Клеточная терапия (КТ) — это трансплантация жизнеспособных аутологичных, аллогенных или ксеногенных живых клеток в целях регенерации поврежденной ткани. К КТ не относится использование клеток в диагностических целях или для получения биологических препаратов (антител, факторов роста, межклеточного матрикса и др.) [1—4].

Началом КТ можно считать первые эксперименты по пересадке костного мозга, проведенные в 1957 г., которые подтвердили, что трансплантируемые клетки способны не только выживать в тканях реципиента, но и заселять соответствующую тканевую нишу, делиться и восстанавливать утерянную функцию [5]. Этот результат полностью соответствовал унитарной теории кроветворения, предложенной А.А. Максимовым, согласно которой все клетки крови образуются в результате деления и дифференцировки клеток-предшественников или стволовых клеток (СК), способных к самоподдержанию [6].

К началу 2013 г. в мире было зарегистрировано уже более 4,5 тыс. клинических исследований клеточных продуктов [7], сложность работы с которыми связана с отсутствием правового регулирования по применению клеточных технологий и слабой координацией взаимоотношений между исследовательскими лабораториями [8].

СК — это клетка, способная претерпевать асимметричное деление, в результате которого образуется одна клетка, идентичная материнской, и вторая — вступившая на путь дифференцировки [2]. Ее генетическая информация защищена от повреждений специальными ферментами (теломеразами) [9]. Дальнейшая судьба клетки еще не определена, не произошла ее специализация.

Теория существования небольшой популяции клеток-предшественников (прогениторов или региональных СК), отвечающих за физиологическую и репаративную регенерацию, и «более дифференцированных», чем исходная СК, была подтверждена для большинства тканей: мышечной [10], костной и хрящевой [11], кожи [12], и даже нервной [13]. На функционирование этих клеток влияют особенности микроокружения — так называемой тканевой ниши, покидая которую, клетка либо погибает, не получая положительной стимуляции, либо при наличии соответствующих сигналов переходит к дифференцировке. Например, гемопоэтические СК (ГСК) сохраняют свои свойства только в костном мозге, предшественники кератиноцитов — в пределах волосяного фолликула, лимбальные СК (ЛСК) — в зоне палисадов Фогта роговицы [14—16].

По мере развития методов культивирования появились доказательства того, что СК и прогениторные клетки можно выделить, размножить, дифференцировать и/или активировать in vitro, после чего трансплантировать в зону дефекта [17].

Пока в клиническую практику прочно вошли только работы по исследованию ГСК, используемых для восстановления кроветворения [18]. Определенные успехи достигнуты в кардиологии и терапевтическом ангиогенезе [19], комбустиологии (ожоговой медицине) [20, 21], при лечении неврологических заболеваний [22], сахарного диабета [23], в разработках по регенерации хряща [24] и некоторых других областях [25].

Несомненным плюсом КТ является сравнительно малое «стартовое» количество материала и относительно доступная технология выполнения. В то же время проведенные исследования выявили ряд опасений и ограничений для применения КТ в клинической практике. Это в первую очередь возможные нарушения кариотипа, возникающие при длительном культивировании и обработке клеток [26, 27], а также потенциальное наличие в препарате недостаточно коммитированных (предрасположенных к развитию в определенном направлении) клеток, способных сформировать опухоль, особенно при использовании производных плюрипотентных СК (ПСК) [28, 29]. При использовании фетальных и эмбриональных клеток возникают правовые и этические проблемы [30]. Однако, несмотря на наличие определенных сложностей при работе с клетками, исследователи не останавливаются в поисках новых методов лечения с помощью клеточных технологий.

При экспериментальных исследованиях в области клеточных технологий глаз обладает рядом преимуществ перед другими органами: это и возможность визуализации через прозрачную роговицу введенных интраокулярно клеток, и разнообразие неинвазивных методов диагностики зрительных функций. За счет наличия гематоофтальмического барьера риск развития системных осложнений (формирования опухолей) при внутриглазном введении клеток минимален [31].

Иммунный ответ в тканях глаза снижен за счет различных механизмов иммунологической толерантности, а в переднем отрезке глаза осуществляется по специфическому типу «иммунного отклонения, связанного с передней камерой», что позволяет использовать в КТ не только аутологичные, но и аллогенные клетки, относительно длительно выживающие в организме реципиента без иммунного отторжения [32].

Вопрос выбора источника клеток для любой КТ определяется в первую очередь ожидаемым эффектом — тканезаместительным, трофическим или иммуномодулирующим.

Если в результате применения КТ планируется добиться тканезаместительного действия — восстановления структуры за счет встраивания трансплантированных клеток в поврежденную ткань, то следует использовать клетки, совместимые с пациентом по HLA-аллелям (human leucocyte antigens — антигены лейкоцитов человека), предпочтительно аутологичные. Сложность проведения подобной КТ связана с тем, что в ряде тканей взрослого человека, в том числе сетчатки, клетки-предшественники практически отсутствуют или их активность недостаточна для замещения дефекта. Альтернативой является использование аллогенных клеток более ранних стадий развития (фетальные, эмбриональные СК (ЭСК), мезенхимальные СК (МСК)), СК из близких источников (предшественники эндотелия из костного мозга, клетки волосяного фолликула, из жировой ткани) или даже дифференцированных клеток (эпителий слизистой полости рта), которые обрабатывают и преддифференцируют in vitro и затем трансплантируют в зону дефекта, где за счет микроокружения in vivo они должны принять желаемый фенотип.

Перспективными в этом отношении являются индуцированные ПСК (ИПСК). Авторы метода их получения в 2012 г. были удостоены Нобелевской премии в области медицины. Полученные из соматических клеток путем активации генов Oct4, Klf4, Sox2 и c-Myc, доставленных в ядро ретровирусами или другим способом, они могут при соответствующей стимуляции сформировать практически любую клетку организма [33]. В настоящее время они активно используются для моделирования болезней, скрининга лекарств, проверки токсичности различных препаратов [34, 35]. На данный момент из ИПСК были успешно получены многие типы клеток, в том числе фоторецепторы сетчатки [36], пигментный эпителий [37], прогениторы хрусталика [38], эпителий [39] и кератоциты [40] роговицы. Дифференцировка клеток в эндотелий роговицы остается пока нерешенной задачей.

Тканевая инженерия является одним из вариантов тканезаместительной К.Т. При данном подходе клетки трансплантируют в составе графта на структурированной подложке/носителе/скаффолде [41]. Этот метод обладает определенными преимуществами перед трансплантацией клеток в суспензии: клетки лучше выживают после трансплантации, дольше сохраняются в зоне введения, образуют более прочные контакты с клетками реципиента. Кроме того, за счет структурирования восстанавливается барьерная/мембранная функция ткани, а при восстановлении объемных дефектов ткани материал подложки может выступать в роли матрицы для синтеза межклеточного вещества [42].

В качестве носителя могут выступать самые разнообразные материалы как биологического (амниотическая мембрана, белки межклеточного вещества и др.), так и искусственного происхождения (контактные линзы, пленки из сополимера молочной и гликолевой кислот (polylactide glycolide acid — PLGA) и поликапролактона (polycaprolactone — PCL), нановолокна и др. [43, 44]).

Параллельно с подготовкой различных материалов для использования в качестве скаффолдов разрабатываются и технологии клеточных пластов или микротканей, т. е. техника культивирования и доставки клеток без подложки [45].

Трофический, или паракринный, эффект развивается, когда введенные в зону повреждения компоненты клеточного препарата продуцируют биологически активные вещества или модулируют активность клеток реципиента через выработку факторов роста, цитокинов, хемокинов, простагландинов, нейромедиаторов и других биологически активных веществ. Это, в свою очередь, приводит к ангиогенному, противовоспалительному и антиапоптотическому эффектам, ремоделированию матрикса и активации резидентных клеток-предшественников [46, 47].

Для достижения трофического эффекта чаще всего используют суспензию клеток (мононуклеарные клетки (МНК) крови, клетки пуповинной крови, МСК, ГСК, нейрональные СК) [48]. Список используемых для КТ с трофической целью клеток постоянно расширяется.

