Оценка маркеров дисфункции почечного трансплантата у пациентов с сахарным диабетом 1-го типа после трансплантации почки и сочетанной трансплантации почки и поджелудочной железы

ДН - диабетическая нефропатия

МИИ - многократные инъекции инсулина

ППИИ - подкожная инфузия инсулина с помощью инсулинового дозатора

ПТГ - паратиреоидный гормон

СД-1 - сахарный диабет 1-го типа

СКФ - скорость клубочковой фильтрации

СТПЖиП - сочетанная трансплантация почки и поджелудочной железы

ТП - трансплантация почки

ХДТ - хроническая дисфункция трансплантата

ЦМВИ - цитомегаловирусная инфекция

Cys C - цистатин С

IL-18 - интерлейкин-18

KIM-1 - молекула повреждения почек 1-го типа

MMP-9 - матриксные металлопротеиназы

NGAL - липокалин, ассоциированный с желатиназой нейтрофилов

OPN - остеопонтин

TGF-β1 - трансформирующий β1-фактор роста

VEGF - фактор роста эндотелия сосудов

Хроническая дисфункция трансплантата (ХДТ) - предвестник большинства потерь трансплантатов. Несмотря на впечатляющее влияние современных иммуносупрессоров и антибактериальной терапии на снижение частоты острых, а также хронических потерь трансплантатов, основные риски, представляющие опасность для реципиентов почечного трансплантата, являются смерть от сосудистой патологии, онкология, инфекционные заболевания и потеря аллотрансплантата вследствие ХДТ [1]. По данным NKF-K/DOQI (National Kidney Foundation’s Kidney Disease Outcomes Quality Initiative), определение клиренса креатинина и скорости клубочковой фильтрации (СКФ) в настоящее время служит одним из наиболее надежных показателей функции почек [2] и долгосрочной выживаемости трансплантата [3]. Поскольку эти стандартные неинвазивные методы не всегда чувствительны и специфичны на ранних стадиях повреждения почечной ткани и повышение уровня данных маркеров занимает длительный период между повреждением и клиническими, биохимическими проявлениями, а пункционная биопсия трансплантата ассоциирована с различными осложнениями [4], все большее внимание уделяется поиску новых неинвазивных маркеров [5] для определения функции, раннего поражения, а также оценки отдаленных исходов и прогнозирования отторжения нефротрансплантата. За последние несколько лет разработаны молекулярно-биологические методы, успешно позволяющие идентифицировать различные типы биомаркеров, использующихся для мониторинга состояния почечного трансплантата [6, 7].

Цель исследования - изучить маркеры дисфункции почечного трансплантата у больных сахарным диабетом 1-го типа (СД-1) после трансплантации почки (ТП) и сочетанной трансплантации почки и поджелудочной железы (СТПЖиП).

В исследование включили 76 больных, их них 41 пациент с СД-1 после изолированной ТП (1-я группа: 21 пациент на постоянной подкожной инфузией инсулина с помощью инсулинового дозатора - ППИИ), 20 человек на многократных инъекциях инсулина - МИИ (2-я группа), 20 человек после успешно проведенной СТПЖиП (3-я группа), группа контроля из 15 человек с длительным течением СД-1 без диабетической нефропатии - ДН (4-я группа). Пациенты сопоставимы по полу, возрасту и длительности СД-1. Всем пациентам проводили общеклиническое и биохимические исследование крови и мочи с оценкой функции почек (определение уровня креатинина в сыворотке крови, расчет СКФ по формуле CKD-EPI, анализ мочи на экскрецию альбумина, отношение альбумин/креатинин), показателей фосфорно-кальциевого обмена (кальций, фосфор, фосфорно-кальциевое произведение, паратиреоидный гормон - ПТГ, витамин D), липидного состава крови (общий холестерин, холестерин липопротеидов низкой плотности, холестерин липопротеидов высокой плотности, триглицериды), компенсации углеводного обмена (гликированный гемоглобин - HbA_1c).

Всем пациентам, включенным в исследование, определяли основные биомаркеры дисфункции почечного трансплантата с помощью стандартных наборов фирм «eBioscience» - transforming grouth factor β₁ - трансформирующий β₁-фактор роста - TGF-β₁, VEGF - vascular endothelial growth factor - фактор роста эндотелия сосудов - VEGF-А (сыворотка), матриксные металлопротеиназы - MMP-9, интерлейкин-18 - IL-18, IP-10 (моча); «BioVendor» - Cystatin C (Cys C, сыворотка, моча); BCM - липокалин, ассоциированный с желатиназой нейтрофилов - neutrophil gelatinase-associated lipocalin - NGAL (моча), USCN - молекула повреждения почек 1-го типа - kidney injury molecule-1 - KIM-1 (моча), Подоцин (моча), Нефрин (моча), Остеопонтин (OPN, сыворотка). Образцы крови брали натощак, исследовали утреннюю порцию мочи. Мочу центрифугировали при угловой скорости 3000 об/мин, кровь - при температуре 4 °С. Исследование выполнено на базе лаборатории клинической биохимии ФГБУ «Эндокринологический научный центр» Минздрава России.

Для осуществления статистического анализа полученных данных использовали статистический пакет Statistica («StatSoft Version 8.0», США). Наличие и характер связей между исследуемыми показателями определяли с помощью непараметрического корреляционного анализа по Спирмену. Достоверной считали корреляцию при p<0,05. Результаты представлены в виде медианы (25-й и 75-й перцентили). Для оценки значимости различий между исследуемыми группами использовали критерий Манна-Уитни.

Клиническая характеристика обследованных больных СД-1 (ТП фоне на ППИИ и МИИ), СТПЖиП и лиц без ДН представлена в табл. 1.

У пациентов, включенных в исследование, констатированы длительное течение СД-1, отсутствие компенсации углеводного обмена на всем протяжении заболевания, раннее развитие диабетических осложнений (микро- и макроангиопатий), поздняя диагностика ДН с несвоевременным назначением нефропротективной терапии, экстренным началом терапии, замещающей функцию почек. Тем не менее ТП у данных пациентов обеспечила улучшение качества жизни, отказ от диализа, нормализацию функции почек, параметров минерально-костных нарушений, анемии, артериального давления, а в случае с сочетанием трансплантацией поджелудочной железы - независимость от внешнего инсулина.

Все 4 группы сопоставимы по полу, возрасту, длительности основного заболевания. СКФ у пациентов после трансплантации в основном соответствовала стадии С2 хронической болезни почек, но была значительно ниже, чем в группе без Д.Н. Альбуминурия также не различалась в первых 3 группах (в основном категория А1). Все пациенты после трансплантации получали трехкомпонентную иммуносупрессивную терапию, антиагрегантную и антигипертензивную терапию (преимущественно из группы ингибиторов ангиотензинпревращающего фермента и блокаторов рецепторов ангиотензина II), гиполипидемическую терапию.

Доноры в группе СТПЖиП являлись практически «идеальными» с диагностированной смертью головного мозга и наименьшим периодом холодовой ишемии трансплантата со средним возрастом 29 лет. Все пациенты были совместимы по системе АВ0. У всех выявлена отрицательная проба (кросс-матч) (табл. 2).

Проанализированы маркеры повреждения клубочков и канальцевого аппарата почек, продукты обмена внеклеточного матрикса, факторы роста и иммуновоспалительные факторы (табл. 3).

Уровень Cys C в сыворотке крови в 3 группах пациентов после трансплантации оказался значительно выше, чем в группе контроля, что, возможно, свидетельствует о нарушении функции почек даже в группе пациентов после СТПЖиП. Самым высоким этот показатель оказался в группе пациентов, получающих МИИ. Закономерно нами выявлена положительная корреляция с концентрацией креатинина в крови (r=0,45; р<0,05) с альбуминурией (r=0,40; р<0,05) и отношением альбумин/креатинин (r=0,36; р<0,05), а также отрицательная корреляция со СКФ (r=– 0,37; р<0,05) (рис. 1), что согласуется с данными литературы [8].

Примечательна определенная в настоящем исследовании прямая корреляция между уровнем Cys C в сыворотке крови и наличием отторжения нефротрансплантата в анамнезе у пациентов после трансплантации (r=0,27; р<0,05). По данным литературы, эпизоды острого отторжения в первые 6 мес после трансплантации повышают риск его потери в отдаленный период до 50% [9].

При сравнении уровня маркера Cys C в моче в группе пациентов, перенесших трансплантацию, между собой и с группой контроля статистически значимых различий не выявлено. Однако определена прямая корреляция с уровнем креатинина в крови (r=0,35; р<0,05) и отношением альбумин/креатинин (r=0,30; р<0,05) в группе пациентов после трансплантации, отрицательная с Cys C в крови (r=–0,30; р<0,05) (см. рис. 1).

Данный маркер в нашем исследовании ассоциирован с наличием мочевой инфекции у пациентов, перенесших трансплантацию (r=0,38; p<0,05). Следует отметить, что наличие пиелонефрита ассоциировано с интерстициальным поражением почечного аллотрансплантата [10] и данный процесс может активировать аутоиммунный ответ реципиента на донорский орган, а впоследствии способствовать острому или хроническому отторжению [11].

Другой очень чувствительный и ранний маркер повреждения почек - NGAL; у пациентов, перенесших трансплантацию, его уровень в моче также выше, чем в группе контроля. Этот показатель оказался наиболее высоким в группе пациентов с режимом МИИ. Экскреция NGAL возрастала пропорционально с прогрессированием уровня альбуминурии (r=0,35; p<0,05) и отношения альбумин/креатинин (r=0,40; p<0,05) (рис. 2), что согласуется с результатами других исследований [12].

По данным ряда источников, NGAL является также маркером системного воспаления [13]. Нами получена умеренная корреляция уровня маркера NGAL в группе пациентов после трансплантации с пиелонефритом трансплантата (r=0,46; p<0,05). Одной из возможных причин в развитии пиелонефрита у данных пациентов могла быть урогенитальная форма автономной невропатии, которая коррелировала с уровнем NGAL (r=0,33; p<0,05).

М. Timmeren и соавт. [14] показали, что KIM-1, определяемая в диагностически значимых количествах в моче при повреждении эпителиальных клеток почек, является независимым предиктором потери аллотрансплантата. Повышенный уровень маркера ассоциирован с протеинурией, возрастом донора и низким клиренсом креатинина. Известно, что возраст донора достоверно коррелирует с высокой частотой формирования ХДТ [15]. В нашем исследовании мы обнаружили, что в группе пациентов, перенесших трансплантацию, высокий уровень КIM-1 коррелировал с более старшим возрастом донора (r=0,30; p<0,05) (рис. 3), определяющим сниженную массу действующих нефронов, способных вызывать недостаточность трансплантата [15]. Кроме того, исследуемый показатель отрицательно коррелировал с различием по СКФ в разных группах (r=–0,27; p<0,05).

Развитие подоцитурии рассматривается в качестве маркера повреждения почечного фильтра. При этом уровень данного маркера в группе контроля оказался наименьшим, что соответствовало референсным показателям для данной категории больных без Д.Н. Следует обратить внимание на достоверно повышенный уровень почечного маркера в группе СТПЖиП по сравнению с группой ТП на фоне ППИИ. Возможна связь такого повышения с более частым осложнением иммуносупрессивной терапии в группе СТПЖиП (r=0,44; p<0,05) по сравнению с группой больных с изолированной ТП (r=0,32; p<0,05). Уровень подоцина напрямую ассоциирован с концентрацией креатинина в крови (r=0,35; p<0,05) и обратно пропорционален СКФ (r=–0,29; p<0,05) (рис. 4). Аналогичные данные получены в исследовании J. Pippin и соавт. [16].

Подобных результатов, как при подоцитурии, по уровню экскреции нефрина (основного специфического белка подоцитов) нами не получено.

В настоящее время TGF-β рассматривается в качестве одного из ключевых медиаторов повреждения почек. Развитие фиброза при ДН связано с повышенным уровнем профиброгенного ТGF-β [17]. Средние концентрации ТGF-β в нашем исследовании не различались между группами. Однако полученные данные продемонстрировали прямую корреляцию с длительностью СД (r=0,25; p<0,05) в группах пациентов после трансплантации и слабую корреляцию с уровнем HbA_1c через 6 мес после начала исследования (r=0,26; p<0,05) в 1-й и 2-й группах (рис. 5). Однако следует отметить, что при оценке различий по уровню креатинина и СКФ у пациентов, перенесших трансплантацию, уровень ТGF-β ассоциирован со снижением СКФ (r=0,40; p<0,05).

Концентрация VEGF-A, связанного с дисфункцией эндотелия и почечной фильтрацией, значительно выше у пациентов после ТП как в группе получающих ППИИ, так и МИИ, по сравнению с таковой в группе СТПЖиП. При оценке данного фактора роста получена положительная ассоциация с возрастом донора (r=0,29; p<0,05) (рис. 6), а также отношением альбумин/креатинин (r=0,36; p<0,05).

В нашем исследовании концентрация MMP-9 в моче достоверно выше в группе пациентов с ТП на фоне МИИ. Однако ассоциация между концентрацией ММР-9 и наличием альбуминурии у наших пациентов не зарегистрирована. Умеренная корреляция прослеживалась в группе пациентов после трансплантации между уровнем ММР-9 и длительностью проведенного диализа в анамнезе (r=0,30; p<0,05), а также наличием атеросклероза нижних конечностей (r=0,36; p<0,05), в развитии и прогрессировании которого MMP играет важную роль [18].

У здоровых лиц уровень IL-18 в моче практически не определяется и повышается лишь при повреждении почечной ткани [18]. Следы маркера IL-18 определялись преимущественно в группе больных после СТПЖиП. Вероятно, это обусловлено наличием умеренной корреляции с преобладанием цитомегаловирусной инфекции (ЦМВИ) в анамнезе у данных больных (r=0,54; p<0,05). Полученные нами результаты согласуются с данными зарубежной литературы, согласно которым у реципиентов СТПЖиП риск развития ЦМВИ существенно выше, чем у пациентов после ТП [19].

Недавно проведенные исследования показали, что уровень OPN повышается при ишемическом и реперфузионном повреждении почечной ткани [20], отторжении нефротрансплантата, остром повреждении почек [21], а также является надежным предиктором развития ДН, сердечно-сосудистых осложнений и смерти у пациентов с СД-1 [22]. Анализ OPN показал его статистически значимое увеличение у пациентов, перенесших СТПЖиП, получающих МИИ, в отличие от лиц с изолированной ТП на фоне ППИИ и группой контроля. В группе пациентов после трансплантации определены положительные корреляции уровня OPN с пиелонефритом (r=0,39; p<0,05), длительностью холодовой ишемией почечного аллотрансплантата (r=0,31; p<0,05), что подтверждает повышение уровня данного маркера при повреждении почечной ткани [23]. Высокий уровень OPN в сыворотке слабо коррелировал с проявлениями синдрома диабетической стопы (r=0,25; p<0,05) у пациентов, перенесших трансплантацию, что согласуется с данными ранее проведенного исследования у пациентов с СД-1 [22]. Определена тесная взаимосвязь биомаркера и атеросклероза нижних конечностей (r=0,34; p<0,05), а также отрицательная корреляция с концентрацией липопротеидов высокой плотности ЛПВП у пациентов после трансплантации (r=–0,29; р<0,05).

У пациентов после трансплантации выявлена умеренная положительная корреляция уровня OPN с наличием вторичного гиперпаратиреоза (r=0,27; р<0,05), который, безусловно, наблюдается у пациентов с ХБП. J. Lorenzen и соавт. [24] в своем исследовании оценивали влияние OPN на появление микрокальцинатов почечного аллотрансплантата в связи с гиперпаратиреозом при прогрессировании ХДТ.

Таким образом, выявлено статистически значимое повышение уровня маркеров дисфункции почек в группе пациентов, перенесших трансплантацию, по сравнению с группой контроля, отражающее персистирующий процесс повреждения микроструктур почек, несмотря на значительное улучшение состояния. При этом следует отметить, что некоторые маркеры статистически значимо повышены в группе пациентов, перенесших СТПЖиП. Эугликемия, являясь важным приобретением пациентов после операции, остается лишь одним фактором стабильности нефротранслантата. Без должного внимания к остальным многочисленным факторам (артериальное давление, липидный состав крови, анемия, длительность диализного периода, качество донорского материала, выраженность других осложнений СД, состояние сердечно-сосудистой системы, стабильность концентрации иммуносупрессивных препаратов, осложнения иммуносупрессивной терапии, сопутствующие инфекции) будет формироваться неблагоприятный прогноз. Необходимо ориентировать пациентов этой группы, а также лиц с изолированной ТП на режим управления всеми факторами сохранения функции почек, стабилизации поздних осложнений СД.

Конфликт интересов отсутствует.