Бикбов М.М.

ГБУ "Уфимский НИИ глазных болезней" АН Республики Башкортостан

Шевчук Н.Е.

ГБУ «Уфимский НИИ глазных болезней АН РБ», ул. Пушкина, 90, Уфа, 450008, Российская Федерация

Халимов А.Р.

ГБУ «Уфимский НИИ глазных болезней АН РБ», ул. Пушкина, 90, Уфа, 450008, Российская Федерация

Бикбова Г.М.

ГБУ «Уфимский НИИ глазных болезней АН РБ», ул. Пушкина, 90, Уфа, 450008, Российская Федерация

Динамика уровня рибофлавина во влаге передней камеры глаза экспериментальных животных при стандартном насыщении стромы растворами для ультрафиолетового кросслинкинга роговицы

Журнал: Вестник офтальмологии. 2016;132(6): 29-35

Просмотров : 37

Загрузок :

Как цитировать

Бикбов М. М., Шевчук Н. Е., Халимов А. Р., Бикбова Г. М. Динамика уровня рибофлавина во влаге передней камеры глаза экспериментальных животных при стандартном насыщении стромы растворами для ультрафиолетового кросслинкинга роговицы. Вестник офтальмологии. 2016;132(6):29-35. https://doi.org/10.17116/oftalma2016132629-35

Авторы:

Бикбов М.М.

ГБУ "Уфимский НИИ глазных болезней" АН Республики Башкортостан

Все авторы (4)

Мировая статистика глазных болезней отмечает ежегодный прирост числа заболеваний роговицы, связанных с патологическими изменениями ее коллагеновой структуры. Кроме наследственной предрасположенности, это связано с ухудшением экологии, увеличением количества офтальмохирургических вмешательств, ростом числа травм и инфекционных поражений органа зрения.

В результате влияния комплекса патогенетических факторов, затрагивающих, как правило, оба глаза, происходит истончение роговицы и значительное ослабление ее прочностных свойств, что в свою очередь приводит к снижению зрительных функций, нередко — помутнению и рубцеванию [1—4].

В последнее десятилетие с целью укрепления роговой оболочки глаза стали активно применять ультрафиолетовый (УФ) кросслинкинг роговицы. Метод основан на комбинированном УФ-А (370 нм) облучении роговой оболочки, насыщенной рибо-флавином. УФ-кросслинкинг роговицы способствует стабилизации патологического процесса за счет улучшения ее биомеханических свойств, основанного на увеличении количества связей между фибриллами стромального коллагена и белками межклеточной адгезии посредством рибофлавин-УФ-А-индуцируемых фотохимических реакций. Классическая техника корнеального «сшивания» предполагает три этапа: первый — удаление роговичного эпителия (Epi-Off), второй — насыщение стромы рибофлавином и третий — УФ-облучение роговицы. Совершенствование этой методики привело, в частности, к созданию техники трансэпителиального и ускоренного кросслинкинга [3, 5—7].

Однако, в каком бы направлении не продвигалось развитие УФ-сшивания роговицы, ключевым фактором процедуры остается состоятельность насыщения стромы фотосенсибилизатором, которое определяет как эффективность, так и безопасность УФ-воздействия. При этом интенсивность Epi-Off пропитывания рибофлавином роговицы может быть обусловлена частотой инстилляций медикаментозного средства, концентрацией действующего вещества и продолжительностью его контакта с роговой оболочкой, а также свойствами вспомогательных компонентов раствора и особенностями деэпителизации. Последнее обстоятельство явилось предметом рассмотрения настоящей работы.

Цель исследования —оценить содержание рибофлавина во влаге передней камеры (ВПК) глаза кроликов в динамике стандартного насыщения роговицы растворами для УФ-кросслинкинга в зависимости от площади ее деэпителизации.

Материал и методы

Исследования проводили в соответствии с общепринятыми принципами гуманности и существующими международными правилами по работе с лабораторными животными. В эксперимент последовательно включены 42 кролика-самца породы «Шиншилла» массой 2,6±0,2 кг. Забор ВПК глаза (252 образца) осуществляли с месячным интервалом между исследованиями.

Во всех группах для насыщения роговицы использовали различные растворы 0,1% рибофлавина мононуклеотида (далее по тексту рибофлавина). Каждый раствор рибофлавина исследовали на 42 кроликах (84 глаза) в зависимости от диаметра де-эпителизации роговицы: 1-я группа — 3 мм, 2-я — 6 мм, 3-я — 9 мм (см. таблицу).

Группыисследования

Каждая из трех основных групп была поделена на 3 подгруппы, в которых средством для насыщения служили растворы: 0,1% изоосмотический рибофлавин — ИР, Декстралинк (0,1% рибофлавин с 20% декстраном) — Д [Рег. удостоверение № ФСР 2010/09071], 0,1% рибофлавин с 1% гидроксипропилметилцеллюлозой (ГПМЦ) — Р.

В качестве анестезиологического пособия применяли внутримышечно препарат «Ксилазин» в дозе 20 мг/кг и местные инстилляции 0,4% раствора оксибупрокаина (Инокаин).

Зону деэпителизации (диаметр 3, 6 или 9 мм) роговицы отмечали метчиком, затем с помощью тупфера, смоченного 70% этиловым спиртом, обрабатывали выделенный участок и шпателем производили удаление эпителия.

Изоосмотический раствор рибофлавина закапывали из расчета по 2 капли в 1 мин, раствор препарата «Декстралинк» и рибофлавина с ГПМЦ — по 1 капле каждые 2 мин.

У всех животных в течение 60 мин с интервалом в 10 мин через парацентез с использованием иглы 30 G выполняли забор ВПК в объеме ~ 0,2 мл. Срок наблюдения в настоящем эксперименте соответствует продолжительности стандартной процедуры УФ-кросслинкинга роговицы (30 мин — насыщение стромы рибофлавином и 30 мин — УФ-воздействие с продолжающимися инстилляциями фотосенсибилизатора), но без облучения.

Уровень рибофлавина в образцах ВПК глаза кроликов определяли с использованием микробиологической тест-системы ID-Vit фирмы «Immundiagnostik» (Германия). С помощью автоматического ИФА-анализатора Multiscan при длине волны 630 нм оценивали витамин-зависимый рост Lactobacillusrhamnosus, результат исследования выражали в микрограммах на литр.

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы Statistica 6.0 в виде определения среднего значения и стандартного отклонения (М±SD). Различия между показателями исследуемых групп определяли с помощью непараметрического критерия Манна—Уитни.

Результаты и обсуждение

Выявление рибофлавина в ВПК глаза кролика при использовании различных растворов для УФ-кросслинкинга роговицы служит косвенным доказательством его содержания в строме. Полученные нами результаты динамического исследования уровня фотосенсибилизатора в ВПК глаза кроликов при стандартном насыщении роговицы отражены на рис. 1—4.

Рис. 1. Динамика уровня рибофлавина в ВПК кролика при насыщении изоосмотическим раствором (ИР) с деэпителизацией роговицы 3, 6, 9 мм. Здесь и на рис. 2—4: по оси абсцисс — продолжительность наблюдения (в мин); по оси ординат — концентрация рибофлавина в ВПК (в мкг/л).

Рис. 2. Динамика уровня рибофлавина в ВПК кролика при насыщении раствором «Декстралинк» (Д) с деэпителизацией роговицы 3, 6, 9 мм.

Рис. 3. Динамика уровня рибофлавина в ВПК кролика при насыщении раствором рибофлавина и ГПМЦ (Р) с деэпителизацией роговицы 3, 6, 9 мм.

Рис. 4. Динамика изменения уровня рибофлавина в ВПК кроликов в зависимости от вида используемого раствора для УФ-кросслинкинга роговицы.

При использовании ИР был выявлен характерный рост концентрации рибофлавина в ВПК во всех исследуемых группах в первые 40 мин наблюдения, причем на 20—50-й минуте она достоверно отличалась от таковой на 5-й минуте (р<0,05). При этом максимальные значения фотосенсибилизатора в группе ИР-3 наблюдались на 50-й минуте, тогда как при деэпителизации в 6 мм (группа ИР-6) и 9 мм (группа ИР-9) — на 30—40-й минуте насыщения (см. рис. 1).

