Современные возможности исследования состава секрета мейбомиевых желез

Мейбомиевые железы (МЖ) являются основным источником различных липидов, участвующих в формировании липидного слоя слезной пленки, который обеспечивает сохранение гомеостаза глазной поверхности. Этот процесс находится в прямой зависимости от химического состава и толщины липидного слоя слезной пленки. Нарушение функции МЖ приводит к истончению слезной пленки и является одной из причин возникновения ряда воспалительных заболеваний глаз [1].

Секрет МЖ, или мейбум, — это богатый липидами секрет, который вырабатывается полностью дифференцированными мейбоцитами в голокринных МЖ человека.

Липиды относят к амфифильным органическим молекулам, плохо растворимым в воде, но смешивающимся с органическими растворителями. Классификация и изучение видов липидов являются сложной задачей из-за их большого химического и структурного разнообразия: различной длины углеводородных цепей, разветвлений, разной степени насыщенности и наличия различного числа функциональных групп. Текущая классификация липидов LIPIDMAPS включает восемь категорий, основанных на химических функциональных возможностях: 1) глицеролипиды (GL); 2) сфинголипиды (SP); 3) глицерофосфолипиды (GP); 4) стеролипиды (ST); 5) жирные ацилы (FA); 6) пренол-липиды (PR); 7) поликетиды (PK) и 8) сахаролипиды (SL), причем последние две категории не синтезируются в организме млекопитающих и представляют собой небольшую часть липидома.

Липидом — это особый состав липидов, характеризующий каждую клетку, ткань и биологическую систему. Липидомы — смеси липидов с различными химическими структурами, которые представляют различные биологические микроокружения, где липиды обычно выполняют свою функцию in vivo. На состав липидома оказывают влияние изменения физиологических, патологических и экологических условий [2]. В последнее время возросло число научных исследований, в которых авторы делают попытки определения нормального состава мейбума, липидома и их возможных отклонений при различных заболеваниях. В настоящее время идентифицировано более 600 мейбомиевых липидов [3].

Липидный состав мейбума отличается от любого другого липидного пула в организме человека. Основные особенности, которые делают мейбум уникальным, — это соотношение выявленных классов липидов, предельная длина его компонентов, обширное ω-гидроксилирование жирных кислот и спиртов, изо- и антеизоразветвление мейбомиевых липидов (например, восков) и присутствие сложных липидов с несколькими сложноэфирными связями.

Мейбум в основном состоит из нейтральных липидов: сложных эфиров воска (WE) и холестерина (CE), свободного холестерина (Chl), диэфиров и триацилглицеринов (TAG), в меньшем количестве — свободных жирных кислот (FFA) и ω-гидроксижирных кислот (OAHFA), фосфолипидов (PL), сфингомиелинов (SM), керамидов (Cer) и др.

Большинство мейбомиевых липидов имеют в составе одну или несколько сложноэфирных связей.

В то время как общее доминирование WE и CE, а также низкое содержание сквалена в здоровом мейбуме никогда не подвергались сомнению, наличие и природа амфифильных (часто называемых «полярными») липидов обсуждались на протяжении десятилетий. Первоначально предполагалось, что общее количество полярных липидов может составлять до 16% от общего объема мейбума [4]. В более ранних исследованиях полярные липиды были идентифицированы только как PL и/или SM [5, 6]. В более поздних экспериментах было показано, что в нормальном человеческом мейбуме PL и SM содержатся в незначительных количествах. S. Lam и соавт. [7] в 2014 г. сообщили о наличии нового (для человеческого мейбума) тамфифильного вида липидов — холестерилсульфата.

Одновременно были обнаружены другие классы амфифильных липидов — OAHFA [8].

Несколько независимых отчетов подтвердили эти наблюдения. Так, в 2011 г. S. Lam и соавт. [9] установили, что в азиатской популяции OAHFA составляют приблизительно 3% от общего объема нормального человеческого мейбума. Одной из предполагаемых физиологических ролей OAHFA является формирование межфазного слоя, стабилизирующего слезную пленку.

