Заболевания, вызванные нарушением работы и атрофическими изменениями ретинального пигментного эпителия (РПЭ), включая возрастную макулярную дегенерацию (ВМД) и некоторые формы дистрофий сетчатки, приводят к потере зрения, функциональным нарушениям, физическим и психологическим трудностям пациентов.

Несмотря на значительный прогресс в понимании патогенеза ВМД, лечение данного заболевания все еще остается актуальной проблемой. Перспективной стратегией предотвращения полной потери зрения при заболеваниях, связанных с дегенерацией РПЭ, является применение регенеративных клеточных технологий, которые активно разрабатываются с целью дальнейшего применения в терапии дегенеративных заболеваний сетчатки. Разработка в 2006 г. K. Takahashi и S. Yamanaka метода получения индуцированных стволовых клеток (ИПСК) путем репрограммирования транскрипционными факторами, доставляемыми в клетку вирусными векторами [1], открыла новые возможности в регенеративной клеточной терапии. По своим морфофункциональным характеристикам ИПСК эквивалентны эмбриональным стволовым клеткам (ЭСК) [2, 3] и при этом не вызывают этических вопросов. Полученные с использованием данного подхода клеточные линии продемонстрировали способность к неограниченному росту и самообновлению, а также к дифференцировке в клетки любых типов, в том числе в клетки РПЭ [4, 5]. В последние годы были опубликованы результаты ряда экспериментальных исследований на животных, проиллюстрировавшие безопасность и эффективность трансплантации клеток РПЭ, дифференцированных из ИПСК (ИПСК-РПЭ). При этом трансплантация ИПСК-РПЭ может осуществляться в суспензионной форме либо в виде предварительно сформированного монослоя на субстрате. Каждый способ имеет свои преимущества и недостатки, и до сих пор активно ведутся работы по их сравнению с точки зрения выживаемости клеток, анатомической и функциональной интеграции [6—12].

Тем не менее, несмотря на немалое количество доклинических исследований, не существует оптимального хирургического способа доставки ИПСК-РПЭ в субретинальное пространство, способствующего их последующей правильной интеграции и приживлению с минимальным риском осложнений.

Цель исследования — разработать и оценить результаты модифицированной хирургической техники трансплантации ИПСК-РПЭ в виде клеточной суспензии в субретинальное пространство кроликов с предварительно созданной атрофией РПЭ.

Материал и методы

В исследование были включены 10 кроликов (20 глаз) породы новозеландский альбинос в возрасте 2,5—3,0 мес и массой 2,0—2,5 кг. Работа выполнена с соблюдением международных принципов Хельсинкской декларации о гуманном отношении к животным, принципов гуманности, изложенных в директиве Европейского Сообщества (86/609/EC), «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных».

Для получения функциональных клеток РПЭ человека была произведена направленная дифференцировка из ИПСК человека, ранее полученных из фибробластов здорового донора в лаборатории клеточной биологии ФГБУ «ФНКЦ физико-химической медицины» ФМБА России и хранящихся в клеточном банке лаборатории. ИПСК культивировались на матригеле («BD Biosciences», США) в культуральных чашках. По достижении 100% монослоя среда менялась на дифференцировочную, содержащую ДМЕМ/F12 (НПП «ПанЭко», Россия), 5% заменителя сыворотки («Invitrogene», США), 2 мМ глутамина, 1% заменимых аминокислот, пенициллин/стрептомицин (50 ед/мл; 50 мкг/мл), N2 и B27 (все — НПП «ПанЭко», Россия), 50 нг/мл Noggin и 20 нг/мл bFGF (оба — «Invitrogen», США). После двух пассажей клетки пересевали на покрытую матригелем чашку и культивировали в среде альфа-МЕМ (НПП «ПанЭко», Россия), содержащей 20% заменителя сыворотки («Invitrogen», США), 2 мМ глутамина, пенициллин/стрептомицин (50 ед/мл; 50 мкг/мл; оба — НПП «ПанЭко», Россия), 10 нг/мл IGF1, 10 нг/мл EGF, 10 нг/мл Dkk1, B27, 100 нг/мл таурина (все — «Invitrogen», США), 1 мМ никотинамида, 10 мкМ хетомина (оба — «Sigma», США). Через 3—4 нед формировались пигментированные кластеры, которые вручную отделялись с помощью 0,05% трипсина в ЭДТА («Gibco», США) от остального клеточного материала и в дальнейшем культивировались в среде ДМЕМ/F12 (НПП «ПанЭко», Россия), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS; «Gibco», США), 2 мМ глутамина, пенициллин/стрептомицин (50 ед/мл; 50 мкг/мл), заменимые аминокислоты (все — НПП «ПанЭко», Россия).

Морфофизиологическая характеристика полученного РПЭ была осуществлена путем исследования профиля экспрессии специфических маркеров РПЭ с использованием полимеразной цепной реакции, сопряженной с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), и иммуноцитохимии (ИЦХ). Изучение физиологических характеристик проводилось путем измерения трансэпителиального сопротивления прибором Milicell ERS-2 («Millipore», США), секреции васкулоэндотелиального фактора роста (vascular endothelial growth factor, VEGF) и фагоцитоза флюоресцентно меченных полистиреновых шариков («Invitrogene», США).

С целью получения клеточного материала для трансплантации в виде суспензии культивируемые клетки промывались раствором Хэнкса (НПП «ПанЭко», Россия), инкубировались в течение 5 мин при 37 °C в 0,25% трипсине («Gibco», США). Трипсин инактивировался средой ДМЕМ (НПП «ПанЭко», Россия), содержащей 10% FBS («Gibco», США). Клетки подсчитывались с использованием красителя трипанового синего (НПП «ПанЭко», Россия) на автоматическом счетчике клеток LUNA-II («Logos Biosystems», США). Полученная суспензия центрифугировалась, супернатант отбирался, клетки ресуспендировались PBS (НПП «ПанЭко», Россия) до требуемой концентрации [13]. При проведении процедуры введения клеточной суспензии ИПСК-РПЭ была использована концентрация в 50 000 клеток/глаз.

До оперативного вмешательства подготавливали аутологичную плазму, обогащенную тромбоцитами (Platelet-rich plasma, PRP), которую получали следующим образом: забирали из центральной ушной артерии кролика кровь в объеме 2—5 мл в специализированную пробирку без антикоагулянта, пробирку устанавливали в центрифугу и осуществляли центрифугирование при 4000 об/мин в течение 3 мин. После этого из пробирки микропипеткой проводили забор плазмы (надосадочной жидкости) и переносили в другую стерильную пробирку. Проводили повторное центрифугирование в режиме 3000 об/мин в течение 2 мин и собирали ²/₃ плазмы сверху стерильной микропипеткой. Подготавливали стерильный шприц, вынимали поршень. Микропипеткой вводили все содержимое в шприц и присоединяли к нему поршень для дальнейшего введения.

Чтобы обеспечить точную дозировку лекарств, до операции всех кроликов взвешивали. За 1 мес до трансплантации ИПСК-РПЭ всем кроликам на правом глазу индуцировали атрофию РПЭ и сетчатки по созданной нами методике [14]. Предоперационная подготовка животных включала внутримышечное введение золетила 50 (0,3 мл) и ксилазина 2% (0,55 мл), также до операции внутримышечно вводили 0,4% раствор дексаметазона (0,3 мл) и дицинон (0,5 мл). Мидриаз достигался закапыванием тропикамида с фенилэфрином. Перед операцией местно закапывали моксифлоксацин 0,5% и алкаин 0,5%. Подстригали ресницы ножницами, чтобы уменьшить риск послеоперационных инфекционных осложнений. Накрывали оперируемый глаз стерильной тканью с прорезанным посередине отверстием. Предварительно были выделены глазные мышцы. В проекции плоской части цилиарного тела выполнены склеротомии с установкой портов 23 Ga соответственно 2, 10 и 5 ч. На 5 ч устанавливали ирригационную канюлю. Суспензию клеток вводили объемом 0,05 мл в количестве 50 000 клеток при помощи шприца, соединенного с удлинительной трубкой (управляемой ассистентом) и канюлей 41G DORK (управляемой хирургом), предварительно срезанной под углом 45°. Канюлю вводили через верхневисочный порт в субретинальное пространство на расстоянии 1—1,5 мм книзу от диска зрительного нерва. После правильного позиционирования кончика, который визуализировался по побледнению сетчатки, суспензию с клетками вводили субретинально соответственно зоне атрофии до образования пузыря, который хорошо визуализировался хирургом с помощью операционного микроскопа. После обмена BSS на воздух и подсушивания поверхности сетчатки на зону введения суспензии наносили 2—3 капли PRP для герметизации дефекта и предупреждения рефлюкса клеток в витреальную полость. После указанных манипуляций проводили воздушную тампонаду. После хирургического вмешательства всем кроликам субконъюнктивально вводили раствор гентамицина 3 мг/кг и дексаметазона 3 мг/кг. В последующие 7 дней в конъюнктивальную полость закапывали 0,1% раствор дексаметазона 3 раза в день. Кроликов укладывали головой вниз и держали в таком положении в течение 1 ч. За день до оперативного вмешательства и в последующие дни кролики получали Сандиммун неорал (раствор для приема внутрь) 100 мг/мл (из расчета 10 мг/кг массы тела).

Всем кроликам до оперативного вмешательства и на 2, 14, 30-й дни после него проводились спектральная оптическая когерентная томография (СОКТ) и исследование аутофлюоресценции с помощью прибора Heidelberg Spectralis SD-OCT («Heidelberg Engineering», Германия). Животных выводили из эксперимента методом воздушной эмболии после введения кролика в наркоз (согласно приказу Минвуза СССР №724 от 13.11.1984).

Гистологические исследования энуклеированных глаз животных выполняли через 15 (по 5 кроликов из каждой группы) и 30 (по 5 кроликов из каждой группы) дней после моделирования атрофии РПЭ. Энуклеированные глазные яблоки фиксировали в нейтральном 10% растворе формалина в течение 1 сут. Фиксированные глазные яблоки разрезали на три колодки таким образом, чтобы зона индуцированной атрофии оказывалась в центральной колодке. После стандартной гистологической проводки центральные колодки заливали в парафин. Из парафиновых блоков готовили серийные срезы, которые окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной методике. Обзорное микроскопическое исследование проводили с использованием микроскопа Leica Axiostar 2 plus, оборудованного цифровой фотокамерой, при увеличении 200—400.

Часть срезов с каждого срока депарафинизировали в ксилоле с последующей регидратацией в серии спиртов понижающейся концентрации. После депарафинизации срезы хранили до процедуры иммуногистохимического окрашивания в PBS (НПП «ПанЭко», Россия). Срезы на стеклах пермеабилизовали 0,1% Triton X-100 («BioRad», США) в PBS в течение 5 мин, промывали 3 раза по 5 мин PBS + 0,1% Tween 20 («AppliChem», Германия), блокировали 5% FBS, 5% сыворотки козы в PBS с 0,1% Tween 20. Инкубировали ночь с первичными антителами Anti-Nuclei Antibody (Millipore, MAB1281) при +4 °C. После инкубирования с первичными антителами срезы промывали три раза по 5 мин PBS + 0,1% Tween 20 и инкубировали 2 ч при комнатной температуре с вторичными антителами, конъюгированными с флюоресцентным красителем Alexa Fluor-555 (goat-antimouse, 1:1000, Invitrogen, A21422). Для окраски эукариотических ядер использовался краситель DAPI, с которым срезы инкубировались в темноте при комнатной температуре в течение 10 мин. После всех процедур срезы промывались в PBS. Иммунофлюоресцентные изображения были получены с помощью инвертированного флюоресцентного микроскопа OLYMPUS IX53.

Результаты

В результате направленной дифференцировки из ИПСК было получено 10 линий, морфологически схожих с нативным РПЭ. Для определения наиболее морфофункционально сходных с нативным РПЭ было осуществлено исследование способности к образованию и накоплению пигмента, экспрессии специфических маркеров РПЭ методом ПЦР и ИЦХ. Изучение физиологических характеристик проводилось путем измерения трансэпителиального сопротивления, секреции VEGF и фагоцитоза (рис. 1).

Рис. 1. Морфофункциональная характеристика ИПСК-производных линий РПЭ.

а — ОТ-ПЦР анализ экспрессии основных генов — маркеров РПЭ, референсный ген — GAPDH; б — иммунофлюоресцентные фотографии результатов ИЦХ при исследовании экспрессии RPE65, MITF, BEST1; в — иммунофлюоресцентная фотография фагоцитоза ИПСК-РПЭ флюоресцентно меченных полистиреновых шариков; г — секреция VEGF в апикальном и базальном направлениях при культивировании ИПСК-РПЭ на культуральных вставках (трансвеллах); д — фотография ИПСК-РПЭ в проходящем свете при культивировании на покрытой матригелем культуральной чашке через 1 и 3 мес культивирования; е — динамика изменения трансэпителиального сопротивления ИПСК-РПЭ при культивировании на культуральных вставках (трансвеллах).

