они стимулируют выработку Th2-лимфоцитами и эозинофилами хемокинов RANTES (regulated upon activation normal T-cell expressed and secreted), эотаксина-1 (CCL11), эотаксина-2 (CCL24), эотаксина-3 (CCL26), что вызывает хемотаксис в очаг воспаления тучных клеток, гранулоцитов, макрофагов, разных популяций лимфоцитов, повышая проницаемость сосудов, гиперсекрецию слизи, отек ткани, пролабирование слизистой оболочки и рост полипов [7]. IL-1β индуцирует выработку тимусного стромального лимфопоэтина (TSLP) в эпителиоцитах, который через миелоидные дендритные клетки вызывает дифференцировку Th0 в Th2 [4]; IL-6 в сочетании с трансформирующим фактором роста β стимулирует поляризацию Th17 или Tc17 [8], играет решающую роль для рекрутирования, выживания и сохранения эффекторных Т-клеток, предотвращения их апоптоза в ткани полипов [9—11]. Синтез в фибробластах, эндотелиальных и эпителиальных клетках IL-6 и IL-1 повышен при повторных операциях в связи с рецидивами ПРС [12].

IFN-γ, IL-4 и IL-13 нарушают плотные соединения эпителиальных клеток за счет снижения экспрессии белков и ослабляют трансэпителиальную устойчивость [13]. Увеличение уровня IL-6 в назальных смывах ранее описано при астматической триаде [14]. IFN-γ играет протективную роль при ПРС, снижая риск развития БА [15]; IL-6 также повышен при ПРС и важен для рекрутирования, выживания и сохранения эффекторных Т-клеток, предотвращения их апоптоза в полипозной ткани [9—11]. Цитокины иммунного ответа 2-го типа IL-4, IL-5 и IL-13 ответственны за хемотаксис воспалительных клеток и активацию эозинофильного воспаления, гиперплазию бокаловидных клеток и переключение плазмоцитов на продукцию IgE [16], способствуют дифференцировке Th2-лимфоцитов из наивных Th0-лимфоцитов [17]. Дополнительно IL-4 способствует альтернативной активации макрофагов, а IL-5 индуцирует эозинофилию посредством рекрутирования, активации и выживания эозинофилов [18]. Цитокины семейства TGF-β представляют собой провоспалительные модуляторы активности фибробластов, которые регулируют активацию, пролиферацию и дифференцировку клеток и приводят к активному образованию соединительной ткани при ПРС [19, 20].

Отмечено, что уровни всех исследуемых нами цитокинов значительно выше, чем у пациентов группы контроля, что подтверждает наличие персистирующего воспалительного процесса при ПРС, хотя все пациенты прооперированы в состоянии ремиссии. ПРС без сопутствующей РА и БА (группа 1) характеризовался самым высоким среди всех фенотипов содержанием IL-5 и IL-13 и низким содержанием всех изоформ TGF-β при единственном отсутствии значимого различия — концентрации TGF-β3 с таковой в группе 2а. В группе 1 уровни провоспалительных цитокинов IL-1β и IFN-γ статистически значимо выше, чем в группе 2а, а уровень IL-6 меньше, чем в группе 2б. В группе 2а провоспалительные цитокины IL-1β, IFN-γ выявлены в минимальном количестве по сравнению со всеми другими группами, IL-4 — на уровне группы 3, а IL-5 — на уровне группы 2б, но меньше, чем в группах 1 и 3. Уровни всех изоформ фактора роста TGF-β при аБА также меньше, чем при нБА.

Наличие АР отличает группу с самым высоким содержанием IL-6 — группу 2б, уровень IL-1β в этой группе достоверно выше, чем в группах с сопутствующей БА, а содержание Th2-цитокинов — IL-4, IL-5, IL-13 находится в пределах средних показателей. Уровни TGF-β также отличаются в группе 2б высокими цифрами: TGF-β1 и TGF-β2 — на уровне группы 3 и выше, чем в группах 1 и 2а, а TGF-β3 — на уровне группы 2а и ниже, чем в группе 3. При комбинации ПРС с нБА (группа 3) наблюдается максимальное содержание TGF-β3, а по уровням TGF-β1 и TGF-β2 в группе 3 отмечаются также высокие значения и отсутствие разницы с группой 2б.

Полученные различия уровней цитокинов в носовых полипах в разных группах еще раз [4, 21] доказывают разное течение и плейотропность воспалительного процесса при ПРС в зависимости от наличия или отсутствия сопутствующей БА или РА. Персонализированная медицина определяется как способность идентифицировать субпопуляции, которые различаются по своей восприимчивости, патогенезу или прогнозу течения того или иного заболевания либо по их реакции на конкретное лечение [22]. При этом проведение эндоскопического осмотра полости носа, анализ данных КТ, данных патогистологического анализа и установление врачом-аллергологом наличия или отсутствия БА или РА для определения фенотипа ПРС с целью выработки дальнейшей терапевтической стратегии — абсолютно реально выполнимая задача в условиях медицинских учреждений практически любого уровня.

Разработка терапии моноклональными антителами ко многим ключевым регуляторным молекулам поможет решить проблемы ПРС с постоянными рецидивами, но при этом первой линией препаратов остаются универсальные противовоспалительные препараты локального действия — интраназальные кортикостероиды; при необходимости их можно комбинировать с другими лекарственными веществами, в том числе с биологическими препаратами [23], внедрение которых в практику обеспечит подбор персонализированной терапии у этих пациентов [24]. Разделение пациентов на фенотипы можно рассматривать как полезный инструмент в ведении амбулаторных пациентов с ПРС, поскольку такое разделение позволяет оптимально определить наиболее подходящую терапию.

Оценка уровней цитокинов в носовых полипах при различных фенотипах полипозного риносинусита показала выраженную плейотропность секреции различных цитокинов в зависимости от той или иной коморбидной патологии при данном заболевании.

Фенотип полипозного риносинусита без респираторной аллергии и бронхиальной астмы отличает повышенный уровень локальных белков IL-5 и IL-13 и низкое содержание всех изоформ фактора роста TGF-β. При сочетании полипозного риносинусита с аллергическим ринитом выявлен высокий уровень провоспалительных цитокинов IL-6 и IL-1β, а также TGF-β1 и TGF-β2. При комбинации полипозного риносинусита с аллергической бронхиальной астмой отмечается минимальное содержание провоспалительных цитокинов IL-1β, IFN-γ, при сочетании полипозного риносинусита с неаллергической бронхиальной астмой наблюдается максимальное содержание TGF-β1, TGF-β2 и TGF-β3 в ткани носовых полипов.

Каждый фенотип полипозного риносинусита характеризуется определенным механизмом локального воспаления, что подтверждает необходимость активного поиска бронхиальной астмы и респираторной аллергии у этих пациентов.

Определение локального цитокинового профиля при фенотипах полипозного риносинусита в последующем может способствовать подбору таргетной антицитокиновой терапии для пациентов, у которых это заболевание плохо поддается базисной кортикостероидной терапии.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.