Иммуномодулирующая КТ предназначена для коррекции защитных реакций организма: усиления противовирусного/антибактериального ответа, формирования противоопухолевых защитных реакций, иммуносупрессивного эффекта при трансплантации [2]. Для этой цели могут быть использованы отдельные субпопуляции лейкоцитов: Т-киллеры, Т-хелперы, В-лимфоциты, дендритные клетки и др. В последнее время появляются публикации о способности МСК и ГСК снижать интенсивность реакции при отторжении трансплантированной роговицы и аутоиммунных поражениях сетчатки [49, 50].

Роговичная слепота остается одной из главных задач офтальмологии [51]. Проблема нехватки качественного донорского материала (в том числе и из-за постепенного распространения лазерного кератомилеза [52]) делает все более актуальными клеточно-терапевтические подходы, которые в ряде случаев могут служить альтернативой пересадке роговицы.

Наиболее перспективным и патогенетически обоснованным направлением в КТ эпителия роговицы можно считать трансплантацию ЛСК, в норме располагающихся в палисадах Фогта [53]. Эта популяция относится к унипотентным СК, которые митотически делятся с образованием себе подобных и переходных клеток, мигрирующих по направлению к центру роговицы. В норме популяция ЛСК сохраняется в течение всей жизни и обеспечивает обновление эпителия роговицы и его восстановление при повреждении. При утрате ЛСК развивается синдром их недостаточности с «конъюктивизацией» роговицы и персистирующими эрозиями [54, 55]. В этих случаях применяют послойную трансплантацию лимбальной зоны. Донорские ЛСК мигрируют из трансплантата, заселяя тканевую нишу реципиента.

В 1997 г. G. Pellegrini [56] предложила предварительно выделить ЛСК, размножить их в чашке Петри, после чего трансплантировать пациенту. Такая трансплантация культивированного лимбального эпителия оказалась достаточно эффективной (положительный эффект был достигнут в 76% случаев) [57]. За прошедшие годы метод был растиражирован в различных медицинских центрах Великобритании, Италии, Австралии, Германии, Индии, Ирана, Тайваня, США, Японии. Техника выполнения КТ различалась в основном по тому, были ли клетки трансплантированы в суспензии или пластом, с добавлением ксенобиотиков (сывороток, подложек) или без них [58—60].

Благодаря совершенствованию техники культивирования ЛСК, позволяющей наращивать достаточное количество клеток из нескольких биоптатов менее 1 мм³ в диаметре, в качестве источника теперь можно использовать не только аллогенный, но и аутологичный материал из здорового парного глаза.

При невозможности трансплантировать ЛСК, например при поражении лимбальной зоны на обоих глазах, возможно использовать и другие клетки, в частности культивированные клетки слизистой полости рта (в 36,8% таких случаев авторам удалось добиться успешной эпителизации без врастания сосудов на протяжении года) [61, 62] или эпителий кожи [63].

Трофический эффект, приводящий к ускорению заживления повреждений эпителия, оказывает также трансплантация фетальных клеток роговицы [64], МНК крови [65] и активированных лейкоцитов [66, 67].

Выделены кератоциты человека, синтезирующие межклеточное вещество роговицы, подобраны условия их культивирования in vitro и при необходимости они могут быть использованы для восстановления дефектов стромы [68]. Идентифицированы также стромальные СК [69]. Исследователи стремятся получить эквивалент стромы роговицы, идентичный по своим оптическим и механическим свойствам исходной ткани [70]. Проведенные трансплантации графтов со СК из жировой ткани [71] и фибробластами кроликам с механической травмой и ожогами роговицы показали, что данная методика может быть успешной [72].

Восстановление дефектов эндотелия роговицы ограничено его сниженной способностью к пролиферации in vivo [54, 73] и ограниченным делением in vitro [74]. Изучение различных подходов к лечению поврежденного эндотелия проводится длительное время, выделены даже клетки-предшественники роговичных эндотелиоцитов [75]. Эндотелиоподобные клетки были получены из ЭСК [76].

