Логунова Е.В.

Кафедра оториноларингологии; лаборатория клинической микробиологии Московского областного научно-исследовательского клинического института им. М.Ф. Владимирского, Москва, Россия, 129110

Егоров В.И.

Чувашский государственный университет им. И.Н. Ульянова, Вторая городская больница, Чебоксары

Наседкин А.Н.

Отдел хирургии детей и подростков ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Д. Рогачева, Москва

Русанова Е.В.

Кафедра оториноларингологии; лаборатория клинической микробиологии Московского областного научно-исследовательского клинического института им. М.Ф. Владимирского, Москва, Россия, 129110

Использование ферментов с целью повышения эффективности антимикробной фотодинамической терапии больных хроническим тонзиллитом

Журнал: Вестник оториноларингологии. 2016;81(2): 44-48

Просмотров : 27

Загрузок : 1

Как цитировать

Логунова Е. В., Егоров В. И., Наседкин А. Н., Русанова Е. В. Использование ферментов с целью повышения эффективности антимикробной фотодинамической терапии больных хроническим тонзиллитом. Вестник оториноларингологии. 2016;81(2):44-48. https://doi.org/10.17116/otorino201681244-48

Авторы:

Логунова Е.В.

Кафедра оториноларингологии; лаборатория клинической микробиологии Московского областного научно-исследовательского клинического института им. М.Ф. Владимирского, Москва, Россия, 129110

Все авторы (4)

В настоящее время хронический тонзиллит (XT) занимает одно из ведущих мест в ЛОР-патологии. Тонзиллярная проблема на современном этапе приобретает все бо́льшую актуальность в связи с ростом тонзиллогенной патологии как местного, так и системного характера [1]. К тому же этим заболеванием в большей степени страдают пациенты трудоспособного возраста. Одним из альтернативных методов лечения ХТ в настоящее время стала антимикробная фотодинамическая терапия (АФДТ). Однако работы предыдущих лет показали, что и она не всегда эффективна, особенно при наличии у пациента ХТ токсико-аллергической формы II степени (ТАФ-II) [2]. Снижению эффективности лечения ХТ способствует бесконтрольное применение антибиотиков, что приводит к появлению резистентности микроорганизмов к используемым препаратам. Также установлено, что бактериальным популяциям как в естественных условиях обитания, так и при культивировании in vitro свойственно образование биопленок, т. е. организованных сообществ бактерий, обладающих уникальными биологическими свойствами. Биопленка существенно повышает толерантность микроорганизмов, внедренных в ее матрикс, к иммунной системе хозяина, антимикробным агентам и стрессам окружающей среды (например, ограничения в кислороде и питании). Эта толерантность может способствовать полной резистентности к факторам, которые могли бы легко уничтожить этих же самых микробов в случае их роста в незащищенном, планктонном состоянии [3, 4].

Организованные сообщества бактерий обладают рядом функциональных особенностей. Например, им свойственна блокировка, в результате которой внеклеточный полисахаридный матрикс защищает микробы от проникновения в глубинную структуру биопленки крупных молекул (например, антител) и клеток, вызывающих воспаление (нейтрофилов, лимфоцитов и др.). Зрелая биопленка может также служить диффузным барьером даже для таких небольших молекул, как антимикробные агенты [5]. Другое уникальное свойство полимикробных биопленок — взаимная защита, т.е. способность проявлять совокупные защитные свойства, которыми бактерии различных видов могут обмениваться между собой. Например, антибиотикоустойчивые бактерии способны выделять защитные энзимы или связывающие протеины, которые могут защищать находящиеся в биопленке антибиотикочувствительные бактерии [6]. Также они могут передавать другим бактериям гены, отвечающие за резистентность, в том числе между различными видами бактерий [7]. В исследованиях показано, что специфические характеристики биопленок, присущие одному виду бактерий, могут играть существенную роль в способности других видов бактерий присоединяться и внедряться в существующий матрикс [8]. Стратегия выживания, выработанная многими бактериями в биопленках, определяет еще одну их особенность, называемую бездействие (неподвижные бактерии) — это образование метаболически неподвижных (неактивных) субпопуляций. Для того чтобы антибиотик подействовал на бактерии, последние должны быть метаболически активными, поэтому неактивные микроорганизмы в биопленках не подвергаются воздействию антибиологических препаратов [6]. В исследованиях показано, что наиболее низкие концентрации, требуемые для уничтожения или удаления бактериальной биопленки, для большинства антибиотиков фактически превышают максимальные прописываемые врачами дозы [9, 10]. Таким образом, стандартные пероральные дозировки для тех антибиотиков, которые эффективно уничтожают планктонно выращенные в лаборатории бактерии, могут иметь слабое антимикробное действие или быть вовсе неэффективными в отношении того же типа бактерий, находящихся в биопленках. Поскольку резидентные бактерии в составе биопленок устойчивы как к воздействию неспецифических и специфических факторов естественной резистентности человеческого организма, так и к действию антибактериальных препаратов, можно предположить, что формирование бактериальных биопленок в криптах небных миндалин может быть одной из основных причин хронизации и рецидивирующего течения ХТ [11]. Следовательно, возможное использование ферментов, приводящих к разрушению межклеточного матрикса биопленки, будет способствовать переходу микроорганизмов в состояние планктона, что, несомненно, повысит эффективность АФДТ.

Цель работы — повышение эффективности антимикробной фотодинамической терапии больных с различными формами хронического тонзиллита путем превентивного использования литических ферментов.

Пациенты и методы

В исследовании приняли участие 48 пациентов (32 женщины, 16 мужчин) в возрасте 18—55 лет. Все пациенты страдали ХТ (простая форма — 22 человека (12 женщин, 10 мужчин), ТАФI — 15 человек (8 женщин, 7 мужчин) и ТАФII — 11 человек (6 женщин и 5 мужчин)). У всех женщин ХТ впервые был диагностирован в возрасте 18—24 лет, а у мужчин — в возрасте 15—18 лет. Простая форма характеризовалась местными признаками и обострениями в виде ангин в анамнезе. ТАФI диагностировали при наличии признаков простой формы и токсико-аллергических проявлений (периодический субфебрилитет, тонзиллогенная интоксикация, шейный лимфаденит, периодические боли в суставах, функциональны нарушения со стороны сердца, не определяющиеся при объективном исследовании). Если у пациента имелось сопряженное заболевание или более выраженные токсико-аллергические явления, а также функциональные нарушения внутренних органов инфекционного характера, диагностировалась ТАФII.

Ранее всем больным проводили консервативное лечение — промывание лакун небных миндалин по Н.В. Белоголовову, местную и общую противовоспалительную терапию и различные виды физиотерапии (УВЧ, СВЧ, лезеротерапия, тубус-кварц и др.) Длительность эффекта от полученного ранее лечения сохранялась от 0 до 6 мес. Четверо больных с ТАФ II воздерживались от тонзиллэктомии в связи с наличием тяжелой сопутствующей патологии: аутоиммунная тромбоцитопения у 1 пациента; декомпенсированный сахарный диабет с полинейропатией, ишемическая болезнь сердца (ИБС) и стенокардия I функционального класса (ФК) у 1 пациента; 2 пациентки страдали ИБС, гипертронической болезнью II-б степени, артрозом тазобедренных суставов. Остальные 7 больных с ТАФ II (4 женщины и 3 мужчин) от тонзиллэктомии отказались, в связи с чем 8 больным проведена АФДТ ХТ, а 3 пациентам — очередной курс консервативной терапии. Паратонзиллярные абсцессы в анамнезе наблюдались у 3 больных. Двум пациентам ранее была выполнена лакунотомия.

При осмотре всех пациентов мы оценивали состояние слизистой оболочки полости рта, цвет небных дужек, величину и структуру небных миндалин, характер содержимого небных миндалин, а также оценивали состояние регионарных лимфатических узлов. Диагноз устанавливали на основании жалоб больного, анамнеза, данных клинического и лабораторного обследований, наличия сочетанных или сопряженных заболеваний.

По способу проведенной нами терапии все пациенты были объединены в три группы. 1-ю группу составили 12 пациентов (5 с простой формой ХТ, 4 — с ТАФI, 3 — с ТАФII), получавшие курс традиционной консервативной терапии. Во 2-ю группу вошли 17 пациентов (8 с простой формой ХТ, 5 с ТАФI, 4 с ТАФII) после АФДТ. 3-ю группу составили 19 пациентов, которым перед АФДТ воздействовали на слизистую оболочку небных миндалин раствором лидазы. Распределение больных по группам осуществляли случайным образом. Катамнез во всех группах больных составлял 6—9 мес. Исследование проводили на базе ЛОР-клиники, консультативно-диагностического отделения и лаборатории клинической микробиологии ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского.

Микробиологическое исследование содержимого лакун небных миндалин произведено у больных всех трех групп. Забранный материал в сухой стерильной пробирке в течение 1 ч доставляли в лабораторию, где проводили определение вида микроорганизмов, их титр и чувствительность к антибактериальным препаратам. Процент обсемененности проб клинического материала рассчитывали как отношение количества выделенных культур к количеству проб с ростом (табл. 1).

Таблица 1. Содержание титра микрофлоры лакун небных миндалин у пациентов с различными формами хронического тонзиллита до проведения лечения, % Примечание. Достоверных различий процентного содержания высеваемой микрофлоры из лакун небных миндалин у пациентов разных терапевтических групп не обнаружено.

Результаты микробиологического исследования у всех наблюдавшихся нами больных были схожими — из лакун небных миндалин были веделены стрептококки группы Viridians, Neisseria spp., S. aureus, стрептококки группы D, Enterococcus spp., Enterobacteriaceae и Candidaalbicans. Средняя концентрация составила 5,2·107±2,7·107 КОЕ/мл. Микробиологический материал, полученный со слизистых оболочек небных миндалин у пациентов, страдавших различными формами ХТ, обладал высокой степенью пленкообразования, что было отмечено при микроскопическом исследовании.

В дальнейшем с учетом полученных микробиологических данных была проведена экспериментальная работа по изучению действия ферментов (трипсин, лидаза, рибонуклеаза) на зрелые бактериальные биопленки, сформированные монокультурами и их ассоциациями.

Работы выполнялись с предварительно выращенными биопленками в 96-луночных планшетах следующим образом: в 1-й группе культур на биопленки воздействовали ферментами, разведенными в терапевтической концентрации; во 2-й группе ферменты не использовались (контроль). По окончании периода инкубации лунки промывали физиологическим раствором 3 раза и из лунок планшета стерильным тампоном брали мазок. Микроорганизмы высевали на кровяной агар и через 12 ч производился подсчет колоний.

Все используемые ферменты были приготовлены в жидком виде в концентрации, рекомендуемой инструкцией. По истечении 10 мин воздействия фермента биопленки оставались без изменений, через 20 мин — определялось краевое фрагментирование матрикса, через 40 мин — вся биопленка при микроскопировании была разделена на фрагменты, через 60 мин — биопленка эмульгировалась. Эффективность разрушения матрикса определяли по отношению концентрации микроорганизмов, оставшихся в лунке планшета, к результатам в группе контроля, где воздействия ферментов не было.

Сравнительный анализ результатов показал, что трипсин и рибонуклеаза за 60 мин воздействия практически не разрушали бактериальные биопленки, сформированные монокультурами. Титр микроорганизмов в опытных и контрольных образцах был одинаков и составил от 106 до 108 КОЕ/мл. Подобный результат был получен и после воздействия этих ферментов на биопленки, сформированные ассоциациями коагулазонегативных стафилококков в одном случае с энтерококками, а в другом — со стрептококками группы D. Однако после воздействия лидазы в тех же условиях концентрация микробных клеток снижалась в 100—1000 раз (табл. 2).

Таблица 2. Изменение титра микроорганизмов биопленок (КОЕ/мл) после воздействия на них различными ферментами в эксперименте Примечание. * — достоверность различий p<0,05.

Таким образом, для разрушения бактериальной биопленки, сформированной наиболее часто встречающимися ассоциациями микроорганизмов, эффективным ферментом оказалась лидаза. Этот факт и послужил обоснованием выбора данного препарата для проведения клинической части работы.

В условиях клиники пациенты 1-й группы получали только консервативное лечение ХТ (промывание лакун небных миндалин, антибактериальную терапию, физиолечение и др.) Пациентам 2-й группы была проведена АФДТ, которую осуществляли по методике, разработанной в клинике оториноларингологии МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского (фотосенсибилизатор (ФС) радахлорин, 0,35% раствор для внутривенного введения и лазер Лахта-Милон, длина волны излучения 662 нм, мощность до 2,5 Вт). Пациентам 3-й группы также была выполнена АФДТ, но предварительно, в целях разрушения межклеточного матрикса биопленок, перед введением ФС в лакуны небных миндалин при помощи канюли вводили фермент лидазу по 1—2 капли, повторяя введение 3—4 раза (64 ЕД в 10 мл 0,9% физиологического раствора на 2 небные миндалины). Время воздействия фермента соответствовало эксперементально установленным 50—60 мин. После этого лакуны промывали 0,9% физиологическим раствором и вводили ФС при помощи канюли по 1—2 капли в каждую лакуну, повторяя введение 2—3 раза. Количество введенного ФС составило от 2 до 5 мл на обе миндалины. Через 50—60 мин остатки ФС удаляли путем полоскания полости рта физиологическим раствором (для исключения эффекта экранирования). В завершение процедуры проводили процедуру фотодинамического воздействия. Микробиологический контроль осуществляли на 5, 12, 24-е сутки после АФДТ и через 6—9 мес.

Результаты и обсуждение

У пациентов 1-й группы (контроль) после проведенного консервативного лечения частота рецидивов в последующие 6—9 мес осталась прежней (1—2 обострения ХТ за 3—4 мес). Мезофарингоскопия выявляла незначительное уменьшение гиперемии слизистой оболочки небных миндалин и небных дужек. Перечень высеваемой микрофлоры небных миндалин на 5, 9 и 12-е сутки остался прежним, но концентрация выделенных микроорганизмов снизилась в 10—100 раз. Через 7 мес у всех пациентов проявления ХТ, количество и состав микрофлоры вернулись на прежний уровень.

У пациентов 2-й группы на 5, 9 и 12-е сутки после АФДТ отмечали положительную динамику, характеризующуюся отсутствием выраженных признаков воспаления, что коррелировало со значительным снижением частоты встречаемости и концентрации выделенных микроорганизмов (на 2 порядка). Через 7—9 мес после АФДТ у всех пациентов результаты мезофарингоскопии указывали на отсутствие гиперемии слизистой оболочки небных миндалин, уменьшение валикообразного утолщения передних небных дужек, исчезновение явлений шейного лимфаденита и отсутствие казеозных пробок, а микробиологические результаты характеризовались выделением стрептококков группы Viridians 106 КОЕ/мл, стрептококков группы D и Candida albicans в концентрации 103 КОЕ/мл.

У пациентов 3-й группы после лечения методом АФДТ в комплексе с лидазой на 5—9-е сутки сохранялась только умеренная гиперемия слизистой оболочки небных миндалин, к 12-м суткам было отмечено полное купирование реактивных явлений, отсутствие запаха изо рта и казеозных пробок, уменьшение признаков воспаления шейных регионарных лимфатических узлов. Микробиологическое исследование показало наличие на слизистой оболочке стрептококков группы Viridians и Neisseria spp. в концентрации 105—106 КОЕ/мл, которые являются стабилизатором данной экониши, и отсутствие условных патогенов (S. aureus, Candidaalbicans). Клиническая картина в последующие 8—9 мес у всех пациентов 3-й группы после АФДТ оставалась прежней.

Четверо пациентов из 3-й группы, страдавшие ХТ ТАФ-II, после проведенной АФДТ в последующие 6—8 мес отметили явное улучшение общего самочувствия: температура тела нормализовалась, обострения ХТ не повторялись, запах изо рта и казеозные пробки исчезли, исчезла боль в крупных и мелких суставах, улучшились все лабораторные показатели, в том числе антистрептолизин-О, ревматоидный фактор, С-реактивный белок. При мезофарингоскопии у них было отмечено уменьшение отечности в области угла между небно-язычной и небно-глоточной дужками, гиперемии слизистой оболочки небных миндалин, уменьшение размера валикообразного утолщения передних небных дужек и снижение количества и размеров казеозных пробок и запаха изо рта. У двух пациентов с хроническим гломерулонефритом в последующие 9 мес после АФДТ рецидивов почечного заболевания не возникло.

У трех пациентов из 1-й и у двух пациентов из 2-й группы с ХТ ТАФII жалобы, клинические проявления и микробиологический пейзаж после АФДТ оставались без изменений. В последующие 5—6 мес ввиду неэффективности АФДТ им была выполнена тонзиллэктомия. Двум пациентам из 3-й группы с ХТ ТАФII, прошедшим курс лечения методом АФДТ в комплексе с лидазой, в последующем была выполнена тонзиллэктомия в связи с продолжавшимися обострениями ХТ и рецидивами сопряженных заболеваний (табл. 3).

Таблица 3. Результативность проведенного лечения пациентов с различными формами хронического тонзиллита по клиническим проявлениям заболевания через 6—9 мес после лечения, % Примечание. * — по сравнению с контрольной группой p<0,05.

Результаты проведенных микробиологических и клинических исследований указывают на возможность повышения эффективности АФДТ хронического тонзиллита путем превентивного воздействия ферментом (лидаза) на слизистую оболочку небных миндалин, что способствует разрушению межклеточного матрикса биопленки и снижению ее резистентности к фотодинамическому воздействию.

Конфликт интересов отсутствует.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail