Аветисов С.Э.

ФГБУ "Научно-исследовательский институт глазных болезней" РАМН, Москва

Шеремет Н.Л.

ФГБУ "НИИ глазных болезней" РАМН

Муранов К.О.

ФГБУ науки "Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля" РАН, Москва; Объединенный институт ядерных исследований, Дубна

Полянский Н.Б.

ФГБУ науки "Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля" РАН, Москва; Объединенный институт ядерных исследований, Дубна

Банник К.И.

Department of Radiotherapy, University Hospital, Essen, Germany

Курова В.C.

ФГБУ "НИИ глазных болезней" РАМН

Полунин Г.С.

ФГБУ "НИИ глазных болезней" РАМН

Островский М.А.

ФГБУ науки "Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля" РАН, Москва; Объединенный институт ядерных исследований, Дубна

Экспериментальное изучение влияния повреждающих факторов и шапероноподобных препаратов на катарактогенез

Журнал: Вестник офтальмологии. 2013;129(5): 155-159

Просмотров : 7

Загрузок :

Как цитировать

Аветисов С. Э., Шеремет Н. Л., Муранов К. О., Полянский Н. Б., Банник К. И., Курова В. C., Полунин Г. С., Островский М. А. Экспериментальное изучение влияния повреждающих факторов и шапероноподобных препаратов на катарактогенез. Вестник офтальмологии. 2013;129(5):155-159.

Авторы:

Аветисов С.Э.

ФГБУ "Научно-исследовательский институт глазных болезней" РАМН, Москва

Все авторы (8)

Катаракта — основная причина слабовидения и слепоты в мире [18, 19]. Несмотря на впечатляющие успехи офтальмохирургии, проблема медикаментозного лечения этого заболевания остается чрезвычайно актуальной.

Исследования молекулярных механизмов поддержания прозрачности и возникновения помутнения хрусталика позволили нам предложить единый механизм возникновения катаракты [4, 8, 14]. Последовательность патологических событий может быть представлена следующим образом:

— с возрастом нарушается процесс пролиферации эпителиальных клеток хрусталика. Это приводит как к их гибели, так и к нарушению морфогенеза вновь образуемых волоконных клеток;

— под воздействием кислорода, проникающего в хрусталик через поврежденный эпителиальный слой, нарушается нормальный процесс деградации клеточных органелл, в первую очередь митохондрий. Вследствие этого в кортикальной области хрусталика появляются клетки, содержащие митохондрии;

— в присутствии проникшего в хрусталик кислорода митохондрии вырабатывают его активные формы (супероксиданион-радикал, синглетный кислород и т.д.), которые атакуют хрусталиковые белки, в основном γ-кристаллин;

— окисленные белки легко денатурируют и агрегируют, что нарушает гомогенное распределение белка и приводит к появлению в цитоплазме волоконных клеток микрообластей с различными значениями коэффициента оптического преломления. В результате усиливается светорассеяние — хрусталик мутнеет.

При этом различные по природе катарактогенные факторы (ультрафиолетовые —УФ-лучи, радиоактивное излучение, стероидные препараты и др.) лишь ускоряют этот процесс. Из всего этого следует, что, препятствуя денатурации и агрегации белка, можно затормозить и развитие катаракты.

Шапероноподобный белок α-кристаллин противостоит денатурации и агрегации белков в хрусталике, однако с возрастом его активность снижается и возникает катаракта [17]. Действительно, применение низкомолекулярных соединений, обладающих шапероноподобной активностью и способных тормозить процесс агрегации белка, достоверно задерживало развитие помутнения хрусталика [1—3, 6, 7, 16].

Цель настоящей работы — сравнительное исследование различных повреждающих факторов, влияющих на состояние хрусталика, и изучение воздействия комбинации шапероноподобных препаратов (N-ацетилкарнозина и D-пантетина) на УФ-индуцированную катаракту в экспериментах на животных.

Материал и методы

Для эксперимента по изучению влияния различных повреждающих факторов на состояние хрусталика были отобраны 80 мышей-самцов гибрид F1 (C57Black/CBA) в возрасте 2 мес без видимой офтальмопатологии. Срок наблюдения за животными составил 10 мес. Все животные были разделены на 4 рандомизированные группы. Животных трех групп подвергали следующим воздействиям: 1-я группа — ежедневное УФ-облучение (УФ); 2-я группа — однократное облучение γ-лучами в дозе 2 Гр всего тела животного (γ-лучи); 3-я группа — однократное облучение γ-лучами в дозе 2 Гр + ежедневное УФ-облучение (γ-лучи + УФ); 4-я группа служила контролем возрастных изменений хрусталика (К).

Эксперимент по изучению антикатарактального воздействия комбинированного препарата (N-ацетилкарнозин и D-пантетин) проведен на 33 крысах-самцах Вистар (66 глаз) в возрасте 20—23 дней с массой тела 39—41 г на «пролонгированной» модели УФ-индуцированной катаракты. Срок наблюдения составил 10 мес (43 нед).

Все животные были разделены случайным образом на 5 групп: 1-я группа (8 животных) — ежедневное УФ-облучение (УФ); 2-я (контрольная) группа — интактные животные (7 крыс); 3-я группа (6 крыс) — воздействие УФ + инстилляции 5% раствора D-пантетина и N-ацетилкарнозина; 4-я группа (6 крыс) — воздействие УФ + внутрибрюшинная инъекция препарата в дозе 25 мг/кг каждого компонента; 5-я группа (6 крыс) — воздействие УФ + внутрибрюшинная инъекция препарата в дозе 150 мг/кг каждого компонента.

В качестве УФ-источника в диапазоне 280—380 нм были использованы два излучателя ОУФК-01 [12]. УФ-облучение проводили ежедневно в специальной клетке, средняя мощность облучения на уровне пола контролировалась с помощью спектрометра AvaSpec 2048 («Avantes», Нидерланды) и составляла в диапазоне 280—390 нм 51±7 Вт/м2, время облучения 15 мин. Спектр излучения лампы в УФ-диапазоне был максимально приближен к солнечному свету.

Облучение γ-лучами проводили однократно в дозе 2 Гр на установке РОКУС-М (Санкт-Петербург) без применения фильтров, в качестве источника излучения использовали 60Co. Животные в специальной клетке располагались на расстоянии 70 см от источника излучения, мощность дозы составляла 0,641 Гр/мин. Облучению подвергали все тело животного, величина изодозы равнялась 90%.

Биомикроскопию выполняли на щелевой лампе Opton SL-75 («Opton», Германия), снабженной видеокамерой Mintron MTV-62W1P (Тайвань) на 7-й и 10-й месяцы после начала эксперимента. Развитие катаракты оценивали методом экспертных оценок с использованием следующих шкал:

А) 6-балльная шкала для оценки диффузных помутнений:

0 баллов — прозрачные кортикальные и ядерные структуры хрусталика;

1 балл — незначительное уплотнение под передней капсулой хрусталика, сохранение оптической прозрачности кортикальных слоев и ядра;

2 балла — слабовыраженное диффузное помутнение в ядре, появление зернистости в передних и задних кортикальных слоях;

3 балла — умеренно выраженное диффузное помутнение в ядре, однородное слабовыраженное помутнение в передних и задних кортикальных слоях, незначительное увеличение плотности передней капсулы хрусталика;

4 балла — более выраженное помутнение в области ядра с развитием слоистоподобного помутнения, незначительное увеличение однородного помутнения в передних и задних кортикальных слоях;

5 баллов — выраженное облакоподобное помутнение ядра средней степени выраженности, менее выраженное однородное помутнение в передних и задних кортикальных слоях.

Б) 3-балльная шкала для оценки локальных (ограниченных) помутнений:

1 балл — единичные мелкие ограниченные помутнения;

2 балла — среднее количество ограниченных помутнений различной формы;

3 балла — множественные ограниченные помутнения различной формы и размеров с тенденцией к образованию более крупных конгломератов.

Степень помутнения оценивали слепым методом.

В эксперименте по изучению влияния различных повреждающих факторов на хрусталик в качестве окончательной оценки диффузной или локальной катаракты принимали сумму баллов соответствующей оценки помутнения левого и правого глаз.

Развитие катаракты в эксперименте по изучению антикатарактального эффекта комбинированного препарата оценивали с использованием только 6-балльной шкалы, так как в этой части работы важно было суммарно оценить влияние препарата на развитие катаракты.

Инстилляции и внутрибрюшинные инъекции делали однократно каждый день в течение всего периода наблюдения.

Статистический анализ результатов проводили методами описательной статистики и непараметрическими методами: ранговый однофакторный анализ Краскела—Уоллиса, критерий Коновера, U-критерий Манна—Уитни с поправкой Бонферонни (статистический пакет «Attestat»).

Эксперименты проводили согласно «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приказ министра здравоохранения СССР №1045-73 от 12 августа 1977 г.).

Результаты и обсуждение

В эксперименте по изучению влияния различных повреждающих факторов на состояние хрусталика на 7-м месяце наблюдения в хрусталиках облученных животных (УФ; γ-лучи; γ-лучи + УФ) были обнаружены различные виды помутнений: диффузные и локальные (точечные, игольчатые и др.) (рис. 1, а, б).

Рисунок 1. Биомикроскопическая картина хрусталиков мышей (а, б). 1 — диффузные помутнения в ядре хрусталика; 2 — локальные точечные помутнения в задних кортикальных слоях хрусталика.
Диффузные помутнения формировались в ядерных и кортикальных слоях хрусталика, однако были более выражены в ядре. Локальные помутнения выявлялись преимущественно в задних кортикальных отделах хрусталика. С меньшей частотой они встречались в ядре, а в единичных случаях — в передних кортикальных слоях. В контрольной группе у некоторых животных отмечалось незначительное уплотнение кортикальных слоев под передней капсулой хрусталика.

Степень помутнения хрусталиков в исследованных группах, оцененная в баллах, представлена на рис. 2.

Рисунок 2. Степень выраженности помутнений хрусталика (медиана, 99% квантиль) у мышей с возрастом, под действием УФ-облучения и радиации, а также комбинации этих факторов на 7-й (а) и 10-й (б) месяцы после начала эксперимента.
Данные представлены в виде медианы (Ме) с указанием 1% и 99% квантиля. Статистический анализ с помощью непараметрического теста Краскела—Уоллиса показал высокую достоверность различий диффузных (р<0,001) и локальных (р<0,01) помутнений хрусталика между всеми группами как на 7-й, так и на 10-й месяцы исследования. Обследование животных на 7-м месяце показало, что УФ-, γ-лучи и комбинация этих факторов вызывают достоверное образование диффузных помутнений хрусталика. При этом локальные помутнения возникают лишь при действии γ-лучей или γ-лучей в комплексе с УФ (рис. 2, а). Степень диффузного помутнения зависела от действующего фактора. По силе воздействия факторы можно расположить в следующий ряд: γ-лучи (Ме =1,5), УФ (Ме =2,5 балла), γ-лучи + УФ (Ме =4,0). Следует, однако, отметить, что разница в степени помутнения между группами УФ и γ-лучи + УФ оказалась недостоверной (р=0,1).

При обследовании животных на 10-й месяц степень помутнения хрусталика существенно возросла и также продолжала зависеть от природы действующего повреждающего фактора (рис. 2, б). По степени воздействия эти факторы также можно расположить в ряд: возраст (Ме =2,5 балла), УФ (Ме =5), γ-лучи (Ме =6,5), γ-лучи + УФ (Ме =7,5). На 10-й месяц появились локальные помутнения хрусталика во всех экспериментальных группах. При этом достоверной разницы между группой γ-лучи или γ-лучи + УФ не обнаружено.

Для эксперимента доза γ-лучей, равная 2 Гр, была выбрана потому, что она вызывает образование катаракты средней и малой степени и на этом фоне можно зафиксировать дополнительное влияние УФ-облучения [10, 13].

Для оценки степени катаракты используются как методы экспертных оценок, так и инструментальные методы. В основе метода экспертных оценок, который был использован в данной работе, лежит медианная оценка степени катаракты несколькими экспертами, т.е. эксперты слепым методом (не зная принадлежности животного к той или иной экспериментальной группе) и независимо друг от друга оценивали степень помутнения хрусталиков в баллах, затем из объединенных оценок вычисляли медиану.

Инструментальная оценка степени помутнений хрусталика возможна с помощью микроденситометрии цифровых изображений биомикроскопических оптических срезов хрусталиков, полученных с помощью щелевой лампы либо ее модификации — шеймпфлюг-лампы, при этом степень катаракты выражается в сумме единиц яркости хрусталика [5, 11, 21]. Поскольку метод экспертных оценок дает высокий уровень корреляции с данными денситометрического анализа изображений хрусталика [2, 9], то в данной работе мы использовали метод экспертных оценок.

На 7-й месяц эксперимента быстрее развивается катаракта в группе животных, получавших ежедневное УФ-облучение, в то время как катаракта в группе животных, облученных γ-лучами, развивается медленнее (см. рис. 2). Этот результат хорошо согласуется с полученными ранее данными: динамика развития УФ-индуцированной катаракты описывается логарифмической функцией, в то время как развитие радиационной катаракты имеет некоторый лаг-период [2, 19]. Во всех экспериментальных группах обнаруживаются биомикроскопические изменения хрусталика, однако каких-либо специфических изменений в какой-либо группе обнаружить не удалось.

Хотя ранее и было показано, что радиационная катаракта сопровождается образованием преимущественно заднекортикальных помутнений, более поздние исследования показали, что при такой катаракте помутнения появляются и в других отделах хрусталика, они не отличается от возрастной [16, 20].

Таким образом, полученные результаты показали единую картину развития катаракты при воздействии, казалось бы, столь различных по механизму действия факторов.

Экспериментальное изучение воздействия смеси низкомолекулярных соединений N-ацетилкарнозина и D-пантетина осуществили на более удобной и сопоставимой с клиническим течением возрастной катаракты «пролонгированной» модели УФ-индуцированной катаракты у крыс.

Биомикроскопическое исследование хрусталиков через месяц после начала облучения позволило выявить статистически достоверные различия между 1-й (УФ) и 2-й (контроль) группами (рис. 3).

Рисунок 3. Влияние комбинированного препарата на развитие УФ-индуцированной катаракты у крыс ( метод экспертных оценок). Данные представлены в виде среднего значения по группе с указанием 95% доверительного интервала.
Данные представлены в виде среднего значения (М) по группе с указанием 95% доверительного интервала. Достоверность различий сохранялась в течение всего периода наблюдения. К концу эксперимента в группе УФ наблюдалось формирование средней степени выраженности однородного облакоподобного помутнения хрусталика, более интенсивного в ядерных слоях (М =10 баллов), в то время как в контрольной группе хрусталик в значительно большей степени сохранял свою прозрачность (М =4,8 балла).

В основных группах, получавших комбинированный препарат на фоне УФ-облучения, скорость нарастания помутнений в хрусталиках была значительно ниже. Различие между группами УФ-облученных животных и УФ-облученных животных, получавших комбинированный препарат, было достоверно, начиная с 82-го дня эксперимента (p<0,03), в дальнейшем достоверность различий существенно возрастала (p=0,0003). К концу эксперимента, на 313-й день, более выраженный антикатарактальный эффект препаратов был получен в 3-й группе, инстилляция препарата действовала эффективнее, чем инъекции (p=0,002). При последнем наблюдении катаракта в этой группе не отличалась от таковой в контроле (М =4,8 балла). В 4-й и 5-й группах в конце эксперимента степень помутнения хрусталика была несколько выше (М =6,43 и 6,8 балла соответственно), но также достоверно отличалась от группы УФ (М =10 баллов).

Таким образом, можно заключить, что и процесс старения как эндогенный фактор и УФ- и радиационное облучение как экзогенные физические факторы вызывают помутнения хрусталика одинакового вида. При этом специфичность воздействия этих факторов выражается лишь в степени повреждения. По степени повреждающей способности исследованные нами факторы могут быть расположены в следующий ряд по возрастанию: старение → УФ → γ-лучи → γ-лучи + УФ.

Применение комбинированного шапероноподобного препарата, состоящего из смеси низкомолекулярных соединений (N-ацетилкарнозин и D-пантетин) в соотношении 1:1 в виде инстилляций в глаза и внутрибрюшинных инъекций позволяет замедлить процессы формирования УФ-катаракты invivo.

Полученные результаты указывают на возможность создания нового класса шапероноподобных антикатарактальных препаратов — соединений, обладающих способностью подобно α-кристаллину предупреждать денатурацию и агрегацию белков хрусталика.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail