Идея создания искусственной роговицы или эквивалента ее отдельных слоев лежит на поверхности уже долгие годы. Это обусловлено высокой частотой заболеваний роговицы и крайне высокой потребностью в донорском материале. По недавней оценке, на одну донорскую роговицу претендуют примерно 70 пациентов [1]. За последний год ситуация значительно ухудшилась из-за пандемии COVID-19 [2]. Актуальной проблемой является и относительно малое время хранения донорского материала, и требования к его транспортировке [3]. Кроме этого, большинство лечебных учреждений не имеют в своем арсенале глазных банков и, как следствие, проведение кератопластики доступно только в крупных федеральных центрах, что существенно усложняет лечение. Исходя из этого, разработка технологий создания искусственной роговицы может обеспечить решение целого ряда проблем.

На сегодняшний день достижения в области тканевой инженерии сместили фокус внимания к решению задачи по созданию искусственной роговицы в сторону создания условий для восстановления ее определенных слоев за счет механизмов собственной клеточной регенерации [4]. Одно из направлений связано с разработкой внеклеточных матриксов на основе коллагена. Большинство подобных работ свидетельствуют о перспективности данного направления и выглядят весьма многообещающими. Однако исследований, вышедших за пределы экспериментов in vitro и продемонстрировавших возможности данного подхода в условиях in vivo, весьма мало [5], не говоря уже о тех исследователях, которые смогли провести первые фазы клинических испытаний [6].

Основной целью данного обзора является демонстрация перспективности применения нативного коллагена для разработки эквивалента роговичной ткани.

Выбор материала — один из важнейших этапов создания искусственного аналога роговичной ткани. Помимо основных требований, таких как биосовместимость, прозрачность и клеточная проницаемость, он должен максимально удовлетворять хирургической специфике, в частности, быть эластичным, обладать способностью длительно удерживать швы и, в идеале, обеспечивать возможность интраоперационного моделирования с учетом особенностей патологии роговицы. На современном этапе можно выделить три основные группы материалов: природные полимеры, синтетические полимеры и керамика [7, 8].

Общим недостатком синтетических материалов является отсутствие истинной биосовместимости и токсичность продуктов распада [9, 10]. Важно, что ни в одном живом организме нет синтетических полимеров [11]. Керамика не подходит в качестве эквивалента стромальной ткани, так как этот материал слишком хрупкий и неэластичный, имплантация изделий на ее основе в строму роговицы слишком затруднена, к тому же она не является биодеградируемым материалом.

В этом плане более перспективными являются природные полимеры. Например, хитозан — производное линейного полисахарида, макромолекулы которого состоят из случайно связанных β-(1-4)-D-глюкозаминовых звеньев и N-ацетил-D-глюкозамина [12]. Этот материал обычно получают из хитина, встречающегося в составе оболочек ракообразных, кутикулы насекомых и клеточной стенки грибов [13]. В отличие от синтетических материалов этот природный полимер растворим при pH<5,5 и не требуются жесткие условия обработки [14]. Наличие боковых катионных групп для присоединения к другим молекулам позволяет комбинировать хитозан с различными биоактивными веществами. Кроме этого, следует отметить удовлетворительную биосовместимость полимера, отсутствие иммунологического отторжения и, что очень важно, противомикробные свойства в отношении некоторых бактерий и грибов [15, 16]. Главным недостатком этого природного полимера является низкий уровень механической прочности и потенциальные воспалительные реакции [17].

Фиброин и спидроин — фибриллярные белки, составляющие основу нитей паутины и коконов насекомых, в частности шелка тутового шелкопряда. Данный белок обладает хорошей биосовместимостью, высокой степенью жесткости и прочности, возможностью биодеградации и универсальностью в обработке [18]. К тому же для данного материала не требуется дополнительная стабилизация химическими сшивками, и он обладает невысокой скоростью биодеградации [19]. При оценке возможностей применения данного материала для создания биоинженерной конструкции искусственной роговицы выявлено, что стромальные клетки лимба в таком матриксе смещали свое эпителиально-мезенхимное равновесие в сторону преобладания мезенхимного компонента, в результате чего прозрачность полученной конструкции быстро снижалась [20].

Данные белки отсутствуют в организме человека, что само по себе препятствует истинной биосовместимости. Для воспроизведения тканей роговицы необходимо создание трехмерной структуры, имитирующей внеклеточный матрикс целевых тканей и обеспечивающей первичное прикрепление клеток, адаптацию к микроокружению и последующее формирование объекта регенерации. Другими словами, дизайн будущего изделия должен быть максимально специфичным (химически и биомеханически) для типа ткани — мишени [21]. По этой причине именно коллаген является наиболее перспективным биоматериалом для создания искусственной роговицы в силу большей специфичности для ткани роговицы на фоне других природных и синтетических полимеров [22]. Коллаген I типа является основным белком внеклеточного матрикса роговицы, последняя состоит из него на 90% [4]. Молекулы этого белка образуют спиральную структуру, состоящую из трех α-цепей, и известны своей способностью к фибриллообразованию при нейтральной pH и температуре 37 °C [22, 23].

Поскольку коллаген не обладает межвидовой специфичностью среди млекопитающих, он нашел широкое применение как в биомедицинских, так и в коммерческих технологиях [24, 25]. Данный белок демонстрирует такие преимущества, как биосовместимость, способность к адгезии, волокнистая структура и хорошая сочетаемость с другими материалами. В настоящее время описано 28 типов коллагена, которые кодируются более чем 40 генами. Коллаген I типа, самый архетипичный и часто применяемый в медицине, является тримерным белком, собирающимся в тройные спирали без разрывов, объединенные в фибриллы, которые обладают наибольшей механической прочностью [22, 23, 26]. Между тем все остальные коллагены отличаются от него в одном или нескольких аспектах, например, некоторые коллагены имеют разрывы в тройной спирали и не обязательно собираются в фибриллы. Коллаген I типа широко представлен в сухожилиях, коже, связках, роговице и многих интерстициальных соединительных тканях, за исключением гиалинового хряща, мозга и стекловидного тела. В большинстве органов коллаген I типа обеспечивает биомеханические свойства, такие как жесткость, прочность на разрыв и кручение. К его достоинствам также можно отнести отсутствие токсических и канцерогенных свойств, слабую антигенность, устойчивость к тканевым ферментам, регулируемую скорость лизиса в организме, способность образовывать комплексы с биологически активными веществами и стимуляцию регенерации собственных тканей [27].

Главным недостатком данного материала является сложность в получении стерильной высокоочищенной формы белка с сохранением ее нативных свойств [28]. В связи с этим для изготовления коллагеновых трансплантатов, выступающих в роли эквивалента роговичной ткани, используют низко-концентрированные гидрогели, обладающие слабой «биомеханикой», но приемлемой прозрачностью, либо недостаточно прозрачные денатурированные формы белка в виде различных губок или пленок [29, 30]. По этой причине в настоящее время для создания роговицы на основе коллагена почти всегда применяют гидрогели, биомеханику которых повышают использованием химических кросслинкеров [31, 32]. Такой подход имеет определенные недостатки, так как влияет на иммуногенность конечного изделия и может приводить к денатурации белка [33].

Несмотря на это, следует отметить перспективность использования коллагена как основного материала для создания искусственной роговицы. Так, в ранних работах на модели сквозной кератопластики у мышей с применением трансплантата, полученного из коллагена I типа свиньи, продемонстрировано наличие выраженного локального иммунного ответа в виде избыточной продукции фибрина, депонированного в передней камере глаза на ранних сроках после операции. В отдаленные сроки основной проблемой стало формирование ретрокорнеальной мембраны на внутренней поверхности имплантата, и полное отсутствие прозрачности. Лучшие результаты продемонстрированы при использовании подобного трансплантата на модели сквозной кератопластики у карликовых свиней и модели химического ожога на глазах кролика [34]. Однако следует учесть, что возможность такой реакции может быть объяснена либо недостаточной очисткой коллагена, либо сильной химической или температурной обработкой конечного изделия [35]. Это подтверждается другими исследованиями, в которых продемонстрировано отсутствие воспалительных реакций со стороны глаза кролика при интрастромальном введении высокоочищенного коллагена, не подвергавшегося химической модификации, а также отсутствие цитотоксичности [36]. Имплантат сохранял свою прозрачность при сроках наблюдения до 6 мес. На гистологических срезах выяснена интеграция волокон коллагенового имплантата с волокнами собственной стромы роговицы и его хорошая проницаемость для клеток [37]. Кроме этого, показана возможность использования данного коллагена в лечении тяжелых ожоговых поражений роговицы на модели данной патологии у экспериментальных животных в качестве носителя для пролонгированной доставки факторов роста в ткани роговицы, что дополнительно подчеркивает перспективность данного материала.

Зарубежных работ, посвященных созданию искусственных роговиц из высокоочищенного коллагена, экстрагированного из животных, не подвергавшегося химической модификации, не так много, и данных об использовании подобной искусственной роговицы в условиях in vivo в доступной литературе мы не нашли. Несмотря на это, сходные результаты опубликованы авторами, которые в исследованиях применяли низкоконцетрированный коллаген, прошитый методом кросслинкинга [38]. Помимо этого, зарубежные исследователи опубликовали данные экспериментов in vitro, указывающих на то, что искусственные роговицы на основе коллагена являются прочными, прозрачными и поддерживают рост эпителиальных клеток роговицы в присутствии антибиотиков [39—41].

Большинство коммерчески доступных коллагенов экстрагируют из животных ресурсов [24] и очищают с использованием различных методов очистки [42, 43]. Однако существует технология получения рекомбинантного коллагена и коллагеноподобных пептидов, которая, по мнению авторов, имеет некоторые преимущества [44, 45]. Считают, что эта технология снижает аллергические реакции на коллагеновые продукты, полученные методом экстрагирования из животных [28], что может быть связано с недостаточной очисткой, а не с проблемой работы с животными коллагенами. Тем не менее сам процесс получения рекомбинантного коллагена принципиально отличается. В его основе лежит система экспрессии коллагенов клетками, генетически модифицированными для экспрессии большого количества нужного белка. Важным преимуществом является то, что рекомбинантный коллаген человека проще применять в клинике. В первом таком исследовании авторы пересадили мембрану из рекомбинантного коллагена III типа, прошитую методом кросслинкинга, 10 пациентам в рамках первой стадии клинических испытаний [46]. В результате во всех случаях наблюдали регенерацию эпителия на поверхности трансплантата вместе с субэтпителиальным ростом нервных волокон и врастанием в него стромальных клеток. Долгосрочное (24 и 48 мес) наблюдение подтвердило, что имплантаты оставались стабильными и аваскулярными у всех пациентов [6]. При сравнительном анализе коллагенов I и III типов на карликовых свиньях выбор сделан в пользу коллагена III типа [47]. Во второй фазе клинических испытаний у пациентов с поражением роговицы наблюдали хорошую эпителизацию после поверхностной трансплантации рекомбинантного коллагена, а также регенерацию собственных тканей стромы роговицы. Однако работы по полноценной кератопластике или замещению стромальной ткани практически отсутствуют. По последним клиническим данным, после кератопластики с использованием таких имплантатов имеется высокая вероятность возникновения язвенного кератита и рецидивирующих эрозий эпителия роговицы [48], что позволяет использовать искусственную роговицу, приготовленную из рекомбинантного коллагена, только в экстренных случаях, в которых необходима срочная пересадка при условии отсутствия донорского материала, и только как временную меру.

Обобщая полученные данные, можно сделать вывод о потенциальных проблемах рекомбинантного коллагена. Экспрессия этого материала происходит внутрь клетки, а это означает, что для выделения белка требуется ее разрушение и, как следствие, необходим все тот же процесс очистки коллагена от остатков клеточных структур, на недостатки которого указывали авторы [28]. По всей видимости, процесс очистки приводит к появлению так называемых коллагеноподобных пептидов вместо полноценного коллагена, не смотря на высокую схожесть с молекулой последнего, остается неясность в их способности к формированию фибриллярной структуры подобно коллагену I типа. Поэтому конечный продукт, полученный авторами, имеет жидкую форму и плохо полимеризуется. В связи с этим он малоприменим в чистом виде в качестве эквивалента роговичной ткани и подвергается химической сшивке методом кросслинкинга для придания ему механических свойств [29]. Однако такие конструкции все равно не устойчивы к шовной фиксации из-за отсутствия фибриллярной структуры, что затрудняет их реальное и масштабное клиническое применение, так как шовная фиксация до сих пор является основной в кератопластике. В качестве альтернативы предлагают фиксацию данного коллагена в ложе реципиента методом кросслинкинга [49], однако дальнейшего развития такой подход так и не получил. По всей видимости, повторное облучение может вызывать деструкцию коллагенового трансплантата, оказывать цитотоксическое действие [50—52], приводить к его денатурации и нарушению проницаемости. Кроме этого, отмечено повышение иммуногенности тканеинженерных изделий после кросслинкинга [33].

Одним из активно развивающихся направлений в тканевой инженерии является разработка чернил для 3D-биопечати тканей, в частности, роговицы. Конструирование тканей на биопринтере позволяет контролировать толщину, геометрию и структуру конечного изделия, что выглядит перспективным в силу слоистой структуры роговицы [53]. На этапе подготовки чернил для биопечати в них можно добавлять живые клеточные культуры, т. е. производить печать уже с клетками, например, кератоцитами [54]. Коллагеновые гидрогели вписываются в общую концепцию такого подхода из-за их высокой биосовместимости и низкой иммуногенности и являются наиболее популярной основой для биочернил [29]. Однако низкая иммуногенность конечного изделия может быть достигнута только в случае применения высокоочищенного коллагена без добавления потенциально иммуногенных добавок [28, 55]. Как отмечено ранее, коллаген I типа способен к организации в фибриллы при нейтральном pH и температуре 37 °C, кинетика этого процесса определяет возможности биопечати: чем быстрее фибриллообразование и полимеризация, тем структурнее и точнее конечное изделие. В большинстве существующих публикаций по коллагеновой биопечати отмечена все та же проблема, что и при обычном процессе создания тканеинженерной конструкции из коллагеновых гидрогелей — низкие биомеханические свойства [56]. В этих исследованиях в 90% случаев применяют коллагеновые растворы низкой концентрации, обычно это 5 мг/мл и крайне редко 10 мг/мл [29]. Одним из возможных решений стало выполнение биопечати в другом гидрогеле, например, в желатине [57]. Это позволяет, с одной стороны, производить печать низкоконцетрированным коллагеновым гидрогелем, а с другой — приводит к диффузии желатина в коллагеновый гидрогель, пока происходит полимеризация, что приводит к наличию желатина в конечном изделии.

В серии экспериментов по кросслинкингу биочернил выявлена малая эффективность такого подхода [58]. Другая стратегия предполагает печать изделия из высококонцентрированного коллагенового гидрогеля (80 мг/мл), содержащего фибробласты. Показана 90% выживаемость последних через 1 нед [59]. Однако in vivo исследований не проводили, в первую очередь, из-за низкой биомеханической устойчивости материала.

Другая проблема биопечати роговицы из коллагена связана с низкой прозрачностью конечного изделия. Так, в исследовании, в котором в качестве биочернил использовали коллаген с инкорпорированными кератоцитами, продемонстрирована невозможность длительно поддерживать прозрачность ткани при печати с живыми клетками [60]. Печать трансплантата с клетками существенно снижает время хранения изделия, что является лимитирующим фактором. Схожие результаты продемонстрированы и в других исследованиях с использованием коллагеновых чернил [61]. Все представленные исследования ограничены клеточными экспериментами и предполагают дальнейшее изучение in vivo. За рубежом такие работы часто классифицируют как proof conception, что по факту может быть расценено как условно возможное решение и не более.

Технология биопечати, по сути, направлена на создание или копирование определенной формы объекта, что само по себе не так актуально на фоне существующих научных вызовов со стороны создания искусственной роговицы. Большинство исследователей, работающих с коллагеновыми гидрогелями, обладают возможностью моделирования конструкции нужной формы и размеров уже на этапе изготовления, а биопечать для них не более, чем удобная или не очень альтернатива формовки будущего трансплантата. Напечатанная роговица не будет существенно отличаться от ее альтернативы из этого же материала, но при этом будет иметь ряд представленных выше недостатков.

Таким образом, несмотря на перспективность использования коллагена в качестве материала для создания искусственной роговицы, на сегодняшний день нет единого мнения о необходимых параметрах. При этом следует отметить, что достаточно часто в литературе любое изделие, полученное из соединительной ткани животных, некорректно называют коллагеном, хотя при детальном рассмотрении это не так. Процессы очистки, обработки, сшивки исходного коллагена могут приводить к безвозвратному нарушению нативной формы этого белка. Очевидной и самой сложной проблемой является получение ее высокоочищенной формы с сохранением нативных свойств, а также устойчивая «биомеханика» изделия и его прозрачность. Вопреки распространенному мнению, прозрачность роговицы может быть не связана с ориентацией коллагеновых фибрилл, а ключевой особенностью является их размер [62—64]. Это важно, поскольку позволяет считать, что изготовление прозрачной ткани из коллагена принципиально возможно.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.