Из полученных линий одна показала наибольшую схожесть с нативным РПЭ по скорости накопления пигмента (см. рис. 1, д), экспрессии генов-маркеров Tyr, OTX2, MITF (меланогенез), RPE65, CRALBP (зрительный цикл), PEDF (анти-неоваскуляризация), BEST1 (бикарбонатный транспорт в сетчатке; см. рис. 1, а). Результаты ИЦХ показали наличие в клетках белков-маркеров RPE65, MITF, BEST1, ZO-1 (белок плотных контактов; см. рис. 1, б). Клетки выбранной линии оказались способны к фагоцитозу флюоресцентно меченных полистиреновых шариков (см. рис. 1, в) и преимущественно в базальном направлении секретировали VEGF (васкуляризация). Кроме того, при определении динамики изменения трансэпителиального сопротивления линия показала высокую способность к образованию плотного монослоя на культуральных вставках-трансвеллах (см. рис. 1, е).

Таким образом, было подтверждено, что полученные клеточные линии обладают морфофизиологическими характеристиками РПЭ и в дальнейшем могут быть использованы для трансплантации животным как в виде суспензии, так и на различных искусственных мембранах.

На оперируемых глазах до оперативного вмешательства с целью визуализации зоны предварительно созданной атрофии была проведена СОКТ (рис. 2). На 2-е сутки после оперативного вмешательства на снимках визуализировались зона атрофии РПЭ, приводящая к повышенному проникновению лазерного луча в подлежащие ткани, и гиперрефлективная зона, соответствующая ИПСК-РПЭ с прилежащей к ней сетчаткой.

Рис. 2. Спектральная оптическая когерентная томограмма.

Визуализируются зона атрофии РПЭ, приводящая к повышенному проникновению лазерного луча в подлежащие ткани, гиперрефлективная зона, соответствующая ИПСК-РПЭ с прилежащей к ней сетчаткой.

На 14-е и 30-е сутки после оперативного вмешательства определялась гиперрефлективная зона, соответствующая ИПСК-РПЭ, плотно прилегающая к сосудистой оболочке и структурам нейросенсорной сетчатки. При проведении аутофлюоресенции глазного дна определялась зона гиперфлюоресценции, соответствующая локализации ИПСК-РПЭ, вокруг нее — ободок крапчатой гипофлюоресценции, соответствующий атрофии РПЭ (рис. 3, 4).

Рис. 3. Спектральная оптическая когерентная томограмма, 30-е сутки после хирургического вмешательства.

Объяснение в тексте.

Рис. 4. Анализ аутофлюоресценции глазного дна, 30-е сутки после хирургического вмешательства.

Объяснение в тексте.

Спустя 1 мес животных выводили из эксперимента методом воздушной эмболии после введения кролика в наркоз (согласно приказу Минвуза СССР №724 от 13.11.1984).

По результатам гистологического исследования, на 15-й и 30-й дни после оперативного вмешательства в глазах после введения ИПСК-РПЭ перифокально области их введения на мембране Бруха обнаружено формирование устойчивого монослоя однорядных клеток с крупными гиперхромными ядрами, морфологически соответствующими клеткам РПЭ. Структура выявленного слоя эпителиальных клеток была наиболее выражена в области имплантации и постепенно нарушалась по мере удаления от нее по направлению к экватору (рис. 5, 6).

Рис. 5. Гистологический микропрепарат глаза кролика на 15-е сутки после введения клеток РПЭ.

Появление устойчивого монослоя дифференцированных клеток РПЭ на мембране Бруха (красные стрелки). Вверху — остатки наружных сегментов фоторецепторов. Обращают на себя внимание артифициальная отслойка сетчатки и частичная отслойка хориоидеи вследствие примененной методики формалиновой фиксации. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 200.

Рис. 6. Гистологический микропрепарат глаза кролика на 30-е сутки после введения клеток РПЭ.

Монослой клеток РПЭ на мембране Бруха (красные стрелки). Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 1000.

По результатам ИЦХ с использованием флюоресцентно меченных антител, на 15-й и 30-й дни после оперативного вмешательства в глазах после введения ИПСК-РПЭ был обнаружен иммунофенотип, соответствующий интеграции суспензии клеток РПЭ, дифференцированных из ИПСК человека, в сетчатку глаза модельного животного (рис. 7, 8).

Рис. 7. Изображение, полученное при ИЦХ глаза кролика на 15-е сутки.

Здесь и на рис. 8: иммуногистохимическое окрашивание среза глаза кролика. Краситель ядер эукариот — DAPI, синий канал; антитела к ядрам человека, красный канал.

Рис. 8. Изображение, полученное при ИЦХ глаза кролика на 30-й день.

На данную методику получен патент [15].

Обсуждение

Несмотря на большое количество доклинических исследований по пересадке ИПСК-РПЭ и ЭСК-РПЭ, не существует оптимального хирургического способа доставки стволовых клеток в субретинальное пространство, обеспечивающего их последующее приживление [5—7, 16, 17].

В качестве ближайшего аналога для модификации мы выбрали предложенную S. Petrus-Reurer и соавторами методику, заключающуюся в субретинальном введении ЭСК-РПЭ в суспензионной форме. В ходе проведенных дальнейших исследований было обнаружено, что стволовые клетки РПЭ не интегрировались должным образом в связи с рефлюксом во время инъекции и недостаточной адгезией клеток РПЭ [8].

В нашем исследовании трансплантировали в субретинальное пространство кроликов с предварительно созданной атрофией РПЭ ИПСК-РПЭ в виде клеточной суспензии, правильная интеграция которых подтверждается методами СОКТ, исследования аутофлюоресценции, гистологическими и иммуногистохимическими данными. При проведении процедуры введения клеточной суспензии ИПСК-РПЭ была использована концентрация в 50 000 клеток/глаз, что позволяет экономно расходовать клеточный материал и достигать необходимого результата. В работе B. Lu и соавт. [18] было показано, что наибольшая выживаемость трансплантируемых клеток РПЭ в виде суспензии достигается именно при такой концентрации клеточного материала. После введения суспензии ИПСК-РПЭ в субретинальное пространство для герметизации ретинотомического дефекта и предупреждения рефлюкса стволовых клеток в витреальную полость на зону введения суспензии наносили 2—3 капли PRP, подготовленной до оперативного вмешательства. Полученная PRP биосовместима и является совершенно безопасной как с точки зрения трансмиссивных инвазий, так и в отношении канцерогенности, при этом она способствует регенерации эпителия при повреждениях различного генеза [19, 20]. Таким образом, использование PRP способствует герметизации дефекта и предупреждает рефлюкс стволовых клеток в витреальную полость, тем самым минимизируя риск развития интра- и послеоперационных осложнений.

При динамическом контроле за животными после оперативного вмешательства с использованием СОКТ можно увидеть, что трансплантируемые ИПСК-РПЭ правильно интегрированы и плотно прилегают к сосудистой оболочке и структурам нейросенсорной сетчатки. При морфологическом исследовании обнаружено появление устойчивого монослоя клеток РПЭ на мембране Бруха. По результатам ИЦХ с использованием флюоресцентно меченных антител был обнаружен иммунофенотип, соответствующий интеграции суспензии клеток РПЭ, дифференцированных из ИПСК человека в сетчатку глаза модельного животного, и подтверждена их жизнеспособность.

Заключение

Нами разработана модификация хирургической техники трансплантации ИПСК-РПЭ. Установлено, что использование PRP способствует герметизации дефекта и предупреждает рефлюкс трансплантируемых клеток в витреальную полость, тем самым минимизируя риск развития интра- и послеоперационных осложнений.

Выполнена трансплантация ИПСК-РПЭ в виде клеточной суспензии в субретинальное пространство кроликов с предварительно созданной атрофией РПЭ. Морфологическое исследование in vivo и изучение гистологических срезов показали, что трансплантированные ИПСК-РПЭ правильно интегрированы и адгезированы к сосудистой оболочке в зоне оперативного вмешательства.

По результатам ИЦХ с использованием флюоресцентно меченных антител была подтверждена жизнеспособность интегрированных ИПСК-РПЭ в сетчатку глаза модельного животного.

Дифференцировка и культивирование ИПСК-РПЭ были осуществлены в рамках проекта, поддержанного грантом Российского научного фонда (№19-15-00425).

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Н.Н., В.Н., А.М., Л.К., А.Е.

Сбор материала: О.Л., А.К., А.Х., П.И., А.М., М.Л.

Статистическая обработка: А.К., А.Е., М.Л.

Написание текста: А.К., М.Р., О.Л.

Редактирование: О.Л.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.