Роговица относится к наиболее иннервируемым тканям организма человека: на 1 мм2 площади приходится порядка 7000 ноцицепторов. Уже к 3-му дню эмбрионального развития нервные волокна обнаруживаются в зоне лимба, к 11-му они проникают в слои роговицы, а к 13-му — под поверхностный эпителий. Иннервация роговицы преимущественно является сенсорной и осуществляется глазной ветвью тройничного нерва, формирующегося из нервного гребня. Нервные волокна роговицы (НВР) дифференцируют в зависимости от химического состава, электрофизиологических свойств, а также ответа на предъявляемый стимул. В соответствии со скоростью проведения возбуждения и наличия миелиновой оболочки выделяют следующие типы НВР: Аδ-волокна (толстые, миелиновые, скорость проведения возбуждения 6 м/с) и С-волокна (тонкие, безмиелиновые, скорость проведения возбуждения 2 м/с). Кроме сенсорных выделяют механоноцицепторы (преимущественно Аδ-волокна), восприимчивые к механическому воздействию на поверхность роговицы, полимодальные ноцицепторы (в основном С-волокна), реагирующие на высокие температуры и экзогенные химические агенты, а также холодовые рецепторы (смешанный тип волокон), восприимчивые к действию холодного воздуха и реагирующие на испарение слезной пленки.
Подходы к оценке состояния НВР можно условно разделить на функциональные и структурно-морфологические: в первом случае оценивают степень функциональных изменений, которые индуцированы патологическим процессом, во втором — изменения анатомического и гистологического характера [1—3].
Основным клиническим показателем функционального состояния НВР является чувствительность роговицы, которую исследуют с помощью различных методик эстезиометрии или альгезиметрии, основанных на оценке субъективной реакции испытуемого на выраженное в различной степени механическое воздействие на роговицу специальными волосками различного диаметра или струей воздуха. Несмотря на относительную простоту, исследование чувствительности роговицы широкого распространения в клинической практике не получило, главным образом из-за существенного влияния на результаты различных факторов. Так, например, выявлено, что, независимо от методики эстезиометрии, степень восприятия раздражающего стимула может существенно зависеть от индивидуальных особенностей слезной пленки [4].
Структурная оценка НВР доступна в силу прозрачности роговицы, а изменения волокон можно рассматривать не только в контексте заболеваний роговицы, но и в качестве маркера системных заболеваний для решения задач междисциплинарного характера. Для анализа структурного состояния НВР в настоящее время используют различные варианты конфокальных микроскопов. В настоящем сообщении обобщены результаты многолетних исследований, проведенных в ФГБНУ «НИИ Глазных болезней им. М.М. Краснова» и связанных с объективизацией определения показателей, отражающих состояние структуры НВР, а также с выделением области клинического интереса как офтальмологического, так и междисциплинарного характера.
Совершенствование анализа конфокальных изображений нервных волокон роговицы
В зависимости от принципа формирования изображений конфокальные микроскопы разделяют на световые и лазерные. Лазерные сканирующие конфокальные микроскопы (например, Heidelberg Retina Tomograph с роговичным модулем Rostock Cornea Module) обеспечивают возможность получения изображений высокого качества с максимальным разрешением. В качестве основных показателей состояния НВР при проведении конфокальной микроскопии, как правило, рассматривают длину, плотность и извитость основных нервных стволов. Анализ конфокальных изображений для оценки указанных показателей может осуществляться в ручном, полуавтоматическом и полностью автоматическом режиме. Ручная трассировка (выделение) НВР и полуавтоматический анализ не лишены доли субъективного компонента, в связи с чем в клиническую практику активно внедряют различные программы объективного автоматического анализа состояния НВР (например, CCMetrics, ACCMetrics и NeuronJ).
Разработанное оригинальное программное обеспечение (Liner 1.2 S и Liner Calculate) (см. рисунок) позволяет полностью автоматически интерпретировать изображения и генерировать карту вероятности прохождения НВР на участке, соответствующем этому изображению. При этом необходимо отметить, что участки нервных волокон, находящиеся вне фокуса, а также в пределах недоэкспонированных и зашумленных областей изображения, выделяются с использованием предлагаемого алгоритма лучше, чем при визуальном анализе.
Интерфейс программного обеспечения Liner Calculate после обработки конфокального снимка.
Красным выделены основные нервные стволы, зеленым — отростки НВР, желтым — клетки Лангерганса.
Программа предполагает последовательный анализ различных участков исходного снимка и оценку их сродства с «идеальным» участком нерва — сгенерированной математически светлой полосой в черном квадратном поле. При этом нервное волокно, проходящее через определенную точку, может быть расположено под любым углом, поэтому исследуемый участок нужно сравнить с серией «идеальных» модельных изображений, каждое из которых повернуто на некоторый угол α относительно исходного изображения в пределах 180°. Для объективизации оценки сродства полученного изображения и модельной функции М был использован коэффициент корреляции, который может принимать значения от (–)1 до 1 — чем выше идентичность двух изображений, тем большее значение имеет коэффициент корреляции. После сравнения исследуемого изображения с серией модельных функций можно получить набор коэффициентов корреляции, соответствующих различным углам α (отрицательные значения коэффициента корреляции отбрасываются). Угол α, при котором коэффициент корреляции максимальный, является наиболее вероятным углом расположения нерва в данной точке изображения. В результате для каждой точки изображения определяется вероятность присутствия нервного волокна и угол его расположения α.
Полностью изображение можно охарактеризовать, просуммировав все векторы для каждой точки, результат представляется в виде розы-диаграммы. Если на конфокальном изображении нервные волокна в основном расположены под одинаковым углом, то на розе-диаграмме лучи, идущие в этом направлении, будут существенно длиннее остальных, что делает диаграмму вытянутой, однонаправленной под одним вектором. Это свойство можно выразить в виде коэффициента анизотропии, равного отношению самого длинного луча на розе-диаграмме к самому короткому. Таким образом, коэффициент анизотропии направленности нервов в числовом виде описывает наличие общего (генерального) направления нервов на конфокальном снимке, в то время как коэффициент симметричности направленности показывает наличие дополнительных сближенных участков нервного волокна. Также проводят анализ воспалительных макрофагов (клеток Лангерганса), являющихся «профессиональными» антигенпрезентирующими клетками. Эти клетки играют ключевую роль в инициации иммунной реакции, а также индукции толерантности. Разработанный алгоритм позволяет оценить количество, длину и плотность отростков клеток Лангерганса [8] (см. рисунок) .
Основными достоинствами нового подхода к морфометрическому анализу НВР являются отсутствие зависимости от способа получения конфокального изображения нервной сети, толерантность к условиям локального освещения и прозрачности сред, а также минимальная зависимость от выбора точки получения конфокального изображения в пределах роговицы [5—7].
Офтальмологические аспекты структурной оценки нервных волокон роговицы
Основные направления исследований были направлены на оценку с помощью лазерной конфокальной микроскопии и описанного программного обеспечения состояния НВР после контактной и эксимерлазерной коррекции аметропий, факохирургии, различных роговичных операций, а также при глаукоме и увеитах.
Выявлена выраженная прямая корреляция между показателем анизотропии направленности НВР и длительностью ношения мягких контактных линз (r=0,74, p<0,005). При этом, несмотря на отмеченную тенденцию к снижению указанного показателя, существенных корреляционных связей между длиной НВР, их плотностью и длительностью ношения контактных линз обнаружено не было [9].
При проведении исследований, касающихся состояния НВР после эксимерлазерной коррекции, следует учитывать исходные изменения НВР при миопии, возможно связанные с увеличением передне-задней оси глаза [10, 11]. Отсутствие НВР в центральной зоне роговицы в первые месяцы после эксимерлазерной коррекции миопии в первую очередь обусловлено абляцией поверхностных слоев стромы роговицы. В то же время процессы реиннервации, происходящие в течение 6 мес, непосредственным образом связаны с границей формирования роговичного лоскута. Несмотря на общую восполняемость НВР в центральной зоне роговицы в результате процессов реиннервации, в сроки через 6 мес после вмешательства отмечены изменения, которые количественно характеризуются снижением коэффициента анизотропии направленности и увеличением коэффициента симметричности направленности. Полученные результаты свидетельствуют об определенной зависимости процессов реиннервации от методики формирования роговичного лоскута: в частности, после фемтолазерной методики восстановление НВР в центральной зоне роговицы происходило быстрее. Не исключено, что отсутствие полноценной иннервации в центральной зоне роговицы в течение первых 3 мес после вмешательства может быть одной из причин нарушений увлажнения глазной поверхности в раннем послеоперационном периоде. С учетом изменений количественных показателей, характеризующих состояния НВР, вопрос полноценности восстановленных в результате реиннервации нервных волокон остается открытым. Учитывая распространенность метода эксимерлазерной коррекции миопии и ожидаемую продолжительность жизни пациентов в будущем возможны объективные сложности в использовании в этих случаях НВР в качестве биомаркеров системных полинейропатий различного генеза.
После сквозной кератопластики иннервация трансплантата через 12 мес после операции была представлена единичными извитыми нервными волокнами в суббазальном слое на периферии кератотрансплантата лишь в 20,5% случаев, при этом расположение НВР имело неупорядоченный характер. Наличие НВР в центральной зоне было зарегистрировано в 33% и 58,8% случаев через 2 года и 3 года после вмешательства соответственно. На протяжении всего периода наблюдения сохранялось значительное снижение плотности и извитости нервных волокон. Существенной зависимости характера иннервации трансплантата от особенностей течения послеоперационного периода (прозрачное приживление или выраженная в той или иной степени реакция отторжения трансплантата) выявлено не было [8, 12].
Потенциальные причины изменений НВР после выполнения кросслинкинга роговичного коллагена могут быть связаны с элементом деэпителизации роговицы и воздействием ультрафиолетового излучения [13]. Непосредственно после вмешательства отдельные НВР становились четкообразными и извитыми. В сроки наблюдения до 6 мес количество основных нервных стволов и их ветвей значительно снизилось, также отмечали уменьшение длины и плотности основных НВР и их отростков. Выявленное уменьшение коэффициента анизотропии направленности в течение первых 3 мес после проведения процедуры кросслинкинга свидетельствует о патологической извитости НВР. В сроки наблюдения 6 мес и 12 мес отмечено постепенное увеличение коэффициента анизотропии направленности до исходных значений при отсутствии статистически значимых изменений коэффициента симметричности направленности НВР. Помимо этого, отмечали наличие невром, участков повреждения волокон и гибель кератоцитов на глубине 267 мкм, что соответствует значению глубины залегания демаркационной линии (260 мкм), полученному в те же сроки наблюдения с помощью оптической когерентной томографии.
В современных методиках факохирургии в качестве повреждающих НВР факторов можно рассматривать надрезы и различные виды энергетического воздействия на вещество хрусталика. Проведено сравнительное исследование состояния НВР после различных методов выбора в факохирургии: микроинвазивных вмешательств (стандартная ультразвуковая и гибридная факоэмульсификация) и экстракапсулярной экстракции катаракты [14—17]. Полученные результаты свидетельствуют о потенциальной возможности изменений НВР, независимо от методики факохирургии, при этом в сроки наблюдения до 6 мес прослеживается четкая тенденция к восстановлению различных показателей, характеризующих состояние НВР. К факторам, индуцирующим изменения НВР, следует отнести их пересечение в процессе выполнения хирургического разреза и энергетическое воздействие на роговицу в результате ультразвуковой эмульсификации ядра хрусталика. В целом изменения, происходящие в результате факохирургии можно рассматривать как транзиторное нарушение структуры НВР. В раннем послеоперационном периоде, независимо от методики факохирургии, при отсутствии изменений толщины НВР были значительно извиты, что отражали соответствующие коэффициенты, а длина и плотность основных НВР была уменьшена. Отмеченная тенденция к уменьшению коэффициента анизотропии направленности и увеличению коэффициента симметричности направленности условно сопоставима с выявленными ранее возрастными изменениями НВР [5].
После гибридной (фемтолазерной) факоэмульсификации уменьшение коэффициента анизотропии направленности через 2—2,5 мес после вмешательства оказалось статистически менее значимым по сравнению со стандартной ультразвуковой методикой, что, возможно, объясняется уменьшением энергетической нагрузки на роговицу. Наиболее выраженные изменения НВР ожидаемо отмечены после экстракапсулярной экстракции, выполнение которой сопровождается существенным увеличением протяженности роговичного разреза по сравнению с современными микроинвазивными разрезами.
Интерес к анализу состояния НВР при первичной открытоугольной глаукоме в первую очередь продиктован активно обсуждаемыми в последнее время направлениями в изучении патогенеза глаукомы — изменениями фиброзной оболочки глаза в результате так называемой глаукомной склеропатии и наличием иммунного компонента. Для характеристики НВР помимо коэффициентов анизотропии и симметричности направленности дополнительно использовали показатели длины и плотности волокон, а также наличия и структуры воспалительных макрофагов (клеток Лангерганса) [18—21]. Во всех случаях НВР были разнонаправлены, извиты, отмечены прерывистость их хода, уменьшение плотности и наличие невром. Коэффициенты анизотропии и симметричности направленности НВР зависели от стадии глаукомного процесса (соответственно p<0,05, r=0,62; p<0,05, r=0,65), выявлены положительные корреляции средней силы между показателями длины, плотности основных нервных волокон и данными периметрии (MD и PSD), показателями оптической когерентной томографии зрительного нерва (RNFL thickness). Корреляций между стадией глаукомного процесса и длиной, плотностью основных НВР, а также их отростков не выявлено. Отмечено увеличение не только количества и плотности воспалительных клеток Лангерганса, но и длины их отростков; эти изменения коррелируют со стадией глаукомы (p<0,05, r=0,63).
На фоне увеита герпесвирусной этиологии в большинстве случаев было выявлено значительное увеличение числа дендритных макрофагальных клеток Лангерганса, которое, согласно данным литературы, косвенно может свидетельствовать о наличии активного воспалительного процесса [8]. Количество и длина отростков макрофагальных клеток Лангерганса были весьма изменчивыми и зависели от активности воспалительного процесса — в среднем количество отростков варьировало от трех до шести. Появление и/или увеличение в роговице макрофагов можно расценивать как закономерное явление, исходя из известного факта активации иммунной системы при вирусной инвазии. Ход и структура НВР также были изменены: выявлены повышенная рефлективность и четкообразность, а также наличие дугообразной деформации стромальных волокон. При этом НВР были существенно извиты, контактировали друг с другом, формируя при этом фигуру, по форме приближенную к кругу. Отмеченные изменения, возможно, обусловлены нейротропностью вирусов герпеса. В связи с этим исследование периферических нервных волокон, в том числе НВР, в качестве потенциальных маркеров активности воспалительного процесса представляется перспективным направлением исследований [22—24].
Междисциплинарные аспекты структурной оценки нервных волокон роговицы
Основные направления исследований были направлены на оценку с помощью лазерной конфокальной микроскопии и описанного программного обеспечения состояния НВР при различных клинических формах системных полинейропатий.
При сахарном диабете (СД) отмечено достоверное уменьшение средних значений коэффициента анизотропии направленности НВР при менее выраженных изменениях коэффициента симметричности направленности [25—29]. Установлено, что изменения структуры НВР в виде увеличения извитости происходят уже на ранней (субклинической) стадии диабетической полинейропатии (ДПН). Степень снижения коэффициента анизотропии направленности зависела от типа СД и стадии ДПН: при субклинической и клинической полинейропатии и СД 1-го типа средние значения этого коэффициента оказались меньше, чем при СД 2-го типа. Не исключено, что низкие значения коэффициента анизотропии направленности при СД 1-го типа связаны с более выраженной потенциальной возможностью декомпенсации заболевания.
При определении уровня гликозилированного гемоглобина, основного критерия компенсации СД, выявлена предсказуемая тенденция к увеличению данного показателя при наличии клинических признаков ДПН. Отмечена достоверная корреляция уровня гликозилированного гемоглобина со значениями коэффициентов анизотропии направленности (r=0,54, p≤0,008) и симметричности направленности (r= –0,45, p≤0,03) НВР при СД 2-го типа и субклинической стадии ДПН.
Применяемый в эндокринологической и неврологической практике метод электронейромиографии (ЭНМГ), применяемый для выявления признаков полинейропатии при СД, позволяет выявить нарушение проводимости по чувствительным и двигательным нервным волокнам. Согласно полученным данным в ранних стадиях ДПН оценка НВР с помощью конфокальной микроскопии является более чувствительным методом, чем ЭНМГ [26].
При таком системном заболевании, как амилоидоз (ATTR-форма и AL-форма), изменения количественных показателей НВР (уменьшение коэффициента анизотропии и увеличение коэффициента симметричности направленности волокон) подтверждают наличие тенденции к нейропатии. Независимо от типа системного амилоидоза, какой-либо зависимости указанных изменений от стажа заболевания и тяжести нейропатических нарушений по шкале NIS не выявлено [30—33].
При обследовании пациентов, которые перенесли коронавирусную инфекцию, были выявлены изменения длины и диаметра НВР, нарушения равномерности хода, четкообразность структуры нервного волокна; в поле зрение попали микроневромы. При этом обращает на себя внимание тенденция к уменьшению значений коэффициента анизотропии направленности волокон. Нарушения структуры НВР в ряде случаев были частичными — одновременно часть нервных волокон оставались интактными. Следует отметить, что подобные изменения структуры НВР часто наблюдают при заболеваниях, сопровождающихся развитием полинейропатии. В связи с этим судить о патогномоничности данных изменений не представляется возможным [34].
На фоне болезни Паркинсона установлено достоверное снижение коэффициента анизотропии направленности НВР и увеличение коэффициента симметричности направленности НВР. При этом НВР были выраженно извиты, разнонаправлены, четкообразны, наблюдали увеличенное количество ответвлений от основных нервных стволов. В ряде случаев было выявлено присутствие клеток Лангерганса, наличие которых может сопровождать нарушения структуры НВР и являться косвенным признаком воспалительного процесса. Достоверная корреляция между длительностью заболевания, возрастом и выраженностью нарушений структуры нервного волокна по данным морфометрических коэффициентов отсутствовала, что, возможно, объясняется недостаточной выборкой пациентов и ограниченными сроками наблюдения [35—37].
Заключение
Прозрачность роговицы обеспечивает уникальную возможность прижизненной визуализации тонких немиелинизированных нервных волокон. С помощью конфокальной микроскопии в режиме реального времени, неинвазивно и на уровне, близком к морфологическому, возможно получение изображений нервных волокон для последующей оценки нарушений их хода и структуры. Современное программное обеспечение, исключающее необходимость ручной трассировки необходимых фрагментов конфокального снимка, позволяет объективизировать процесс оценки структуры нервных волокон роговицы на основе количественных показателей, характеризующих длину, плотность и извитость основных нервных стволов. Клиническое приложение структурного исследования нервных волокон роговицы возможно в двух основных направлениях, связанных, с одной стороны, с непосредственными задачами офтальмологии, а с другой — с вопросами междисциплинарного характера.
Исходя из функционального вектора иннервации роговицы и возможной причины структурных изменений нервных волокон роговицы, в офтальмологическом аспекте в первую очередь речь может идти о различных хирургических вмешательствах, потенциально влияющих на состояние роговицы, а также о хронических патологических процессах в роговице различного генеза. При этом акцент в этих исследованиях может быть сделан не только на степени изменения нервных волокон роговицы, но и на особенности процессов реиннервации роговицы. Следует отметить, что на сегодняшний день оценка состояния нервных волокон роговицы в указанных случаях носит в основном констатирующий характер, не предполагающий попыток уменьшения негативного воздействия различных факторов и стимуляции нейрорегенерации.
Перспективы междисциплинарных исследований связаны с использованием нервных волокон роговицы в качестве биомаркеров системных полинейропатий, основанным на возможности прямой визуализации и оценки структуры тонких безмиелиновых нервных волокон. Актуальным остается вопрос выявления начальных изменений тонких нервных волокон, когда первичные нарушения структуры волокон еще не сопровождаются клинической симптоматикой. Недостаточная специфичность основных признаков изменений нервных волокон роговицы (плотность, направленность, извитость и т.д.) и условная общность проявлений, независимо от патогенеза нарушений, на сегодняшний день ограничивают возможности конфокальной микроскопии роговицы в качестве метода выявления патогномоничных признаков системных полинейропатий. Тем не менее относительная простота исследования, высокий уровень визуализации тонких нервных волокон и полученные в различных исследованиях результаты позволяют рекомендовать конфокальное микроскопическое исследование нервных волокон роговицы для первичного скрининга и последующего мониторинга нейропатий в комплексе с общепринятыми подходами.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.