Очевидно, что на содержание рибофлавина в ВПК в исследуемых группах влияет и площадь удаленного эпителия: отмечено статистически достоверное отличие концентрации фотосенсибилизатора в группе ИР-3 от аналогичного показателя в группах ИР-6 и ИР-9. Особый интерес вызывают результаты исследования на 30-й минуте от начала инстилляций, когда в соответствии со стандартным протоколом кросслинкинга роговицы предусмотрен этап УФ-воздействия. Так, концентрация витамина В2 в ВПК в группах ИР-6 иИР-9 находилась на одном уровне — 610—620 мкг/л, тогда как в группе ИР-3 содержание рибофлавина было на 23% ниже (в среднем 415±9,8 мкг/л, р<0,05).

При использовании для насыщения роговицы средства «Декстралинк» изменения концентрации рибофлавина в ВПК в целом были аналогичны — постепенный ее рост в течение исследуемого промежутка времени с максимальными значениями на 50—60-й минуте эксперимента во всех исследуемых группах (см. рис. 2). Интересно, что на 10—20-й минуте содержание рибофлавина в группе Д-9 было достоверно выше (277,5—355 мкг/л), чем в группах Д-3 и Д-6 (соответственно 100—190 и 135—195 мкг/л, р<0,05).

Насыщение роговицы 0,1% рибофлавином с 1% ГПМЦ на протяжении всего срока наблюдения обеспечивало устойчивый рост уровня рибофлавина в ВПК (см. рис. 3) с максимумом концентрации в группах также через 50—60 мин от начала инстилляций. Было выявлено статистически значимое различие в концентрации витамина В2 в зависимости от размера зоны деэпителизации. Так, уже через 5 мин насыщения роговицы содержание фотосенсибилизатора в ВПК в группе Р-9 в 3,5 раза превышало таковое в группе Р-3 (соответственно 545±37,5 и 155±8,2 мкг/л, р<0,01) и в 1,5 раза — в группе Р-6 (370±19,9 мкг/л, р<0,05). Начиная с 10-й минуты и во все последующие сроки наблюдения отмечали достоверно более низкий (р<0,05) уровень рибофлавина в ВПК в группе Р-3 по сравнению с таковым в группах Р-6 и Р-9. На 50—60-й минуте эксперимента концентрация рибофлавина при инстилляциях рибофлавина с ГПМЦ превышала показатели в группе ИР при всех размерах зоны деэпителизации.

Сравнительный анализ содержания рибофлавина при использовании различных видов фотосенсибилизатора показал значительно меньшую способность к пенетрации действующего вещества при использовании раствора «Декстралинк». Уже на 5-й минуте исследования концентрация витамина В2 во всех случаях была достоверно ниже в 2—3,5 раза (р<0,05−0,01) относительно групп ИР и Р (см. рис. 4). И лишь через 40—50 мин от начала инстилляций уровень рибофлавина при использовании раствора «Декстралинк» приближался к значениям двух других исследуемых средств. Изоосмотический раствор рибофлавина в этот же срок наблюдения более активно проникал в ткани роговицы и ВПК во всех сравниваемых группах, а концентрация витамина В2 в зависимости от диаметра удаленного эпителия (3, 6 и 9 мм) была на 21, 22 и 16% выше относительно значений при инстилляции средства «Декстралинк».

Вероятно, это связано с высокой биодоступностью изоосмотического раствора рибофлавина, который с первых минут инстилляций создает достаточное содержание фотосенсибилизатора. Однако для обеспечения полноценной диффузии действующего вещества через роговицу необходимы его частые инстилляции, тогда как препараты на полимерной основе — с декстраном и ГПМЦ образуют устойчивую прекорнеальную пленку на поверхности роговицы, способствующую непрерывной пенетрации витамина В2. Вместе с тем, как показали результаты наших исследований, средство «Декстралинк» во все сроки наблюдения, независимо от диапазона деэпителизации роговицы, обеспечивало меньшую концентрацию фотосенсибилизатора в ВПК по сравнению с его концентрацией при использовании изоосмотического раствора и рибо-флавина с ГПМЦ. Возможно, это связано с обезвоживающим эффектом полимера декстран, который способствует снижению толщины и уплотнению роговицы, затрудняя стромальный транспорт гидрофильной фракции рибофлавина мононуклеотида. Аналогичные результаты по определению уровня рибофлавина в ВПК были получены ранее в условиях кратковременного дозозависимого (10 мин) насыщения роговицы препаратом «Декстралинк» при деэпителизации 8 мм [8].

На 30-й минуте исследования, когда роговица после «пропитывания» испытуемыми растворами считается готовой к УФ-облучению, нами установлен следующий диапазон концентраций рибофлавина в ВПК — от 385±26,1 (Д-9) до 665±28 мкг/л (Р-9). В этих же пределах, но уже с 20-й минуты, регистрировался уровень фотосенсибилизатора в группах ИР-9, ИР-6, Р-6, а также ИР-3, Р-3 (см. рис. 4). Однако приемлемое, на первый взгляд, содержание рибофлавина в ВПК или роговице не может гарантировать выполнение качественного и безопасного УФ-сшивания, поскольку площадь удаленного эпителия образует в строме ограниченную зону, пропитанную рибофлавином (рис. 5). Следовательно, чем меньше участок деэпителизации, тем меньше размер оптимально насыщенного и, соответственно, наиболее защищенного пространства роговицы, которая на следующем этапе кросслинкинга подвергается УФ-воздействию (примерно на 8—10 мм диаметра роговицы).

Рис. 5. Роговица глаза кролика после 30 мин инстилляций раствора 0,1% рибофлавина с 1% ГПМЦ при деэпителизации: а, б, — 9 мм; в, г — 3 мм.

Не следует забывать, что важным преимуществом Декстралинка является его выраженный противоотечный эффект. Отметим также, что неотъемлемой частью безопасности процедуры УФ-сшивания роговицы является прекорнеальная пленка, стабильность которой определяется, в частности, вязкостью раствора [9]. Поэтому Декстралинк и рибофлавин с ГПМЦ, очевидно, свой защитный эффект по отношению к ультрафиолету способны реализовывать дополнительно за счет рибофлавиновой пленки на поверхности роговицы, тогда как изоосмотический раствор рибофлавина образует неустойчивый поверхностный слой фотосенсибилизатора, что требует его многократных закапываний в течение всей процедуры кросслинкинга.

Таким образом, в клинической практике при УФ-сшивании роговицы в присутствии препаратов рибофлавина, содержащих декстран, необходимо рекомендовать предварительное насыщение стромы продолжительностью не менее 30 мин и соблюдение диаметра деэпителизации не менее 8—9 мм при условии приемлемой толщины роговой оболочки. Напротив, средство с 0,1% рибофлавином и 1% ГПМЦ, обладающее хорошей способностью к пенетрации сквозь роговицу, может быть применимо на более тонких роговицах (не менее 400 мкм), а продолжительность этапа насыщения может быть сокращена до 20 мин. При этом также желательно обеспечивать зону деэпителизации 8—9 мм.

Заключение

Безопасное и эффективное ультрафиолетовое сшивание роговицы стандартным способом возможно при оптимальном насыщении ее стромы рибофлавином, которое может быть достигнуто преимущественно за счет достаточной площади деэпителизации (не менее 8—9 мм). Раствор 0,1% рибофлавина с 1% гидроксипропилметилцеллюлозой обеспечивает быстрое и значимое насыщение стромы фотосенсибилизатором, что позволит применять его в процедуре ультрафиолетового кросслинкинга, в том числе у пациентов с тонкой роговицей.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: М.Б., Г. Б., А.Х.

Сбор и обработка материала: Н.Ш., А.Х.

Статистическая обработка: Н.Ш.

Написание текста: М.Б., Н.Ш., А.Х.

Редактирование: М.Б., Г. Б., Н.Ш., А.Х.

Конфликт интересов отсутствует.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail