Экспериментальное изучение влияния повреждающих факторов и шапероноподобных препаратов на катарактогенез

Катаракта — основная причина слабовидения и слепоты в мире [18, 19]. Несмотря на впечатляющие успехи офтальмохирургии, проблема медикаментозного лечения этого заболевания остается чрезвычайно актуальной.

Исследования молекулярных механизмов поддержания прозрачности и возникновения помутнения хрусталика позволили нам предложить единый механизм возникновения катаракты [4, 8, 14]. Последовательность патологических событий может быть представлена следующим образом:

— с возрастом нарушается процесс пролиферации эпителиальных клеток хрусталика. Это приводит как к их гибели, так и к нарушению морфогенеза вновь образуемых волоконных клеток;

— под воздействием кислорода, проникающего в хрусталик через поврежденный эпителиальный слой, нарушается нормальный процесс деградации клеточных органелл, в первую очередь митохондрий. Вследствие этого в кортикальной области хрусталика появляются клетки, содержащие митохондрии;

— в присутствии проникшего в хрусталик кислорода митохондрии вырабатывают его активные формы (супероксиданион-радикал, синглетный кислород и т.д.), которые атакуют хрусталиковые белки, в основном γ-кристаллин;

— окисленные белки легко денатурируют и агрегируют, что нарушает гомогенное распределение белка и приводит к появлению в цитоплазме волоконных клеток микрообластей с различными значениями коэффициента оптического преломления. В результате усиливается светорассеяние — хрусталик мутнеет.

При этом различные по природе катарактогенные факторы (ультрафиолетовые —УФ-лучи, радиоактивное излучение, стероидные препараты и др.) лишь ускоряют этот процесс. Из всего этого следует, что, препятствуя денатурации и агрегации белка, можно затормозить и развитие катаракты.

Шапероноподобный белок α-кристаллин противостоит денатурации и агрегации белков в хрусталике, однако с возрастом его активность снижается и возникает катаракта [17]. Действительно, применение низкомолекулярных соединений, обладающих шапероноподобной активностью и способных тормозить процесс агрегации белка, достоверно задерживало развитие помутнения хрусталика [1—3, 6, 7, 16].

Цель настоящей работы — сравнительное исследование различных повреждающих факторов, влияющих на состояние хрусталика, и изучение воздействия комбинации шапероноподобных препаратов (N-ацетилкарнозина и D-пантетина) на УФ-индуцированную катаракту в экспериментах на животных.

Для эксперимента по изучению влияния различных повреждающих факторов на состояние хрусталика были отобраны 80 мышей-самцов гибрид F1 (C57Black/CBA) в возрасте 2 мес без видимой офтальмопатологии. Срок наблюдения за животными составил 10 мес. Все животные были разделены на 4 рандомизированные группы. Животных трех групп подвергали следующим воздействиям: 1-я группа — ежедневное УФ-облучение (УФ); 2-я группа — однократное облучение γ-лучами в дозе 2 Гр всего тела животного (γ-лучи); 3-я группа — однократное облучение γ-лучами в дозе 2 Гр + ежедневное УФ-облучение (γ-лучи + УФ); 4-я группа служила контролем возрастных изменений хрусталика (К).

Эксперимент по изучению антикатарактального воздействия комбинированного препарата (N-ацетилкарнозин и D-пантетин) проведен на 33 крысах-самцах Вистар (66 глаз) в возрасте 20—23 дней с массой тела 39—41 г на «пролонгированной» модели УФ-индуцированной катаракты. Срок наблюдения составил 10 мес (43 нед).

Все животные были разделены случайным образом на 5 групп: 1-я группа (8 животных) — ежедневное УФ-облучение (УФ); 2-я (контрольная) группа — интактные животные (7 крыс); 3-я группа (6 крыс) — воздействие УФ + инстилляции 5% раствора D-пантетина и N-ацетилкарнозина; 4-я группа (6 крыс) — воздействие УФ + внутрибрюшинная инъекция препарата в дозе 25 мг/кг каждого компонента; 5-я группа (6 крыс) — воздействие УФ + внутрибрюшинная инъекция препарата в дозе 150 мг/кг каждого компонента.

В качестве УФ-источника в диапазоне 280—380 нм были использованы два излучателя ОУФК-01 [12]. УФ-облучение проводили ежедневно в специальной клетке, средняя мощность облучения на уровне пола контролировалась с помощью спектрометра AvaSpec 2048 («Avantes», Нидерланды) и составляла в диапазоне 280—390 нм 51±7 Вт/м², время облучения 15 мин. Спектр излучения лампы в УФ-диапазоне был максимально приближен к солнечному свету.

Облучение γ-лучами проводили однократно в дозе 2 Гр на установке РОКУС-М (Санкт-Петербург) без применения фильтров, в качестве источника излучения использовали ⁶⁰Co. Животные в специальной клетке располагались на расстоянии 70 см от источника излучения, мощность дозы составляла 0,641 Гр/мин. Облучению подвергали все тело животного, величина изодозы равнялась 90%.

Биомикроскопию выполняли на щелевой лампе Opton SL-75 («Opton», Германия), снабженной видеокамерой Mintron MTV-62W1P (Тайвань) на 7-й и 10-й месяцы после начала эксперимента. Развитие катаракты оценивали методом экспертных оценок с использованием следующих шкал:

А) 6-балльная шкала для оценки диффузных помутнений:

0 баллов — прозрачные кортикальные и ядерные структуры хрусталика;

1 балл — незначительное уплотнение под передней капсулой хрусталика, сохранение оптической прозрачности кортикальных слоев и ядра;

2 балла — слабовыраженное диффузное помутнение в ядре, появление зернистости в передних и задних кортикальных слоях;

3 балла — умеренно выраженное диффузное помутнение в ядре, однородное слабовыраженное помутнение в передних и задних кортикальных слоях, незначительное увеличение плотности передней капсулы хрусталика;

4 балла — более выраженное помутнение в области ядра с развитием слоистоподобного помутнения, незначительное увеличение однородного помутнения в передних и задних кортикальных слоях;

5 баллов — выраженное облакоподобное помутнение ядра средней степени выраженности, менее выраженное однородное помутнение в передних и задних кортикальных слоях.

Б) 3-балльная шкала для оценки локальных (ограниченных) помутнений:

1 балл — единичные мелкие ограниченные помутнения;

2 балла — среднее количество ограниченных помутнений различной формы;

3 балла — множественные ограниченные помутнения различной формы и размеров с тенденцией к образованию более крупных конгломератов.

Степень помутнения оценивали слепым методом.

В эксперименте по изучению влияния различных повреждающих факторов на хрусталик в качестве окончательной оценки диффузной или локальной катаракты принимали сумму баллов соответствующей оценки помутнения левого и правого глаз.

Развитие катаракты в эксперименте по изучению антикатарактального эффекта комбинированного препарата оценивали с использованием только 6-балльной шкалы, так как в этой части работы важно было суммарно оценить влияние препарата на развитие катаракты.

Инстилляции и внутрибрюшинные инъекции делали однократно каждый день в течение всего периода наблюдения.

Статистический анализ результатов проводили методами описательной статистики и непараметрическими методами: ранговый однофакторный анализ Краскела—Уоллиса, критерий Коновера, U-критерий Манна—Уитни с поправкой Бонферонни (статистический пакет «Attestat»).

Эксперименты проводили согласно «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приказ министра здравоохранения СССР №1045-73 от 12 августа 1977 г.).

В эксперименте по изучению влияния различных повреждающих факторов на состояние хрусталика на 7-м месяце наблюдения в хрусталиках облученных животных (УФ; γ-лучи; γ-лучи + УФ) были обнаружены различные виды помутнений: диффузные и локальные (точечные, игольчатые и др.) (рис. 1, а, б).

Степень помутнения хрусталиков в исследованных группах, оцененная в баллах, представлена на рис. 2.

При обследовании животных на 10-й месяц степень помутнения хрусталика существенно возросла и также продолжала зависеть от природы действующего повреждающего фактора (рис. 2, б). По степени воздействия эти факторы также можно расположить в ряд: возраст (Ме =2,5 балла), УФ (Ме =5), γ-лучи (Ме =6,5), γ-лучи + УФ (Ме =7,5). На 10-й месяц появились локальные помутнения хрусталика во всех экспериментальных группах. При этом достоверной разницы между группой γ-лучи или γ-лучи + УФ не обнаружено.