Современные методы культивирования позволяют нарастить из одной донорской роговицы (или из материала, остающегося после послойной кератопластики) такое количество эндотелиальных клеток, которого могло бы хватить для нескольких десятков их трансплантаций [77].

Методы работы с роговичным эндотелием принципиально разделяются на 3 большие группы: трансплантация клеточного пласта, трансплантация клеток в виде микросфер и стимуляция регенерации эндотелия in vivo.

Самая многочисленная группа методов — наращивание и трансплантация эндотелиоцитов в виде пласта на поверхности культуральной посуды, покрытой одним из множества вариантов «носителей» — компонентами экстрацеллюлярного матрикса, децеллюлизированной стромой, десцеметовой или амниотической мембраной или же термореверсивным гелем [78—81].

При трансплантации же эндотелиоцитов в виде суспензии или микросфер возникает вопрос о необходимости их направленной миграции в область повреждения, в противном случае клетки просто будут «вымыты» из передней камеры. Для предотвращения «вымывания» клеток предложено, например, «нагружать» их магнитными микросферами перед трансплантацией, а после интракамеральной инъекции создавать локальное магнитное поле [82—84].

Человеческие эндотелиоциты, размноженные in vitro в различных модификациях, были успешно трансплантированы кошкам, кроликам и быкам [81, 85, 86], а также пересажены в перфузируемый человеческий глаз [82].

Для замещения дефекта роговичного эндотелия предложено использовать эндотелиальные прогениторы, полученные из пуповинной крови. В эксперименте на кроликах с удаленным эндотелием и десцеметовой мембраной получены многообещающие результаты — восстановление толщины и прозрачности роговицы за счет замещения роговичного эндотелия трансплантированными клетками [87].

Еще одним сценарием регенерации эндотелия роговицы, осуществленным группой японских ученых в 2013 г., стало усиление регенераторных возможностей эндотелия in vivo. Для усиления деления эндотелия авторы предлагают использовать ингибитор ROCK-киназы, который снимает молекулярный «блок», препятствующий митозу [88]. Использование этого вещества в виде инстилляций показало стимулирующий эффект на регенерацию в эксперименте на животных и у больных дистрофией Фукса [89], а добавление его в питательную среду при культивировании роговичного эндотелия позволило исследователям разработать протокол трансплантации, разрешенный для применения у человека (запущены клинические исследования) [90].

Трофический эффект, приводящий к восстановлению функции поврежденного эндотелия, показан при использовании метода персонализированной КТ (ПКТ) — интракамеральной трансплантации активированных полуданом лейкоцитов в аутологичной процессированной сыворотке. Данный метод разработан и с успехом применяется в НИИ глазных болезней для лечения ранней послеоперационной буллезной кератопатии [91—93]. По такому же механизму, видимо, работают и трансплантированные субконъюнктивально фетальные клетки роговицы [94].

Эквиваленты роговицы из трех слоев на данный момент воссозданы только in vitro, результаты их трансплантации пока не получены [95]. Кроме того, ведутся работы в направлении 3D-культивирования клеток роговицы для создания биоинженерных конструкций [96].

Нарушение биомеханических свойств склеры часто обусловлено дисбалансом молекулярных механизмов, отвечающих за обновление экстрацеллюлярного матрикса [97]. Для коррекции синтетической активности склероцитов предложено использовать различные ростовые факторы [98].

Однако основным подходом при лечении истончений склеры остаются склероукрепляющие операции [99].

Проведенное в НИИ глазных болезней исследование трансплантации МНК и активированных лейкоцитов (ПКТ) на модели экспериментального истончения склеры показало улучшение ее морфологических свойств в зоне дефекта, что может стать предпосылкой для последующей разработки клеточно-терапевтических методов лечения миопии [100].

Ведутся активные поиски генетических дефектов, ответственных за нарушение биомеханических свойств склеры при миопии [101—103], что в дальнейшем может стать фундаментом для патогенетического лечения миопии высокой степени путем генной коррекции фибробластов или прогениторных клеток склеры [104].

Ряд патологий сетчатки, пигментного эпителия и зрительного нерва до сих пор практически не поддаются лечению традиционными методами. В то же время их заболевания являются одной из главных инвалидизирующих причин в офтальмологии [51]. Поэтому разработка способов восстановления функций сетчатки с помощью КТ сохраняет свою актуальность [105].

Хотя в тканях глаза взрослого человека и были обнаружены клетки-предшественники, способные при определенных условиях дифференцироваться в клетки сетчатки (эпителий ресничного тела, пигментный эпителий радужки, Мюллеровы клетки), in vivo их потенциала не хватает для замещения дефекта. Возможно, фармакологическая активация этих клеток-предшественников могла бы увеличить регенераторные возможности сетчатки. Однако на сегодняшний день восстановление сетчатки пытаются осуществить за счет трансплантации клеток, выращенных in vitro [106].

Наиболее «удобными» для работы на заднем полюсе глаза являются клетки пигментного эпителия вследствие их способности к формированию in vitro функционирующего монослоя. Сложность заключается в том, что «взрослые» клетки пигментного эпителия в силу своей терминальной дифференцированности плохо восстанавливаются при повреждении и менее способны к замещению дефекта, чем клетки более ранних стадий развития, поэтому некоторые исследователи используют ЭСК [107]. Однако в этом случае возникает вопрос иммунной совместимости. Эту проблему призвано решить использование ИПСК, полученных из аутологичных фибробластов и трансдифференцированных в клетки пигментного эпителия [108, 109]. Проведенные трансплантации показывают, что выращенные in vitro клетки способны выживать в ткани реципиента и даже выполнять свою функцию [110, 111]. Низкую эффективность проведенных трансплантаций исследователи связывают с недостатками технологических подходов и надеются, что при разработке правильной хирургической техники операции и биосовместимых носителей для адресной доставки клеток к сетчатке восстановление пигментного эпителия станет доступно больным с возрастной макулярной дегенерацией [112—114].

При трансплантации фоторецепторов успешное приживление связано с адекватным формированием связей между выращенными и ганглионарными клетками реципиента. Несмотря на то что большое количество исследовательских коллективов активно работают над этой проблемой, используя как аутологичные клетки, полученные в ходе операционного вмешательства на сетчатке, так и ИПСК [115] или фетальные клетки-прогениторы сетчатки человека, выделенные из сетчатки эмбриона на 14—20-й неделе гестации [116, 117], стойкого и предсказуемого эффекта пока не удается добиться ни при трансплантации фоторецепторов в суспензии [118], ни в виде микроагрегатов [119], ни в виде «второго слоя» сетчатки [120]. Неудачи отчасти связывают с необходимостью преодолевать клетками после трансплантации межклеточные мембраны [114]. Решение этой проблемы ученые видят в совместном введении с клетками матриксных протеиназ, способных разрушать межклеточные барьеры [121]. Важную роль также играют носители/скаффолды, на которых клетки трансплантируются [122].

Следует отметить, что определенный эффект достигнут при использовании трофического механизма действия К.Т. Так, зрительные функции улучшались у больных, которым была выполнена трансплантация нейральных СК из цилиарной зоны [123], предшественников нервных клеток обонятельного эпителия [124], мюллеровой глии [125], клеток пуповины [126] или костномозговых СК [127, 128]. Несмотря на то что эти клетки не выживали в организме реципиента, продуцируемые ими трофические факторы способствовали защите клеток реципиента от дегенеративных процессов.

По-видимому, подобное действие оказывают и МНК крови, клетки костного мозга, МСК, активированные аутологичные лейкоциты (ПКТ) при использовании их в лечении заболеваний зрительного нерва [129—131].

Задача восстановления поврежденной сетчатки и прилежащих слоев является одной из самых сложных в области КТ, но и предполагаемый эффект при успехе КТ-подходов будет колоссальным.

Очевидно, что усовершенствование и внедрение клеточных технологий в практику клинической офтальмологии является перспективным направлением ввиду того, что при ряде заболеваний глаз, клеточно-инженерные подходы имеют значительно больший потенциал, чем традиционные методы лечения.