Экспериментальные исследования биомеханических свойств роговицы

Роговица является частью наружной фиброзной оболочки глаза, что во многом определяет ее анатомо-функциональные особенности. Деление роговицы на слои — передний эпителий, боуменову мембрану (БМ), строму, десцеметову мембрану (ДМ) и задний эпителий (эндотелий) — имеет под собой не только топографическую, но и морфологическую основу. С позиций классических представлений о биомеханике роговицу следует рассматривать в аспекте ее защитной и оптической функций [1]. При этом, как правило, оперируют такими понятиями, как «упругость», «эластичность» и «жесткость». В совокупности эти понятия характеризуют способность биологической ткани или органа к сохранению определенной структуры и формы при том или ином воздействии.

С клинических позиций необходимость изучения биомеханических показателей роговицы и ее отдельных слоев продиктована рядом обстоятельств. Современные лазерные технологии кераторефракционной хирургии предполагают выраженное в различной степени уменьшение толщины роговицы в результате так называемой абляции, неизбежно приводящее к изменениям исходной «биомеханики» роговицы [2—11]. Возрастные и индуцированные различными факторами изменения биомеханических свойств роговицы в ряде случаев могут существенно повлиять на показатели апланационных методов тонометрии [12, 13].

Несомненный интерес представляет изучение биомеханического компонента в патогенезе различных эктатических заболеваний роговицы, а также при разработке методик селективной кератопластики [14—18].

В исследованиях «биомеханики» роговицы можно выделить два основных направления. Первое из них объединяет различные методики прижизненного (т.е. in vivo) определения биомеханических свойств роговицы, основанные на анализе изменений формы роговицы в результате какого-либо воздействия грузиками различного веса при эластонометрии или струей воздуха при двунаправленной пневмоапланации роговицы. Данное направление в основном носит прикладной характер в части решения вопросов, непосредственно связанных с диагностикой и лечением глазных заболеваний. Чаще всего подобные исследования направлены на решение задач диагностики и мониторинга глаукомы, а также изменений роговицы, индуцированных заболеваниями и хирургическими вмешательствами [19—21]. Второе направление, которое может быть обозначено как фундаментальное, базируется на экспериментальных испытаниях изолированных образцов роговицы, т.е. in vitro [22].

Цель настоящего обзора — анализ экспериментальных исследований биомеханических свойств роговицы.

Классические методы биомеханических экспериментальных испытаний базируются на индуцированном различными способами растяжении (вплоть до разрыва) и деформировании образцов. Другой, принципиально отличный, подход основан на использовании атомно-силовой микроскопии (АСМ) — методе сканирующей зондовой микроскопии с высоким разрешением, который применяют для оценки механических характеристик и морфологических особенностей биоматериалов [23—27]. В серии ранее проведенных исследований была показана информативность АСМ при оценке биомеханических показателей капсулы хрусталика [28, 29]. Для характеристики биомеханических особенностей материала используют такой показатель, как модуль Юнга (модуль продольной упругости), характеризующий свойство материала сопротивляться растяжению/сжатию при упругой деформации (т.е. жесткость) и определяемый как отношение напряжения к деформации. Модуль Юнга биоматериалов, как правило, выражают в мега- или килопаскалях (МПа и кПа соответственно). Паскаль (Па) — единица измерения давления, вызываемого силой, равной одному ньютону (Н); 1 МПа равен 1 000 000 Па, а 1 кПа — 1000 Па.

Классические подходы к изучению биомеханических свойств роговицы и ее слоев включают два распространенных метода тестирования. При испытании на растяжение образца роговицы до ее разрыва измеряют прикладываемую на образец силу в зависимости от величины растяжения [30]. При растяжении образца с помощью гидростатического давления (англ. inflation test) регистрируют степень отклонения роговицы от исходного положения в зависимости от уровня давления жидкости [31].

В сравнительном исследовании были проанализированы результаты растяжения образцов роговицы крупного рогатого скота, кролика и человека с помощью испытательной машины Instron Material Test Machine модели TM (механический привод) [30]. Растяжение выполняли с постоянной скоростью, измеряя удлинение и силу до момента разрыва образца. Образцы тестировали на основе одноосного растяжения и определяли нелинейные отношения «сила— длинение» в зависимости от толщины образца. Испытание на циклическое растяжение с постепенным увеличением силы проводили в диапазоне физиологических нагрузок на роговицу. Кроме этого, оценивали изменения размеров образцов, вызванные различными лабораторными условиями окружающей среды, в частности относительной влажностью 95 и 45%. С учетом деформации провисания образца данные «сила—удлинение» близко соответствовали значениям, характерным для коллагеновых тканей. Полученные результаты оказались схожими для роговицы кролика, человека и крупного рогатого скота. Кривые «сила—удлинение» при одноосном растяжении были однотипны: модуль упругости увеличивался при высоких нагрузках и уменьшался при низких в зависимости от цикличности, т.е. от количества последовательных растяжений образца. Для образцов бычьих и кроличьих глаз была характерна общая тенденция к более эластичному поведению от первого ко второму циклу, но эти параметры мало менялись от второго к третьему циклу. При этом образцы роговицы человека демонстрировали относительно небольшие изменения между циклами «сила—удлинение».

Одно из исследований было инициировано широким клиническим применением в конце прошлого столетия операции радиальной кератотомии для коррекции миопии. Суть операции заключалась в нанесении на роговицу глубоких (до уровня ДМ) радиальных надрезов. В эксперименте на глазах кроликов было изучено влияние радиальной кератотомии на биомеханику роговицы [32, 33]. Изолированную роговицу с 2-миллиметровым ободком склеры закрепляли в специально сконструированном устройстве таким образом, чтобы передняя поверхность роговицы была обращена в сторону заполненной изотоническим раствором натрия хлорида камеры. Механические испытания проводили с помощью устройства Instron-1122 (Англия) путем продавливания центральной части роговицы пуансоном, скорость перемещения которого составляла 5 мм/мин. В интактных образцах площадь разрыва практически соответствовала зоне давления на роговицу пуансоном, а в опытных (после радиальной кератотомии) — во всех случаях была связана с надрезами; значение разрушающего напряжения в интактных образцах в среднем оказалось выше, чем в опытных, на 25,9%.

При исследовании упругости 12 образцов изолированной ДМ человека, полученных в донорских глазах (условная норма) и после сквозной кератопластики по поводу кератоконуса, выявлено, что сила разрыва мембраны при кератоконусе оказалась существенно меньше, чем в норме: 0,87±0,1 и 2,5±0,5 МПа соответственно (средний возраст доноров 53,68±14,1 года) [34].

Метод растяжения образца с помощью гидростатического давления был впервые применен Фишером для тестирования образцов капсулы хрусталика. Суть метода заключается в закреплении образца между двумя камерами, заполненными изотоническим раствором натрия хлорида, и оценке степени деформации образца в результате разности в давлении жидкости в камерах [35].

Соотношение между модулем упругости роговицы и прикладываемым на образец давлением жидкости было изучено на образцах роговицы, полученных у доноров в возрасте от 50 до 95 лет [31]. Выявлен нелинейный характер результатов: модуль упругости зависел от уровня гидростатического давления. Отмечено увеличение значений модуля упругости, связанное как с возрастом, так и со скоростью нагрузки. Предложены уравнения для расчета модуля упругости в зависимости от давления жидкости.

При использовании метода растяжения гидростатическим давлением и лазерного датчика смещения для постоянного наблюдения за отклонением вершины роговицы выявлено, что модуль упругости роговицы меняется в зависимости от локализации ее участка — от центральной части к периферии — в пределах от 8,6 до 13,0 МПа, что может свидетельствовать о неоднородности и анизотропии роговичной ткани [36, 37].

В другом исследовании при использовании метода растяжения давлением жидкости были выделены четыре зоны роговицы человека: центральная (диаметром 3 мм), парацентральная (в 1,5 мм от центра роговицы), периферическая (в 3,5 мм от центра роговицы) и область лимба [38]. Модуль упругости был рассчитан на основе измерений расстояний между маркерами в виде капелек ртути, закрепленных на поверхности роговицы, в зависимости от того, как менялось расстояние между маркерами при растяжении давлением жидкости. Модуль упругости Юнга был вычислен для каждой области в меридиональном и поперечном направлениях. В центральной и парацентральной зонах были обнаружены более высокие показатели модуля упругости (19,5 и 19,9 МПа соответственно), по сравнению с периферической зоной (13,1 МПа) и областью лимба (15,0 МПа).

Гетерогенность и анизотропия биомеханических свойств роговицы подтверждаются измерениями модуля Юнга в различных участках и направлениях. В меридиональном направлении модуль упругости Юнга был значительно выше в парацентральной области (10,8 МПа), а эластичность в центральной зоне была значительно выше (9,37 МПа), чем аналогичные показатели на периферии и у лимба (8,92 и 7,66 МПа соответственно). В поперечном направлении модуль упругости у лимба был значительно выше (10,9 МПа), чем в центре, парацентральной зоне и на периферии (9,37; 9,21 и 8,73 МПа соответственно) [9].

При селективном исследовании роговицы кролика и человека методом растяжения давлением жидкости авторами был сделан вывод о меньшей растяжимости стромы по сравнению с ДМ независимо от видовой принадлежности [39]. В другом сравнительном исследовании были изучены биомеханические свойства ДМ коровьих, свиных, крысиных, человеческих глаз и передней капсулы хрусталика [40]. В животных образцах ДМ оказалась более жесткой, чем капсула хрусталика, а в человеческих — механические свойства данных структур оказались схожими.

В серии исследований отмечено снижение механических характеристик образцов роговицы, полученных после сквозной кератопластики по поводу кератоконуса. При использовании метода растяжения образцов с постоянной скоростью установлено снижение механической прочности роговицы при кератоконусе по сравнению с условно нормальными роговицами, полученными в донорских глазах (8,1±1,1 и 12,7±0,6 г/мм² соответственно) [41]. В аналогичном исследовании, в котором механическое напряжение определяли как отношение силы к единице площади, этот показатель при кератоконусе оказался значительно ниже (45,35±3,82 г/мм²), чем в норме (59,12±3,47 г/мм²) [42].

АСМ обеспечивает возможность морфологической и биомеханической оценки биологических тканей в жидкости с минимальной подготовкой образца (без маркировки, фиксации или покрытия). Механические свойства измеряют с помощью силовой спектроскопии (также называемой наноиндентированием). Модуль Юнга определяют на основе так называемых силовых кривых АСМ, которые отражают зависимость силы от глубины вдавливания индентора на уровне наноньютонов в исследуемый материал. Силовые кривые могут быть получены в пределах определенной площади сканирования для создания топографической карты поверхности, что особенно важно в случаях гетерогенных биомеханических свойств образца. АСМ успешно используют для определения механических свойств органических и неорганических материалов [43—48].

При селективной оценке модуля упругости различных слоев донорской роговицы человека с помощью АСМ были получены следующие результаты: передняя базальная мембрана эпителия — 7,5±4,2 кПа; БМ — 109,8±13,2 кПа; передняя строма — 33,1±6,1 кПа и ДМ — 50±17,8 кПа [49, 50]. В связи с меньшими размерами пор ДМ является более плотно организованной структурой, что может быть объяснением отмеченных различий в модуле упругости по сравнению с БМ [51]. В превалировании модуля упругости БМ по сравнению с передней стромой имеет значение ряд факторов: разница в составе коллагеновых волокон, диаметре и ориентации коллагеновых волокон, уровне протеогликанов. Беспорядочно ориентированные фибриллы меньшего диаметра в БМ приводят к более плотному расположению коллагена и, вероятно, вносят вклад в увеличение жесткости по сравнению с более ориентированным расположением крупных коллагеновых фибрилл в передней строме [52].

Следует отметить, что абсолютные значения модуля Юнга, полученные в разных исследованиях, могут существенно различаться в силу целого ряда причин: технологии приготовления образца, алгоритма АСМ (включая размер наконечника), скорости сканирования и глубины вдавливания. Так, например, в другом исследовании модуль упругости передней стромы донорской роговицы оказался на несколько порядков меньше, чем в приведенной выше работе, и колебался в диапазоне от 1,14 до 2,63 МПа [53]. В данном случае возможной причиной различий явилось использование конического наконечника для индентирования с радиусом кривизны, значительно меньшим, чем средней диаметр коллагенового волокна (10 против 30 нм), уменьшение скорости сканирования (2 против 3—95 мкм/с) и нагрузки (1 нН против 0,25—2,5 мкН).

В другой работе перед проведением АСМ образцы роговицы человека помещали в 20% раствор декстрана для восстановления толщины роговицы до физиологического уровня (400—600 мкм). Модуль Юнга передней стромы (в среднем 281±214 кПа; диапазон 59—764 кПа) был значительно выше, чем модуль упругости задней стромы (в среднем 89,5±46,1 кПа; диапазон 29—179 кПа) [54].

В серии сравнительных исследований в качестве экспериментальной модели для АСМ использовали роговицу кролика. Получены следующие средние значения модуля упругости для различных слоев роговицы: эпителий — 0,57±0,29 кПа; БМ — 4,5±1,2 кПа; передняя строма — 1,1±0,6 кПа; задняя строма — 0,38±0,22 кПа; ДМ — 11,7±7,4 кПа; эндотелий — 4,1±1,7 кПа. В целом полученные для каждого слоя роговицы кролика данные оказались значительно меньше, чем аналогичные показатели роговицы человека [55].

Оценку потенциального влияния красителей, применяемых при эндотелиальной кератопластике (трипановый синий — ТС и Membrana Blue — МВ), на биомеханические свойства ДМ и жизнеспособность эндотелиальных клеток роговицы донорских глаз человека исследовали с помощью АСМ в два временных промежутка (через 1 и 4 мин после воздействия). Значительных различий в токсичности между красителями отмечено не было. Исходные средние значения базового модуля упругости ДМ составили от 2798,5 до 3439,7 Па. Воздействие ТС и МВ привело к увеличению жесткости ДМ через 1 мин на 11,2 и 17,7% и через 4 мин на 8,6 и 13,6% соответственно [56].

Капсула хрусталика и ДМ являются структурами, функции которых базируются в том числе на определенном уровне эластичности и биомеханической устойчивости. Очевидно, этим обстоятельством продиктовано сравнительное изучение зависимости биомеханических свойств ДМ и передней капсулы хрусталика человека от белкового состава этих структур с помощью хромато-масс-спектрометрии (LC-MS/MS) с последующим вычислением модуля упругости на основе АСМ. При подборе материала учитывали возраст, пол, наличие сопутствующего сахарного диабета и причину смерти донора. Использовали известную методику подготовки: образцы инкубировали в 2% растворе Triton при комнатной температуре в течение 8—10 ч, а затем добавляли деоксихолат до 1% концентрации с целью удаления эндотелиальных и эпителиальных клеток с ДМ и внутренней поверхности капсулы хрусталика соответственно [57]. Выделенные мембраны под оптическим микроскопом выглядели как прозрачные листки, которые были свернуты определенным инвертированным образом, как это было показано в ранее проведенных исследованиях [58—61]. Внешняя сторона свернутых образцов соответствовала внутренней поверхности ДМ и передней капсулы хрусталика. Выявлено, что внутренние поверхности ДМ и капсулы хрусталика (в нативном состоянии, покрытые эндотелием и эпителием соответственно) оказались более жесткими, чем наружные (обращенные к строме роговицы и влаге передней камеры соответственно). Модуль Юнга для внутренней/наружной поверхности ДМ и передней капсулы хрусталика составил 644,2±171,6/221,8±92,7 и 217,0±106,8/32,9±12,0 кПа соответственно. Таким образом, в целом ДМ оказалась жестче капсулы хрусталика вследствие большего содержания коллагена IV типа, который, как известно, обеспечивает механическую жесткость ткани [61—63]. С позиций функциональной направленности более высокая жесткость ДМ объяснима, поскольку роговица, являясь частью фиброзной оболочки глаза, выполняет защитную функцию и должна сохранять механическую устойчивость при воздействии как извне, так и изнутри. В то же время механизм аккомодации основан на определенной эластичности капсулы хрусталика, позволяющей последнему изменять форму. Каких-либо достоверных отличий жесткости ДМ и капсулы хрусталика в зависимости от наличия или отсутствия сахарного диабета выявлено не было.

В серии исследований на основе АСМ изучены биомеханические изменения роговицы при кератоконусе в результате кросслинкинга, предполагающего воздействие ультрафиолетового излучения на деэпителизированную роговицу после инстилляций раствора рибофлавина.

В эксперименте на 16 изолированных свиных глазах (по 8 в основной и контрольной группах) были проанализированы изменения эластичности поверхностных слоев роговицы [64]. Выявлено статистически значимое увеличение среднего показателя модуля Юнга (т.е. снижение эластичности и повышение жесткости) в зоне кросслинкинга по сравнению с контрольными образцами и задними интактными слоями роговицы. В другой работе в качестве материала использовали 7 донорских роговиц человека, полученных из глазного банка: 5 образцов исследовали после стандартного кросслинкинга (рибофлавин + ультрафиолетовое излучение), а 2 — после так называемого химического кросслинкинга с применением 2,5% раствора глутаральдегида [65]. Химический метод был использован в качестве контрольного, как обеспечивающий, по мнению авторов, связи белков in vitro. Увеличение модуля Юнга было значимо более выражено при химическом кросслинкинге по сравнению со стандартным (в 2,6—3,5 и 1,5—2 раза соответственно), снижение гистерезиса было в несколько выше при химической методике по сравнению со стандартной (в 1,1—1,5 и 0,9—1,5 раза соответственно).

В другом исследовании были изучены биомеханические свойства 40 свиных роговиц, которые были разделены на четыре равнозначные группы: контрольную и три основные, в которых использовали различные методы кросслинкинга: ультрафиолетовое облучение мощностью 3 мВт/см² и экспозиции 30 мин; ультрафиолетовое облучение мощностью 30 мВт/см² и экспозиции 3 мин и погружение поверхности роговицы в 1% раствор генипина на 4 ч [66]. Выраженные в различной степени увеличение эластичности и снижение вязкости имели место после всех апробированных методов только в поверхностных, толщиной около 200 мкм, слоях стромы. При анализе проведенных исследований авторами сделан вывод о том, что индуцированные кросслинкингом биомеханические изменения роговицы ограничены только передней стромой роговицы и не распространяются на более глубокие слои [67].

Внедрение в клиническую практику метода двунаправленной пневмоапланации роговицы, позволяющего прижизненно определять ряд биомеханических показателей, не исключает актуальности дальнейшего совершенствования экспериментальных тестов. Следует отметить, что при применении клинического метода анатомическая целостность фиброзной оболочки в определенной степени затрудняет изолированную оценку «биомеханики» роговицы, не говоря уже о возможности анализа состояния ее отдельных слоев. Дифференцированные подходы к оценке «биомеханики» различных слоев роговицы в первую очередь необходимы в аспекте современных тенденций развития кератопластики, базирующихся на принципе селективной замены пораженных слоев роговицы. Во многих модификациях селективной кератопластики базисными элементами являются выделение, сохранение и манипуляции с ДМ, толщина которой не превышает 10 мкм. При этом «успешность» этих технологических элементов во многом зависит от биомеханической устойчивости мембраны. Кроме этого, интерес к изучению «биомеханики» ДМ может быть связан с эктатическими и дистрофическими заболеваниями роговицы, а также особенностью «поведения» этой структуры при нозологической форме, которую обозначают как десцеметоцеле.

При проведении экспериментальных исследований «биомеханики» биологических тканей и структур необходимо решение двух основных задач: выбор объекта исследований и методики испытаний. В качестве объекта исследования могут быть использованы образцы биоматериала экспериментальных животных и человека. В последнем случае — полученные в условиях ex vivo или in vivo, т.е. в процессе какого-либо оперативного вмешательства.

Селективная оценка отдельных структур роговицы (например, пограничных мембран) с помощью классических механических тестов в известной степени лимитирована из-за достаточно малой толщины этих структур и, как следствие, сложностей фиксации образца. В реальной практике перспективным остается использование более адаптированной для проведения подобных исследований АСМ, с одной стороны, исключающей необходимость механического захвата и удержания образца, а с другой — обеспечивающей возможность исследования его различных участков и поверхностей.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.