Мировая статистика глазных болезней отмечает ежегодный прирост числа заболеваний роговицы, связанных с патологическими изменениями ее коллагеновой структуры. Кроме наследственной предрасположенности, это связано с ухудшением экологии, увеличением количества офтальмохирургических вмешательств, ростом числа травм и инфекционных поражений органа зрения.

В результате влияния комплекса патогенетических факторов, затрагивающих, как правило, оба глаза, происходит истончение роговицы и значительное ослабление ее прочностных свойств, что в свою очередь приводит к снижению зрительных функций, нередко — помутнению и рубцеванию [1—4].

В последнее десятилетие с целью укрепления роговой оболочки глаза стали активно применять ультрафиолетовый (УФ) кросслинкинг роговицы. Метод основан на комбинированном УФ-А (370 нм) облучении роговой оболочки, насыщенной рибо-флавином. УФ-кросслинкинг роговицы способствует стабилизации патологического процесса за счет улучшения ее биомеханических свойств, основанного на увеличении количества связей между фибриллами стромального коллагена и белками межклеточной адгезии посредством рибофлавин-УФ-А-индуцируемых фотохимических реакций. Классическая техника корнеального «сшивания» предполагает три этапа: первый — удаление роговичного эпителия (Epi-Off), второй — насыщение стромы рибофлавином и третий — УФ-облучение роговицы. Совершенствование этой методики привело, в частности, к созданию техники трансэпителиального и ускоренного кросслинкинга [3, 5—7].

Однако, в каком бы направлении не продвигалось развитие УФ-сшивания роговицы, ключевым фактором процедуры остается состоятельность насыщения стромы фотосенсибилизатором, которое определяет как эффективность, так и безопасность УФ-воздействия. При этом интенсивность Epi-Off пропитывания рибофлавином роговицы может быть обусловлена частотой инстилляций медикаментозного средства, концентрацией действующего вещества и продолжительностью его контакта с роговой оболочкой, а также свойствами вспомогательных компонентов раствора и особенностями деэпителизации. Последнее обстоятельство явилось предметом рассмотрения настоящей работы.

Цель исследования —оценить содержание рибофлавина во влаге передней камеры (ВПК) глаза кроликов в динамике стандартного насыщения роговицы растворами для УФ-кросслинкинга в зависимости от площади ее деэпителизации.

Исследования проводили в соответствии с общепринятыми принципами гуманности и существующими международными правилами по работе с лабораторными животными. В эксперимент последовательно включены 42 кролика-самца породы «Шиншилла» массой 2,6±0,2 кг. Забор ВПК глаза (252 образца) осуществляли с месячным интервалом между исследованиями.

Во всех группах для насыщения роговицы использовали различные растворы 0,1% рибофлавина мононуклеотида (далее по тексту рибофлавина). Каждый раствор рибофлавина исследовали на 42 кроликах (84 глаза) в зависимости от диаметра де-эпителизации роговицы: 1-я группа — 3 мм, 2-я — 6 мм, 3-я — 9 мм (см. таблицу).

Каждая из трех основных групп была поделена на 3 подгруппы, в которых средством для насыщения служили растворы: 0,1% изоосмотический рибофлавин — ИР, Декстралинк (0,1% рибофлавин с 20% декстраном) — Д [Рег. удостоверение № ФСР 2010/09071], 0,1% рибофлавин с 1% гидроксипропилметилцеллюлозой (ГПМЦ) — Р.

В качестве анестезиологического пособия применяли внутримышечно препарат «Ксилазин» в дозе 20 мг/кг и местные инстилляции 0,4% раствора оксибупрокаина (Инокаин).

Зону деэпителизации (диаметр 3, 6 или 9 мм) роговицы отмечали метчиком, затем с помощью тупфера, смоченного 70% этиловым спиртом, обрабатывали выделенный участок и шпателем производили удаление эпителия.

Изоосмотический раствор рибофлавина закапывали из расчета по 2 капли в 1 мин, раствор препарата «Декстралинк» и рибофлавина с ГПМЦ — по 1 капле каждые 2 мин.

У всех животных в течение 60 мин с интервалом в 10 мин через парацентез с использованием иглы 30 G выполняли забор ВПК в объеме ~ 0,2 мл. Срок наблюдения в настоящем эксперименте соответствует продолжительности стандартной процедуры УФ-кросслинкинга роговицы (30 мин — насыщение стромы рибофлавином и 30 мин — УФ-воздействие с продолжающимися инстилляциями фотосенсибилизатора), но без облучения.

Уровень рибофлавина в образцах ВПК глаза кроликов определяли с использованием микробиологической тест-системы ID-Vit фирмы «Immundiagnostik» (Германия). С помощью автоматического ИФА-анализатора Multiscan при длине волны 630 нм оценивали витамин-зависимый рост Lactobacillusrhamnosus, результат исследования выражали в микрограммах на литр.

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы Statistica 6.0 в виде определения среднего значения и стандартного отклонения (М±SD). Различия между показателями исследуемых групп определяли с помощью непараметрического критерия Манна—Уитни.

Выявление рибофлавина в ВПК глаза кролика при использовании различных растворов для УФ-кросслинкинга роговицы служит косвенным доказательством его содержания в строме. Полученные нами результаты динамического исследования уровня фотосенсибилизатора в ВПК глаза кроликов при стандартном насыщении роговицы отражены на рис. 1—4.

При использовании ИР был выявлен характерный рост концентрации рибофлавина в ВПК во всех исследуемых группах в первые 40 мин наблюдения, причем на 20—50-й минуте она достоверно отличалась от таковой на 5-й минуте (р<0,05). При этом максимальные значения фотосенсибилизатора в группе ИР-3 наблюдались на 50-й минуте, тогда как при деэпителизации в 6 мм (группа ИР-6) и 9 мм (группа ИР-9) — на 30—40-й минуте насыщения (см. рис. 1).

Очевидно, что на содержание рибофлавина в ВПК в исследуемых группах влияет и площадь удаленного эпителия: отмечено статистически достоверное отличие концентрации фотосенсибилизатора в группе ИР-3 от аналогичного показателя в группах ИР-6 и ИР-9. Особый интерес вызывают результаты исследования на 30-й минуте от начала инстилляций, когда в соответствии со стандартным протоколом кросслинкинга роговицы предусмотрен этап УФ-воздействия. Так, концентрация витамина В₂ в ВПК в группах ИР-6 иИР-9 находилась на одном уровне — 610—620 мкг/л, тогда как в группе ИР-3 содержание рибофлавина было на 23% ниже (в среднем 415±9,8 мкг/л, р<0,05).

При использовании для насыщения роговицы средства «Декстралинк» изменения концентрации рибофлавина в ВПК в целом были аналогичны — постепенный ее рост в течение исследуемого промежутка времени с максимальными значениями на 50—60-й минуте эксперимента во всех исследуемых группах (см. рис. 2). Интересно, что на 10—20-й минуте содержание рибофлавина в группе Д-9 было достоверно выше (277,5—355 мкг/л), чем в группах Д-3 и Д-6 (соответственно 100—190 и 135—195 мкг/л, р<0,05).

Насыщение роговицы 0,1% рибофлавином с 1% ГПМЦ на протяжении всего срока наблюдения обеспечивало устойчивый рост уровня рибофлавина в ВПК (см. рис. 3) с максимумом концентрации в группах также через 50—60 мин от начала инстилляций. Было выявлено статистически значимое различие в концентрации витамина В₂ в зависимости от размера зоны деэпителизации. Так, уже через 5 мин насыщения роговицы содержание фотосенсибилизатора в ВПК в группе Р-9 в 3,5 раза превышало таковое в группе Р-3 (соответственно 545±37,5 и 155±8,2 мкг/л, р<0,01) и в 1,5 раза — в группе Р-6 (370±19,9 мкг/л, р<0,05). Начиная с 10-й минуты и во все последующие сроки наблюдения отмечали достоверно более низкий (р<0,05) уровень рибофлавина в ВПК в группе Р-3 по сравнению с таковым в группах Р-6 и Р-9. На 50—60-й минуте эксперимента концентрация рибофлавина при инстилляциях рибофлавина с ГПМЦ превышала показатели в группе ИР при всех размерах зоны деэпителизации.

Сравнительный анализ содержания рибофлавина при использовании различных видов фотосенсибилизатора показал значительно меньшую способность к пенетрации действующего вещества при использовании раствора «Декстралинк». Уже на 5-й минуте исследования концентрация витамина В₂ во всех случаях была достоверно ниже в 2—3,5 раза (р<0,05−0,01) относительно групп ИР и Р (см. рис. 4). И лишь через 40—50 мин от начала инстилляций уровень рибофлавина при использовании раствора «Декстралинк» приближался к значениям двух других исследуемых средств. Изоосмотический раствор рибофлавина в этот же срок наблюдения более активно проникал в ткани роговицы и ВПК во всех сравниваемых группах, а концентрация витамина В₂ в зависимости от диаметра удаленного эпителия (3, 6 и 9 мм) была на 21, 22 и 16% выше относительно значений при инстилляции средства «Декстралинк».

Вероятно, это связано с высокой биодоступностью изоосмотического раствора рибофлавина, который с первых минут инстилляций создает достаточное содержание фотосенсибилизатора. Однако для обеспечения полноценной диффузии действующего вещества через роговицу необходимы его частые инстилляции, тогда как препараты на полимерной основе — с декстраном и ГПМЦ образуют устойчивую прекорнеальную пленку на поверхности роговицы, способствующую непрерывной пенетрации витамина В₂. Вместе с тем, как показали результаты наших исследований, средство «Декстралинк» во все сроки наблюдения, независимо от диапазона деэпителизации роговицы, обеспечивало меньшую концентрацию фотосенсибилизатора в ВПК по сравнению с его концентрацией при использовании изоосмотического раствора и рибо-флавина с ГПМЦ. Возможно, это связано с обезвоживающим эффектом полимера декстран, который способствует снижению толщины и уплотнению роговицы, затрудняя стромальный транспорт гидрофильной фракции рибофлавина мононуклеотида. Аналогичные результаты по определению уровня рибофлавина в ВПК были получены ранее в условиях кратковременного дозозависимого (10 мин) насыщения роговицы препаратом «Декстралинк» при деэпителизации 8 мм [8].

На 30-й минуте исследования, когда роговица после «пропитывания» испытуемыми растворами считается готовой к УФ-облучению, нами установлен следующий диапазон концентраций рибофлавина в ВПК — от 385±26,1 (Д-9) до 665±28 мкг/л (Р-9). В этих же пределах, но уже с 20-й минуты, регистрировался уровень фотосенсибилизатора в группах ИР-9, ИР-6, Р-6, а также ИР-3, Р-3 (см. рис. 4). Однако приемлемое, на первый взгляд, содержание рибофлавина в ВПК или роговице не может гарантировать выполнение качественного и безопасного УФ-сшивания, поскольку площадь удаленного эпителия образует в строме ограниченную зону, пропитанную рибофлавином (рис. 5). Следовательно, чем меньше участок деэпителизации, тем меньше размер оптимально насыщенного и, соответственно, наиболее защищенного пространства роговицы, которая на следующем этапе кросслинкинга подвергается УФ-воздействию (примерно на 8—10 мм диаметра роговицы).

Не следует забывать, что важным преимуществом Декстралинка является его выраженный противоотечный эффект. Отметим также, что неотъемлемой частью безопасности процедуры УФ-сшивания роговицы является прекорнеальная пленка, стабильность которой определяется, в частности, вязкостью раствора [9]. Поэтому Декстралинк и рибофлавин с ГПМЦ, очевидно, свой защитный эффект по отношению к ультрафиолету способны реализовывать дополнительно за счет рибофлавиновой пленки на поверхности роговицы, тогда как изоосмотический раствор рибофлавина образует неустойчивый поверхностный слой фотосенсибилизатора, что требует его многократных закапываний в течение всей процедуры кросслинкинга.

Таким образом, в клинической практике при УФ-сшивании роговицы в присутствии препаратов рибофлавина, содержащих декстран, необходимо рекомендовать предварительное насыщение стромы продолжительностью не менее 30 мин и соблюдение диаметра деэпителизации не менее 8—9 мм при условии приемлемой толщины роговой оболочки. Напротив, средство с 0,1% рибофлавином и 1% ГПМЦ, обладающее хорошей способностью к пенетрации сквозь роговицу, может быть применимо на более тонких роговицах (не менее 400 мкм), а продолжительность этапа насыщения может быть сокращена до 20 мин. При этом также желательно обеспечивать зону деэпителизации 8—9 мм.

Безопасное и эффективное ультрафиолетовое сшивание роговицы стандартным способом возможно при оптимальном насыщении ее стромы рибофлавином, которое может быть достигнуто преимущественно за счет достаточной площади деэпителизации (не менее 8—9 мм). Раствор 0,1% рибофлавина с 1% гидроксипропилметилцеллюлозой обеспечивает быстрое и значимое насыщение стромы фотосенсибилизатором, что позволит применять его в процедуре ультрафиолетового кросслинкинга, в том числе у пациентов с тонкой роговицей.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: М.Б., Г. Б., А.Х.

Сбор и обработка материала: Н.Ш., А.Х.

Статистическая обработка: Н.Ш.

Написание текста: М.Б., Н.Ш., А.Х.

Редактирование: М.Б., Г. Б., Н.Ш., А.Х.

Конфликт интересов отсутствует.