Изменения суточной освещенности являются серьезным фактором, с которым сталкиваются люди, прибывающие в арктическую и субарктическую зону. В период полярного лета, для которого характерны высокий уровень постоянной световой нагрузки на глаза вследствие солнечной освещенности и повышенная ультрафиолетовая нагрузка из-за большой степени рассеяния атмосферы и отражений от снега и льда, создаются экстремальные фототические условия [1, 2]. И если у некоторых видов животных, постоянно живущих в полярных широтах, эволюционно выработались адаптационные физиологические и поведенческие механизмы, защищающие глаза от повреждения светом и/или ультрафиолетовыми волнами, то у людей, временно находящихся в Арктике, нет устойчивой адаптации к подобным воздействиям, в связи с чем арктические и субарктические условия могут вызывать разнообразные расстройства, например, сезонная фотофобия [3], метаболические нарушения [4], нарушения сна [5, 6].

Считается, что прямое физиологическое действие света на организм опосредуют зрительные фоторецепторы сетчатки глаза, которые играют важную роль в запуске и поддержании циркадных ритмов, а следовательно, зависимых от них физиологических процессов, в самой сетчатке, в супрахиазматическом ядре и в организме в целом [7—9]. Роль света как регулятора ритмических процессов в организме продемонстрирована при их изучении в условиях трансмеридианных перелетов, при ночной работе, длительно пониженном освещении, полной слепоте [10, 11].

Молекулярные механизмы взаимосвязи фоторецепции изучаются. Выяснено, что в функционировании сетчатки важное значение имеет гомеодоменный белок CRX, который является специфическим фактором транскрипции фоторецепторов и регулирует функцию эпифиза [12—15]. На модели животных показано, что ген CRX, кодирующий колбочко-палочковый гомеобокс CRX, индуцирует специфическую для эпифиза экспрессию гена Aanat, которая имеет выраженный циркадный ритм, обусловленный ночным высвобождением норадреналина из симпатических нервных окончаний, локализованных в эпифизе, и тем самым способствует циркадному ритму выработки мелатонина [16]. При мутациях в гене CRX (модель CRX null mice) выявляется снижение специфической экспрессии так называемых эпифиз-специфичных генов и ослабление циркадной зависимости [17]. Так, после удаления фрагмента гена CRX, кодирующего гомеодомен, не было выявлено никаких серьезных морфологических отклонений в сетчатке мышей CRX^-/- и они оставались жизнеспособными и плодородными. Однако экспрессия генов, кодирующих синтез родопсина, α-субъединицы трансдуцина, арестина, вовлеченных в цикл регуляции фототрансдукции, у мышей CRX^-/- была снижена. По данным электроретинографии, функция колбочек была снижена примерно на 90%. На срезах сетчатки CRX^-/- обнаруживалось отсутствие наружных сегментов палочек и колбочек за счет уменьшения фоторецептор-специфичных молекул, включая родопсин и опсин. Экспрессия гена, кодирующего зеленый/красный опсины, у CRX^-/--мышей отсутствовала. В то же время отклонений функции эпифиза у этих мышей не было и экспрессия эпифиз-зависимого гена Aanat, ключевого в синтезе мелатонина, оставалась достаточно высокой.

Из сказанного следует, что для понимания сенсорной адаптации человека к длительному пребыванию в условиях полярного дня, характеризующегося высокой световой нагрузкой на фоторецепторы, требуются всесторонние знания об экспрессии генов сетчатки глаза — как, собственно, циркадных (Clock, Bmal1, Cry1, Cry2, Per1 и т. д.), так и Crx, Otx5 Aanat, Hiomt и других генов, связанных с ее циркадными ритмами.

Цель исследования — определить, есть ли динамика уровня экспрессии гена CRX у человека после длительного временного пребывания в условиях полярного дня.

Материал и методы

Участники исследования и условия выполнения перелета. В этом исследовании приняли участие 6 пилотов (мужчины в возрасте от 39 до 69 лет, средний возраст — 56 лет), которые совершили первый кругосветный арктический авиаперелет на самолетах-амфибиях. Визуальные функции, цветовое и контрастное зрение у всех участников были удовлетворительными.

Перелет был осуществлен в период полярного лета, с 03 июля по 14 августа 2018 г. Общая продолжительность — 43 дня. Движение осуществлялось в направлении с запада на восток: с 62° с.ш. 74° в.д. до 72° с.ш. 114° в.д. Средняя высота — 3000 м. Протяженность маршрута составила более 21 тыс. км, он проходил в том числе вдоль побережья Северного Ледовитого океана, через Тихий и Атлантический океаны. Около 700 км пройдено над льдами и 6000 км — над водой.

Этическая экспертиза. Исследование проводилось в соответствии с принципами, изложенными в международных актах о юридических и этических принципах проведения научных работ с участием человека, и было одобрено этическим комитетом ФГБНУ «НИИ общей патологии и патофизиологии» (протокол №3 от 21.06.18). Участники исследования подписали информированное согласие на сбор образцов и информации.

Сбор данных. Забор образцов цельной периферической крови для получения РНК выполняли стандартно при венепункции (BD Vacutainer lavender-top EDTA tubes) перед стартом (Р0) и после финиша (Р+43) полета в дневное время. Полученные образцы крови сразу замораживали в жидком азоте.

Выделение нуклеиновых кислот и синтез комплементарной ДНК (кДНК). Выделение РНК проводили непосредственно из замороженной крови, растворяя часть образца в реагенте — QIAzol (Qiagen GmbH, Германия). После гомогенизации образца выделение проводили согласно протоколу компании-производителя [https://www.qiagen.com/kr/resources/resourcedetail?id=61c3ddbd-69c1-4b68-ab89-a428f14a9245&lang=en]. Концентрация выделенной РНК была измерена с помощью прибора NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, США), соотношение 260/280 составило 1,8—2,0. Также был проведен контроль качества выделенной РНК, используя прибор TapeStaton 4200 (Agilent, США). RIN для всех образцов был больше 5. Полученную РНК растворяли в деионизированной воде и обрабатывали ДНКазой I (Thermo Fisher Scientific, США), для синтеза использовали кДНК с помощью обратной транскриптазы Mu-MLV Reverse Transcriptase (Thermo Fisher Scientific, США) согласно протоколу фирмы-производителя. Полученную кДНК использовали как матрицу для полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени.

Олигонуклеотидные праймеры. Подбор олигонуклеотидных праймеров (табл. 1) осуществляли с использованием открытого программного обеспечения Ugene [https://ugene.net/ru/]. Дополнительно уточняли температуру отжига и проводили проверку на предмет отсутствия образования димеров и внутримолекулярных устойчивых структур в программе PerlPrimer [https://perlprimer.sourceforge.net/download.html]. Специфичность праймеров внутри генома человека оценивали с помощью веб-сервиса Primer-BLAST [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi]. Олигонуклеотиды были синтезированы в компании «Евроген» (Россия) [https://evrogen.ru/], используя прибор Applied Biosystems ABI 3900 (Applied Biosystems, Inc., США).

Таблица 1. Праймеры, использованные в работе, и расчетная температура отжига

Ген	Прямой праймер (5’-3’)	Tm for, °C	Обратный праймер (5’-3’)	Tm rev, °C	Комментарий
CRX	GAGTCCAGGGTTCAGGTTTG	61	GGGCAGAGGGGGACTGTA	62	–
b2M	CGTACTCCAAAGATTCAGGTT	58	TGCTGCTTACATGTCTCGAT	59	Housekeeping
TBP	CGGAGAGTTCTGGGATTGTA	59	GACTGTTCTTCACTCTTGGC	59	Housekeeping

Примечание. Tm for — температура плавления прямого праймера, Tm rev — температура плавления обратного праймера.

Количественную ПЦР в режиме реального времени проводили с использованием готовой ПЦР-системы iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, США) с добавлением праймеров (см. табл. 1) по 5 пмоль каждого, а также образцов кДНК в количестве 10 нг на одну реакцию. ПЦР проводили при помощи амплификатора «ДТ-Прайм» («ДНК-технология», Россия) [https://dna-technology.ru/dnaproducts/equipments/rtamplificators/dt96] при следующих условиях: 1) 95 °C, 5 мин; 2) 90 °C, 10 с; 3) 64 °C, 15 с; 4) 72 °C, 20 с (45 циклов 2-->4). Детекцию флюоресценции проводили при 72 °C в конце каждого цикла. Для каждого из образцов также были выполнены три технических повтора ПЦР. Результаты представляют собой среднее всех повторных измерений с определенными стандартными отклонениями. В процессе синтеза кДНК были выровнены концентрации РНК, и в дальнейшем все реакции (синтез кДНК и ПЦР) были проведены с эквивалентными количествами изначальной РНК. Нормализацию выполняли по гену b2M (считали его уровень матричной РНК — мРНК — и приводили к нему соответствующие значения пороговых циклов других генов).

Статистический анализ изменений уровней мРНК. В расчетах использовали сравнительный дельта Ct метод [18]. Экспрессию генов рассчитывали как среднее значение ± стандартное отклонение по данным, полученным в результате трех технических повторов. Уровень мРНК (log2 или значение цикла, на котором детектируется продукт), определенный до полета, сравнивали с уровнем мРНК для образцов, полученных после финиша. Кроме того, результаты были представлены в виде Z-баллов. Расчет Z-score для всех образцов проводили по следующей формуле:

Z=(datapoint(Ct) – среднее(Ct))/SD,

где Ct — пороговый цикл, SD (standard deviation) — стандартное отклонение.

Большее абсолютное значение Z-балла принимали за большее доказательство того, что транскрипционный фактор играет регулирующую роль в различении состояний.

Для определения значимости изменения использовался t-тест. P-value определяли с помощью веб-сервиса Google Docs, применяя парный t-тест Стьюдента для двух независимых выборок. Гены с p-value <0,05 считались значимо меняющими экспрессию.

Результаты

Средние значения уровня мРНК по данным RT-PCR гена CRX и референтных генов b2M, TBP (housekeeping genes) в образцах, взятых на старте и на финише, приведены в табл. 2. Как видно из данной таблицы, после полета в группе обследованных наблюдается экспрессия гена CRX (p<0,01). Общий уровень мРНК увеличился примерно в 3 раза до нормализации и примерно в 7 раз после нормализации по гену b2M по всем биологическим повторам.

Таблица 2. Оценка средних значений экспрессии генов CRX, b2M, TBP в периферической крови в группе до и после перелета

Показатель	Ген
	b2M	TBP	CRX
Среднее (старт)	24,44	33,78	38,70
SD (старт)	0,37	0,80	1,55
Среднее (финиш)	25,74	35,50	37,10
SD (финиш)	1,91	2,25	1,28
ΔCt без нормализации	1,30	1,72	–1,60
p	0,01	0,00	0,01
Кратность изменения уровня экспрессии гена, log2	0,41	0,30	3,03
ΔCt с b2M нормализацией	0,00	0,42	–2,90
Кратность изменения уровня экспрессии гена b2M после нормализации	1,00	0,75	7,46

На следующем этапе анализа данных для оценки закономерности динамики экспрессии гена CRX и кластеризации был рассчитан Z-score для всех образцов как на старте, так и после финиша. Графическое отображение изменений экспрессии генов представлено на рис. 1. Профиль экспрессии гена CRX у пилотов на старте и после финиша различен, но вместе с этим была очевидна схожесть направленности изменений (рис. 2). Так, индивидуальный прирост уровень экспрессии продемонстрировал разную величину в диапазоне от –1,53 до –3,07. При этом обращает на себя внимание то, что экспрессия гена CRX возросла после перелета у всех пилотов, кроме одного, у которого уровень экспрессии гена CRX был наиболее высоким на старте и незначительно снизился к окончанию перелета.

Рис. 1. Тепловая карта для значений Z-score (для генов CRX, b2M, TBP).

Диапазон Z-score: от -3 до 3 (объяснение в тексте).

Рис. 2. Точечная диаграмма значений Z-score (представлены данные только для гена CRX) для исследуемых образцов на старте и финише.

У пяти пилотов до перелета Z-score был меньше нуля, в то время как после перелета — больше нуля. Наименьшее значение Z-score было равно –1,81. Вместе с тем, как отмечено, у одного пилота наблюдалась обратная картина: до перелета Z-score был больше нуля, но после перелета — меньше нуля (рис. 3).

Рис. 3. Кластеризация Z-score гена CRX (координата по оси абсцисс — значение Z-score образца на старте, координата по оси ординат — значение Z-score образца на финише).

Образец 1 не попадает в кластер из пяти других образцов, занимая другую (противоположную) координатную четверть.

Обсуждение

В настоящем исследовании впервые проведен анализ экспрессии гена CRX у людей после временного продолжительного пребывания в условиях полярного дня. Сорокатрехдневный арктический перелет был выполнен в широтах, где длительность летнего светового дня составляет от 20 до 24 ч: например, в июле в Kulusuk (Гренландия) — около 20 ч, в Певеке (Россия) или Inuvik (Канада) — 24 ч (незаходящее солнце). При работе в таких условиях (естественный солнечный свет вне помещения и вместе с этим освещение в помещениях зданий, где пилоты находились во время отдыха) возникает повышенное световое воздействие на сетчатку, на ее фоторецепторы. В связи с этим встает вопрос о молекулярных механизмах стабильной физиологической адаптации глаза к световой среде при пребывании человека в арктических условиях в летнее время.

На основании предположения, что длинный фотопериод с измененной в сторону увеличения световой нагрузкой потенциально может вызывать повреждение сетчатки, был поставлен вопрос: как у участников перелета изменяется экспрессия гена CRX, который задействован в механизмах фоторецепции и поддержания функционирования зрительных клеток [13, 14]. Для ответа на него нами сопоставлена дневная экспрессия гена CRX у пилотов до и после совершенного арктического перелета.

Полученные результаты показывают, что у большинства пилотов описанный перелет привел к умеренной экспрессии гена CRX в образцах периферической крови. По значению Z-score пять пилотов из шести сформировали один кластер. При этом уровень мРНК CRX продемонстрировал рост на различную величину. Но, наряду с этим, у одного пилота уровень экспрессии незначительно снизился, и он кластеризовался в другую — противоположную — координатную четверть (см. рис. 3).

Отсутствие экспрессии гена, наблюдаемое у одного из пилотов, трудно объяснить. Поэтому дополнительно были проанализированы индивидуальные факторы, которые могут потенциально снижать или повышать нагрузку на сетчатку глаза. Как оказалось, этот пилот был единственным в составе команды, у кого были имплантированные в оба глазных яблока искусственные хрусталики, которые представляют собой акриловые линзы с ультрафиолетовыми фильтрами и фильтрами синего спектра света (от 400 до 475 нм) со снижением коэффициента пропускания волн синего света от 62%. Кроме того, он же в течение светового дня на протяжении всего перелета, т.е. постоянно, пользовался солнцезащитными очками с многослойным антирефлексным покрытием HCAR, затемнением 70% и защитой от ультрафиолетового излучения. Другие же участники перелета использовали солнцезащитные очки эпизодически, в основном при пилотировании самолета. То, что искусственные хрусталики и ношение специальных очков являются причиной отсутствия экспрессии гена CRX, — лишь предположение, не исключающее возможности влияния других нераспознанных факторов.

Таким образом, выявленные различные уровни экспрессии гена, так же как и отсутствие таковой, свидетельствуют о разных индивидуальных адаптационных возможностях при пребывании в абсолютно одинаковых средовых условиях, в которых находились все пилоты, участвовавшие в этом кругосветном перелете.

Как установлено ранее, гомеодоменный белок CRX является эссенциальным фактором для поддержания нормальных функций фоторецепторов сетчатки [16]. Мутации в гене CRX ассоциированы с нарушениями дифференцировки фоторецепторных клеток, дистрофией колбочек, фоторецепторной дегенерацией, нарушениями фототрансдукции и развитием ретинопатий различной степени тяжести, амавроза Лебера 7-го типа [17]. Кроме того, ряд генов фоторецепторов подавляются в отсутствие CRX [15]. Вместе с этим при сверх(овер)экспрессии CRX, специфичной для фоторецепторного клеточного слоя сетчатки, определяется увеличение числа фоторецепторов палочек, содержащих родопсин. При этом CRX действует синергически с другими факторами транкрипции, такими как NRL, RORB и RAX, для регуляции транскрипции генов, специфичных для фоторецепторных клеток.

Исходя из этого, можно предполагать, что в условиях полярного дня при совокупно избыточной фотостимуляции существует повышенная потребность в транскрипции CRX и экспрессия гена CRX является механизмом световой адаптации, направленным на обеспечение достаточного функционирования возбуждаемых фоторецепторов.

Заключение

Таким образом, полученные результаты подтверждают гипотезу об экспрессии гена CRX после длительного временного пребывания в условиях летнего полярного дня и обнаруживают различную индивидуальную динамику уровня экспрессии в ответ на измененную, одинаково высокую световую нагрузку на фоторецепторы сетчатки глаза, что отражает различия в сенсорной адаптации человека. При этом обращает на себя внимание следующее обстоятельство: наряду с типичным приростом уровня экспрессии, экспрессия гена CRX может отсутствовать, что наблюдалось у одного из пилотов. Этот феномен требует дальнейших целенаправленных исследований.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: С.Г., О.А., А.Г.

Участник перелета: О.А.

Сбор материала: С.Г., И.А., М.П., М.К.

Обработка материала и статистическая обработка данных: А.Г.

Написание текста: С.Г., О.Ю., А.Г.

Редактирование: С.Г., О.А., Э.Г.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.