Для эксперимента доза γ-лучей, равная 2 Гр, была выбрана потому, что она вызывает образование катаракты средней и малой степени и на этом фоне можно зафиксировать дополнительное влияние УФ-облучения [10, 13].

Для оценки степени катаракты используются как методы экспертных оценок, так и инструментальные методы. В основе метода экспертных оценок, который был использован в данной работе, лежит медианная оценка степени катаракты несколькими экспертами, т.е. эксперты слепым методом (не зная принадлежности животного к той или иной экспериментальной группе) и независимо друг от друга оценивали степень помутнения хрусталиков в баллах, затем из объединенных оценок вычисляли медиану.

Инструментальная оценка степени помутнений хрусталика возможна с помощью микроденситометрии цифровых изображений биомикроскопических оптических срезов хрусталиков, полученных с помощью щелевой лампы либо ее модификации — шеймпфлюг-лампы, при этом степень катаракты выражается в сумме единиц яркости хрусталика [5, 11, 21]. Поскольку метод экспертных оценок дает высокий уровень корреляции с данными денситометрического анализа изображений хрусталика [2, 9], то в данной работе мы использовали метод экспертных оценок.

На 7-й месяц эксперимента быстрее развивается катаракта в группе животных, получавших ежедневное УФ-облучение, в то время как катаракта в группе животных, облученных γ-лучами, развивается медленнее (см. рис. 2). Этот результат хорошо согласуется с полученными ранее данными: динамика развития УФ-индуцированной катаракты описывается логарифмической функцией, в то время как развитие радиационной катаракты имеет некоторый лаг-период [2, 19]. Во всех экспериментальных группах обнаруживаются биомикроскопические изменения хрусталика, однако каких-либо специфических изменений в какой-либо группе обнаружить не удалось.

Хотя ранее и было показано, что радиационная катаракта сопровождается образованием преимущественно заднекортикальных помутнений, более поздние исследования показали, что при такой катаракте помутнения появляются и в других отделах хрусталика, они не отличается от возрастной [16, 20].

Таким образом, полученные результаты показали единую картину развития катаракты при воздействии, казалось бы, столь различных по механизму действия факторов.

Экспериментальное изучение воздействия смеси низкомолекулярных соединений N-ацетилкарнозина и D-пантетина осуществили на более удобной и сопоставимой с клиническим течением возрастной катаракты «пролонгированной» модели УФ-индуцированной катаракты у крыс.

Биомикроскопическое исследование хрусталиков через месяц после начала облучения позволило выявить статистически достоверные различия между 1-й (УФ) и 2-й (контроль) группами (рис. 3).

В основных группах, получавших комбинированный препарат на фоне УФ-облучения, скорость нарастания помутнений в хрусталиках была значительно ниже. Различие между группами УФ-облученных животных и УФ-облученных животных, получавших комбинированный препарат, было достоверно, начиная с 82-го дня эксперимента (p<0,03), в дальнейшем достоверность различий существенно возрастала (p=0,0003). К концу эксперимента, на 313-й день, более выраженный антикатарактальный эффект препаратов был получен в 3-й группе, инстилляция препарата действовала эффективнее, чем инъекции (p=0,002). При последнем наблюдении катаракта в этой группе не отличалась от таковой в контроле (М =4,8 балла). В 4-й и 5-й группах в конце эксперимента степень помутнения хрусталика была несколько выше (М =6,43 и 6,8 балла соответственно), но также достоверно отличалась от группы УФ (М =10 баллов).

Таким образом, можно заключить, что и процесс старения как эндогенный фактор и УФ- и радиационное облучение как экзогенные физические факторы вызывают помутнения хрусталика одинакового вида. При этом специфичность воздействия этих факторов выражается лишь в степени повреждения. По степени повреждающей способности исследованные нами факторы могут быть расположены в следующий ряд по возрастанию: старение → УФ → γ-лучи → γ-лучи + УФ.

Применение комбинированного шапероноподобного препарата, состоящего из смеси низкомолекулярных соединений (N-ацетилкарнозин и D-пантетин) в соотношении 1:1 в виде инстилляций в глаза и внутрибрюшинных инъекций позволяет замедлить процессы формирования УФ-катаракты invivo.

Полученные результаты указывают на возможность создания нового класса шапероноподобных антикатарактальных препаратов — соединений, обладающих способностью подобно α-кристаллину предупреждать денатурацию и агрегацию белков хрусталика.