Возрастающий научно-практический интерес к изучению состояния нервных волокон роговицы (НВР) продиктован рядом обстоятельств: во-первых, внедрением в клиническую практику современных конфокальных микроскопов, позволяющих в режиме реального времени неинвазивно получать изображения НВР [1]; во-вторых, необходимостью совершенствования диагностики на междисциплинарном уровне различных вариантов полинейропатии, при которых в первую очередь страдают тонкие безмиелиновые нервные волокна, в частности НВР. Прозрачность роговицы обеспечивает уникальную возможность прижизненной визуализации тонких немиелинизированных нервных волокон. В ряде исследований на основе лазерной конфокальной микроскопии роговицы было продемонстрировано наличие корреляций между изменениями в структуре НВР и наличием полинейропатии у пациентов с такими заболеваниями, как болезнь Паркинсона, сахарный диабет, системный амилоидоз. При этом выявлена корреляция между степенью повреждения НВР и стадией развития полинейропатии [2]. Помимо этого актуальность проблемы продиктована увеличением числа как кераторефракционных, так и интраокулярных хирургических вмешательств, выполнение которых увеличивает риск повреждения НВР.

Такие морфологические показатели, как извитость нервного волокна, длина НВР, их плотность, а также плотность ветвей НВР, традиционно вычисляют при помощи полуавтоматических компьютерных программ [3]. Этот режим предполагает проведение исследователем части анализа «вручную», что не исключает ошибок вследствие мануальной трассировки структур нервного волокна.

Анатомо-функциональные особенности нервных волокон роговицы

Нервные волокна дифференцируют в зависимости от их химического состава, электрофизиологических свойств, а также ответа на предъявляемый стимул. В соответствии со скоростью проведения возбуждения и наличия миелиновой оболочки выделяют следующие типы НВР: Аδ-волокна (толстые, миелиновые, скорость проведения возбуждения — 6 м/с) и С-волокна (тонкие, безмиелиновые, скорость проведения возбуждения — 2 м/с) [4, 5]. Более толстые миелиновые волокна нередко удается визуализировать при обычной биомикроскопии: НВР имеют вид тонких ветвящихся белесоватых нитей, по мере удаления от лимба нервные стволы постепенно истончаются. Нередкой является находка нервного вещества в виде узелков или нежных перепонок на месте разветвления некоторых миелиновых НВР [6].

Кроме этого выделяют механоноцицепторы (преимущественно Аδ-волокна), восприимчивые к механическому воздействию на поверхность роговицы, полимодальные ноцицепторы (в основном С-волокна) [7, 8], реагирующие на высокие температуры и на экзогенные химические агенты, а также холодовые рецепторы (смешанный тип волокон), восприимчивые к действию холодного воздуха и реагирующие на испарение слезной пленки [9].

Одной из основных функций НВР является преобразование температурных, механических и химических стимулов в воспринимаемый болевой рефлекс. Отмечены выраженная гетерогенность нервов роговицы и наличие значимого количества рецептивных полей, что можно объяснить высокой плотностью НВР; выявлено, что размеры рецептивных полей вариабельны и зависят от функционального класса нервов [9, 10]. Рецептивные поля холодовых рецепторов представлены преимущественно в зоне лимба, в то время как полимодальные и механоноцицепторы образуют обширные поля на всей поверхности роговицы. Повышенная восприимчивость в ответ даже на незначительный внешний стимул в первую очередь продиктована возможностью перекрытия соседних рецептивных полей.

По данным иммуногистохимических исследований, биохимический состав НВР весьма разнообразен и представлен различными нейротрансмиттерами, в состав которых входят субстанция P (SP), кальцитонин-ген-связанный пептид (CGRP), нейропептид Y (NPY), вазоактивный интестинальный пептид (VIP), галанин, метионин-энкефалин, катехоламины и ацетилхолин [11]. В состав большинства НВР, обладающих симпатической иннервацией, входят серотонин и NPY, в то время как биохимический состав парасимпатических НВР представлен VIP, NPY, а также галанином [12]. Роговица экспрессирует четыре основных класса нейротрофинов: фактор роста нервов (NGF), мозговой нейротрофический фактор (BDNF) и нейротрофины (NT-3 и -4). Кроме того, интерес представляют факторы, которые также служат для регулирования роста нервов роговицы и их направленности: семафорины (Sema-3A, -3F, -7), слит-белки (Slit-1, -2, -3), нетрины (netrin-2) и эфрины (ephrin-B2) вместе с их соответствующими рецепторами — нейропилинами (Nrp) и Robo-рецепторами [13].

Современные методы оценки состояния нервных волокон роговицы

Подходы к изучению состояния НВР можно условно разделить на функциональные и структурно-морфологические: в первом случае оценивают степень функциональных изменений, которые индуцированы патологическим процессом, во втором — анатомическое и гистологическое строение нервного волокна.

При попытке объективизации метода оценки чувствительности роговицы (эстезиометрия или альгезиметрия) выявлено, что биомеханическое сопротивление слезной пленки существенно влияет на результаты исследования [14]. Стабильность слезной пленки во многом зависит от физических свойств слезы и, как следствие, поверхностное натяжение не позволяет производить адекватный анализ чувствительности роговицы.

В последнее время для анализа анатомической структуры НВР используют различные варианты конфокальных микроскопов (световые и лазерные; рис. 1). Основы конфокальной микроскопии были заложены еще Марвином Мински (M. Minsky) в 1955 г., когда, являясь аспирантом Гарвардского университета, будущий нобелевский лауреат смоделировал и опробовал первый конфокальный микроскоп [15].

Рис. 1. Внешний вид лазерного конфокального микроскопа HRT III с модулем для исследования роговицы Cornea Rostock (Heidelberg Engineering, Германия).

В бесконтактном конфокальном микроскопе местоположение апертуры оптически сопряжено с фокусом, что отражено в термине «кон-фокальный», т.е. «со-фокусный». Конфокальная микроскопия роговицы дает возможность в режиме реального времени без предварительной подготовки визуализировать нервные сплетения. При этом в норме можно обнаружить длинные параллельно идущие тяжи или пучки нервов, хорошо контрастирующие на фоне темного фона [16].

Следует отметить, что имеющиеся на сегодняшний день способы оценки состояния НВР не лишены доли субъективного компонента — во многом качество анализа зависит от опыта исследователя. При этом затруднена количественная оценка степени патологических изменений НВР. Совершенствование методов оценки НВР может существенно расширить возможности диагностики и мониторинга различных заболеваний.

Установлено, что ход нервных волокон суббазального нервного сплетения сначала ориентирован в горизонтальном направлении, затем, после бифуркации волокон, занимает направление 12—3 часов, а после очередной бифуркации снова принимает горизонтальное положение. Таким образом, ход нервных волокон преимущественно имеет радиальное (височно-назальное) направление [17, 18] (рис. 2).

Рис. 2. Схематическое изображение НВР (адаптировано из [18]).

а — ход нервных волокон поверхностного нервного сплетения и более глубокого — стромального; б — «верхушка» роговицы, ориентация нервных волокон преимущественно в верхненижнем направлении.

Для анализа конфокальных снимков нами предложен алгоритм, основанный на применении двух авторских программных обеспечений (ПО). Программа Liner 1.2S позволяет выполнять анализ общей извитости нервного волокна, выражаемой в коэффициентах анизотропии и симметричности направленности НВР. По результатам обработки конфокальных снимков ПО автоматически строит так называемую розу-диаграмму направленности, по общему направлению которой можно судить об общей направленности НВР на заданном конфокальном снимке [19].

Работа программы основана на оригинальном алгоритме поиска нервных волокон. На начальном этапе обработки изображения анализируются вероятность нахождения точки НВР и угол его расположения. На следующем этапе происходит анализ вероятностей нахождения указанных точек на конфокальном снимке и их суммирование. ПО визуализирует нервное волокно как светлую полосу по отношению к темному фону и далее сравнивает точку НВР с модельной функцией. Модельная функция представляет собой квадрат со светлой полосой на темном фоне (наиболее приближенное к НВР изображение). Поскольку нервное волокно может быть расположено под любым углом, то и сравнение с модельной функцией производится под разными углами. При этом ПО определяет варианты наибольшего совпадения угла модельной функции и исходных участков нервного волокна. Далее после пошагового анализа всех исходных НВР (их точек) на конфокальном снимке и сравнения с «идеальной» модельной функцией происходит построение розы-диаграммы. При этом ПО устанавливает НВР на розе-диаграмме направленности под тем углом, под которым они были на исходном конфокальном снимке (рис. 3).

Рис. 3. Исходное конфокальное изображение (а); результат первого этапа работы программы (б) и соответствующая роза-диаграмма, иллюстрирующая направленность нервных волокон (в).

Программа Liner Calculate позволяет анализировать такие показатели, как длина и плотность основных НВР, длина и плотность отростков основных НВР, дополнительные НВР и их отростки, а также воспалительные макрофаги — клетки Лангерганса [20]. Трассирование выполняется мануально непосредственно исследователем (рис. 4).

Рис. 4. Интерфейс программы Liner Calculate в процессе обработки изображения.

Красным цветом обозначены основные НВР, зеленым — отростки основных НВР, синим — дополнительные НВР и их отростки; точечное обозначение зеленым цветом — макрофагальные клетки.

В предлагаемом алгоритме структурного анализа НВР в качестве основного признака, характеризующего структуру нервного волокна, выделен показатель извитости НВР, основанный в первую очередь на значениях коэффициента анизотропии. К дополнительным показателям, которые необходимы для выявления нарушений хода и структуры НВР, относят длину и плотность основных нервных стволов, наличие микроневром, а также увеличение числа и длины отростков клеток Лангерганса.

При уточнении диагноза при наличии признаков системной полинейропатии также учитывают такой параметр, как отсутствие положительной динамики на фоне проводимого консервативного лечения. Подтверждением наличия структурных нарушений может служить присутствие основного и как минимум двух дополнительных критериев (рис. 5). При подозрении на системный характер нейропатии обязательно рекомендуют консультацию невролога и эндокринолога с последующим динамическим наблюдением за состоянием НВР.

Рис. 5. Схематическое изображение алгоритма поиска структурных нарушений НВР.

На основе различных показателей (K_ΔL — коэффициент анизотропии направленности НВР, K_sym — коэффициент симметричности направленности НВР, длина основных нервных стволов, плотность основных нервных стволов, число макрофагов и микроневром) нами разработана стадийная морфометрическая классификация нарушений структуры НВР (таблица).

Стадийная классификация структурных нарушений НВР

Клиническое значение исследования нервных волокон роговицы

Основные направления исследований офтальмологического профиля были связаны с оценкой состояния НВР и клеток Лангерганса с помощью лазерной конфокальной микроскопии и описанного ПО после контактной и эксимерлазерной коррекции аметропий, факохирургии, сквозной трансплантации роговицы, кросслинкинга роговичного коллагена, а также при первичной открытоугольной глаукоме, дистрофии эпителия базальной мембраны, синдроме «сухого глаза» (ССГ) и вирусных увеитах [20].

Так, после перенесенных кераторефракционных вмешательств у пациентов отмечались выраженные изменения в структуре нервного волокна, при этом восстановление НВР наблюдали в среднем к 6 мес наблюдения. После эксимерлазерной коррекции аномалий рефракции различными способами НВР полностью отсутствовали в течение первых 2 мес исследования, этим можно объяснить выраженный ССГ у пациентов в раннем послеоперационном периоде. При сквозной трансплантации роговицы клетки Лангерганса были использованы как маркеры воспалительной реакции и показатели «приживляемости» трансплантата, при этом чем длиннее отростки у клеток, тем труднее приживался трансплантат. При ССГ, вирусном увеите и открытоугольной глаукоме имелась общность повреждения НВР, заключающаяся в уменьшении длины и плотности основных НВР и увеличении числа воспалительных макрофагов. При дистрофии базальной мембраны и ССГ выраженных структурных изменений НВР не выявлено, однако при таких патологиях нарушалась морфология вышележащих структур роговицы.

В процессе междисциплинарных исследований проведена оценка состояния НВР при различных клинических формах системных полинейропатий, таких как болезнь Паркинсона, системный амилоидоз, сахарный диабет и коронавирусная инфекция [21]. При указанных заболеваниях имелось повреждение тонких немиелиновых нервных волокон, заключающееся в нарушении их извитости, длины и плотности. Отмечена общность структурных нарушений НВР при развитии полинейропатии, что не дает возможности определения этиологии процесса самой нейропатии при различных системных заболеваниях.

Заключение

Прозрачность роговицы обеспечивает уникальную возможность прижизненной визуализации тонких немиелинизированных нервных волокон на близком к морфологическому уровне. Современное ПО, исключающее необходимость ручной трассировки выделенных фрагментов конфокального снимка, позволяет объективизировать процесс оценки структуры НВР на основе количественных показателей, характеризующих длину, плотность и извитость основных нервных стволов. Клиническое приложение структурного исследования НВР возможно в двух основных направлениях, связанных с непосредственными задачами офтальмологии и сопряженных с вопросами междисциплинарного характера. В офтальмологическом аспекте в первую очередь речь может идти о различных хирургических вмешательствах, потенциально влияющих на состояние роговицы, в частности ее нервного волокна, а также о хронических патологических процессах роговицы различного генеза.

Перспективы междисциплинарных исследований связаны с использованием НВР в качестве биомаркеров системных полинейропатий. Актуальным остается вопрос выявления начальных изменений тонких нервных волокон, когда первичные нарушения структуры волокон еще не сопровождаются клинической симптоматикой. Недостаточная специфичность основных признаков изменений НВР (плотность, направленность, извитость и т. д.) и условная общность проявлений независимо от патогенеза нарушений на сегодняшний день ограничивают возможности конфокальной микроскопии роговицы в качестве метода выявления патогномоничных признаков системных полинейропатий. Тем не менее относительная простота исследования, высокий уровень визуализации тонких нервных волокон и полученные в различных исследованиях результаты позволяют рекомендовать конфокальное микроскопическое исследование НВР в качестве первичного скрининга и последующего мониторинга нейропатий в комплексе с общепринятыми подходами.

Следует отметить, что на сегодняшний день оценка состояния НВР в указанных случаях носит в основном «констатирующий» характер, не предполагающий попыток уменьшения негативного воздействия различных факторов и стимуляции нейрорегенерации. Однако в последнее время все большее внимание уделяется возможности увеличения регенераторных свойств нервного волокна.

Учитывая, что возможность визуализации НВР появилась относительно недавно, потенциал применения конфокальной микроскопии роговицы с последующей интерпретацией снимков с изображением НВР весьма перспективен как для специалистов смежных специальностей, так и непосредственно для врачей-офтальмологов. Единственными методами анализа тонких немиелинизированных нервных волокон являются конфокальная микроскопия НВР и непосредственно инвазивная биопсия кожи, показания для выполнения которой должны быть весьма обоснованными.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.