Исследование, проведенное в 2014 г. [10], продемонстрировало уменьшение количества OAHFA в слезной пленке у пациентов с сухостью глаз, что способствует ее дестабилизации.

Одной из определяющих характеристик всех основных классов сложных мейбомиевых липидов (WE, CE, OAHFA) является крайняя длина основной углеродной цепи, доходящая до 36 углеродных остатков. Кроме того, были выделены свободные жирные кислоты с очень длинной и экстремально длинной цепочкой [11, 12].

В последние годы появились публикации о содержании в составе мейбума помимо липидных компонентов различных протеинов. Измененный белково-липидный состав слезной пленки может стать триггерным фактором в развитии дисфункции мейбомиевых желез (ДМЖ) [13]. В секрете МЖ пациентов с синдромом сухого глаза (ССГ) обнаружено большое количество нелипидных белковоподобных включений [14].

Известно, что основными источниками белков на поверхности глаза и слезной пленки являются эпителиальные клетки роговицы, бокаловидные клетки, слезная железа и кровеносные сосуды. Секрет МЖ также содержит в своем составе определенное количество белков. Несмотря на тот факт, что большинство белков плохо смешиваются с липидами, существует вероятность, что белковые остатки мейбоцитов сохраняются внутри мейбума и вместе с ним экспрессируются на поверхность глаза, образуя небольшую прослойку, разделяющую полярные и неполярные липиды.

Подтверждением этому служит исследование I. Butovich и соавт. [14], обнаруживших в составе любого мейбума включения, которые не были липидами и не плавились даже при температуре 50—70 °C. Нормальный мейбум содержит незначительное количество белковых включений, в то время как мейбум пациентов с тяжелой степенью ДМЖ состоит из значительного их количества с относительно небольшим содержанием плавкого мейбума вокруг белкового остова, что связано со способностью данных включений удерживать липиды вокруг себя. Характерно, что денатурированный белок, находящийся внутри липидных капель, оказывает на них конденсирующий эффект. Это взаимодействие влияет на повышение температуры плавления липидов в присутствии денатурированных белков. Самым непосредственным физиологическим последствием таких взаимодействий может быть повышение температуры плавления мейбума у пациентов с аномально высоким содержанием белкового материала в их секрете. Даже если липидный состав таких пациентов не отличается от нормы, более значительное присутствие белков может вызвать затвердевание мейбума в МЖ, их протоковой системе и привести к частичной или полной остановке выделения секрета на глазную поверхность. Были отмечены свойства образцов выдерживать давление, производимое предметным стеклом. Образец мейбума, взятый у здорового человека, сохранял целостность, формируя тонкую пленку между предметными стеклами, в то время как образец от пациента с тяжелой степенью ДМЖ разрывался на части, не сохраняя ее целостность. Это явление можно объяснить преимущественным накоплением амфифильных липидов вокруг белковых молекул, уменьшением их количества в других частях образца, что ухудшает взаимодействие с гидрофильными поверхностями.

До сих пор единственный анализ мейбума человека был проведен P. Tsai и соавт. [15], которые идентифицировали более 90 белков в мейбуме человека. Среди основных белковых компонентов: кератины (1, 5, 6, 7, 9, 10, 13, 16), лактоферрин, липофиллины, липокалины, предшественник лакритина, предшественник лизоцима C, белки — переносчики фосфолипидов, находящихся на поверхности слезной пленки, сурфактантные белки (SP-B, SP-C), протеогликаны, цитохром C, рецептор, активированный фарнезоидом X, рецептор семи трансмембранных спиралей (также называется рецептором соматостатина 4), регуляторный фактор 3 интерферона [15—17].

Среди перечисленных белков кератины охарактеризованы наиболее полно. Кератин 10 был обнаружен как в нормально функционирующих МЖ, так и при ДМЖ. Кератины 7 и 13 экспрессируются в ацинарных клетках МЖ. Обнаружено, что у пациентов с ДМЖ количество кератинов в мейбуме составляет до 10% от общего количества. Это может играть определенную роль в гиперкератинизации выводных протоков и, как следствие, препятствовать нормальному пассажу секрета.

Избыточные концентрации кератина нарушают нормальную структуру липидной фазы слезной пленки, что может сократить время ее разрыва у пациентов с ДМЖ [18].

Протеин липокалин 1 считается основным белком слез. Он удаляет жирные кислоты и фосфолипиды с поверхности роговицы, связывая их. В образцах, взятых у пациентов с ДМЖ, его концентрация снижена [19].

Протеин ELOVL4 (Elongation of very long chain fatty acids-4 protein), экспрессируемый в ткани МЖ, опосредует тканеспецифический биосинтез насыщенных и полиненасыщенных жирных кислот с очень длинной цепью (C>26). Таким образом, он напрямую участвует в создании стабильности слезной пленки и препятствует ее избыточному испарению [14].

Необходимо также упомянуть о физических свойствах липидного секрета в целом. Липидная смесь имеет диапазон плавления от 19,5 до 40 °C, что обеспечивает ее текучесть на поверхности края века [20]. Этот параметр влияет на стабильность внешнего липидного слоя слезной пленки, поскольку температура роговицы ниже (приблизительно 33,5 °C), чем температура свободного края века [21].

В настоящее время для оценки анатомо-функционального состояния МЖ и окружающих тканей используют ряд инструментальных методов.

1. Тиаскопия — метод, основанный на фоторегистрации цветового феномена интерференции, который позволяет визуализировать липидный слой слезной пленки. Исходя из цвета интерференции в каждой точке исследуемой зоны можно вычислить толщину липидного слоя. В свою очередь, программа Lacrima позволяет получить компьютерную модель прекорнеальной слезной пленки.

2. С помощью метода неинвазивной инфракрасной фотографии МЖ осуществляют оценку двухмерного изображения силуэта желез. Система бесконтактной мейбографии — это метод получения информации о структуре МЖ. Усовершенствованная конструкция прибора позволяет проводить оценку состояния МЖ как на нижнем, так и на труднодоступном для исследования верхнем веке. Современная система позволяет регистрировать изображение МЖ даже без щелевой лампы (Meibopen; Japan Focus Company, Япония) [22]. (DREAM) Study Research Group [23]. На основании анализа цифровых инфракрасных изображений авторами была разработана классификация патологических изменений МЖ: 0 степень — все протоки визуализируются; I — закупорены менее половины протоков МЖ; II — обструкция более половины протоков [24, 25].

3. Метод термографии век позволяет выявить зависимость между снижением температуры поверхности глаза и уменьшением времени разрыва слезной пленки у пациентов с обструкцией протоков МЖ [26]. У пациентов с ДМЖ зафиксировано повышение температуры кожи краев век, что можно объяснить наличием воспалительного процесса в веках [27].

4. Лазерная допплеровская флоуметрия является объективным методом исследования микроциркуляции век. МЖ обладают обширным кровоснабжением, так как синтез липидов является энергоемким процессом. С помощью этого метода были выявлены различия в кровоснабжении верхнего и нижнего века в норме и при заднем блефарите [28, 29].

5. Высокоинформативный инструментальный метод лазерной сканирующей конфокальной микроскопии позволяет оценить состояние стенок ацинусов, их диаметр, плотность, определить диаметр и степень кератинизации устьев МЖ, состояние интерстициального пространства и служить критерием оценки проводимой терапии [30].

6. Мейбография с оптической когерентной томографией (ОКТ). Метод дает возможность объективно оценить длину и ширину МЖ, а также толщину тарзальной конъюнктивы. При ДМЖ отмечено значимое уменьшение размеров МЖ [31]. Была разработана градация изменений МЖ для Spectralis HRA + ОКТ; Heidelberg Engineering: степень 0 — отсутствие потери МЖ; степень 1 — площадь выпадения желез меньше ¹/₃ от общего количества МЖ; степень 2 — область выпадения желез от ¹/₃ до ²/₃ от общего числа МЖ; степень 3 — выпадение желез больше ²/₃ от общего числа МЖ [32].

Все вышеперечисленные методы позволяют дать морфофункциональную оценку состояния век и МЖ. Однако лишь небольшое число исследований посвящены изучению самого секрета МЖ, изменения которого, вероятно, могут отражать анатомо-физиологические нарушения в них. Изолированное исследование секрета МЖ невозможно проводить без изучения химической структуры слезы, в состав которой вносят свой вклад МЖ.

Для исследования биохимического состава слезы и мейбума в настоящее время начинают активно применяться протеомные технологии, такие как масс-спектрометрия [33].

Масс-спектрометрия — это аналитический метод, который можно использовать для определения состава сложной жидкой смеси, такой как слеза, мейбум или лизат иммортализованных эпителиальных клеток МЖ (HMGEC).

Широко используют методы высокоэффективной жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии и сверхкритической жидкостной хроматографии. Последняя пользуется большой популярностью при целевом и нецелевом профилировании липидов благодаря своей высокой эффективности, низкому потреблению органических растворителей и возможности идентификации изомерных видов некоторых липидов. Отличительные особенности данных методов — минимальная чувствительность к воздействию загрязняющих веществ в образце, а также низкий расход органических растворителей [34].

Наиболее точными методами являются масс-спектрометрия с использованием масс-спектрометра LTQ Orbitrap, масс-спектрометра Triple TOF 5600 (Sciex, США) и масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением (ESI-MS) и прямой инфузией в режиме положительного обнаружения с применением йодида натрия в качестве добавки либо в режиме отрицательных ионов [35]. Данный метод позволяет произвести анализ нейтральных липидов, определить концентрацию, OAHFA и других полярных липидов в мейбуме и слезной пленке человека.

Масс-спектрометрическая технология идентификации относительного и абсолютного количества определенных протеинов позволила исследователям сравнить изменения протеома слезы при ССГ на фоне ДМЖ с нормальным составом. Протеомическое исследование образцов слезы выявило присутствие 491 белка, около 80 из которых играют решающую роль в патогенезе ССГ [36].

Протеомный анализ слезы, проведенный J. Sooria и соавт. [37], подтвердил сверхэкспрессию S100A6, S100A9, S100A8, S100A4, глутатион-S-трансферазы P (GSTP1), аннексина A1 (ANXA1) как в группе лиц с ССГ, так и в группе ДМЖ. Полученные данные могут помочь объяснить основы патофизиологии этих заболеваний и подтвердить использование предложенного альтернативного термина «скрытая ДМЖ» для обозначения ССГ. Богатые пролином белки (PRP3 и PRP4), индуцируемый пролактином белок (PIP), липокалин-1 (LCN1), лактоферрин (LTF) и лизоцим — это белки, которые, как было доказано, постоянно определяются при проведении протеомного анализа [38].

В настоящее время неясно, каким образом происходят посттрансляционная модификация белков, образование белкового комплекса, временное взаимодействие между дифференциально экспрессируемыми белками и серией сигнальных трансдукций белков.

Различные модификации метода масс-спектрометрии, используемые в научных исследованиях, отсутствие стандартизации методик влияют на получаемые данные. Однако, несмотря на это, протеомный анализ мейбума и слезы при ДМЖ является перспективным методом для ранней диагностики заболевания и оценки качества проводимой терапии.

Несмотря на имеющиеся в литературе данные, роль белков в составе мейбума, их влияние на функциональное состояние слезной пленки пока недостаточно изучены. Отсутствуют исследования об изменении качественного и количественного состава мейбума, белков при заболеваниях, ассоциированных с поражением МЖ, что может служить критерием оценки тяжести этих заболеваний.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.