АБП — антибактериальные препараты

АБТ — антибактериальная терапия

БА — бронхиальная астма

ГКС — глюкокортикостероиды

ИГКС — ингаляционные ГКС

КДБА — короткодействующие β2-агонисты

ОФВ1 — объем форсированного выдоха за 1-ю секунду

ПЦР — полимеразная цепная реакция

СГКС — системные ГКС

ТШХ — тест с 6-минутной ходьбой

ФЖЕЛ — форсированная жизненная емкость легких

ХОБЛ — хроническая обструктивная болезнь легких

mMRC — Модифицированная шкала оценки нарушения дыхания

SatО2 — насыщение артериальной крови кислородом

Выраженные вентиляционные нарушения у больных хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ) и бронхиальной астмой (БА) представляют сильный фактор риска бактериальной контаминации дыхательных путей.

Streptococcus pneumoniae — один из наиболее часто выявляемых микроорганизмов, идентифицируемых в дыхательных путях пациентов с ХОБЛ даже в стабильный период без эпизодов обострений и антибиотикотерапии за предшествующие 12 мес [1]. D. Garcha и соавт. [2] указывают на то, что более выраженная контаминация дыхательных путей S. pneumoniae наряду с Haemophilus influenzae и Moraxella catarrhalis вне обострения ассоциирована с более выраженным ограничением скорости воздушного потока — со значительным уменьшением объема форсированного выдоха за 1-ю секунду — ОФВ1 (r=–0,299; p=0,033). Наиболее частой причиной обострений ХОБЛ служит трансформация бактериальной контаминации в инфекционный процесс, что связывают с усугублением обструкции бронхов, ухудшением течения и дальнейшим прогрессированием заболевания [3].

Роль микроорганизмов в патогенезе БА неясна. По результатам бактериологического исследования мазков слизистой оболочки гипофарингеальной области от 321 ребенка в возрасте 1 мес у 21% детей обнаружены S. pneumoniae, H. influenzae, M. catarrhalis, при этом колонизация одним или несколькими из этих микроорганизмов в значительной степени ассоциирована как с наличием стойких сухих хрипов у детей первых 5 лет жизни, так и с распространенностью диагностированной БА [4]. Часто бактериальная инфекция дыхательных путей обсуждается как фактор, провоцирующий обострения БА и/или служащий причиной сохранения симптомов заболевания. В ряде исследований показано наличие связи между хронической бактериальной инфекцией дыхательных путей и тяжестью БА, а также между бактериальными инфекциями и обострениями болезни [5]. Кроме того, с контаминацией бронхиального дерева S. pneumoniaе, H. influenzae, Klebsiella pneumonia и M. catarrhalis связывают ряд случаев отсутствие достижения контроля БА на фоне базисной терапии [6].

В связи с неоднозначностью вклада бактериальной инфекции в развитие БА, относительно низкой частоты развития зависимых от инфекции обострений БА и отсутствием убедительных данных, подтверждающих рациональность применения антибактериальных препаратов (АБП) при БА, их место в лечении пациентов данной категории остается ограниченным. В отличие от БА целесообразность антибиотикотерапии обострения ХОБЛ более очевидна при наличии соответствующих критериев бактериальной инфекции. Так, назначение антибиотиков широкого спектра действия на фоне обострения ХОБЛ показано при сочетании усиливающихся одышки и кашля с отделением вязкой, увеличивающейся в объеме мокроты, особенно при изменении ее цвета — появлении признаков гнойной мокроты [7].

Следует отметить, что рекомендации по эмпирической антибактериальной терапии (АБТ) учитывают значение пневмококковой инфекции в развитии обострений ХОБЛ и предполагают назначение антибиотиков, обладающих в том числе антипневмококковой активностью (β-лактамные антибиотики, макролиды и респираторные фторхинолоны). При этом применение респираторных фторхинолонов показано при осложненном обострении ХОБЛ, что обусловлено наличием так называемых модифицируемых факторов риска формирования резистентности микроорганизмов. Для пневмококков такими факторами служат возраст пациента старше 65 лет, терапия β-лактамами в течение последних 3 мес, алкоголизм, иммуносупрессия (включая терапию глюкокортикостероидами — ГКС), наличие нескольких сопутствующих заболеваний [7]. В настоящее время устойчивые к макролидам и пенициллинам стрептококки встречаются в Европе примерно в 30% случаев [8], в России — в 5,6% [9].

Ввиду того что сложно морфологически отличить S. pneumoniae от других α-гемолитических (или «зеленящих») стрептококков при исследовании образцов из респираторного тракта культуральными методами [10], в последние годы предложены генетические тесты для достижения корректной видовой идентификации S. pneumoniae, в том числе непосредственно в клиническом материале [11, 12]. Кроме того, описаны генетические механизмы формирования устойчивости стрептококков к макролидам. Первый вариант реализуется за счет приобретения гена ermB (erythromycin-resistance methylase), что приводит к фенотипической устойчивости к эритромицину, кларитромицину, азитромицину и к клиндамицину [13]. Другой путь связан с приобретением генов mef, кодирующих зависимые от ATФ белки, активно выводящие антибиотики из бактериальной клетки. Наличие генов mef приводит к слабой устойчивости к макролидам, и микроорганизм остается чувствительным к клиндамицину [14]. При этом резервуаром генетических детерминант устойчивости считаются непатогенные S. mitis и S. oralis.

Целью данного исследования явились оценка результатов видовой идентификации и анализ генетических детерминант устойчивости к АБП стрептококков, изолированных из образцов орофарингеальных мазков пациентов со стабильным течением ХОБЛ по сравнению с аналогичными образцами от больных БА с помощью экспериментальной диагностической панели «Стрептопол+» (OOO «НПФ «Литех»).

Методом случайной выборки в исследование включены 140 мужчин и женщин. Среди них 89 пациентов, страдающих ХОБЛ (средний возраст 58,03±8,6 года), и 51 больной БА (средний возраст 51,6±12,3 года). Все пациенты на момент включения в исследование характеризовались стабильным течением, длительностью болезни не менее 12 мес без эпизодов обострений на протяжении предшествующих 4 нед и системной антибиотикотерапии в течение 12 нед до момента включения. По результатам скринингового обследования в исследование включили 64 пациента со стабильной ХОБЛ средней степени тяжести (по классификации GOLD, 2010), 33 пациента со стабильной ХОБЛ тяжелого и очень тяжелого течения (по классификации GOLD, 2010), 23 пациента с легкой контролируемой и частично контролируемой БА и 28 больных БА тяжелого неконтролируемого течения.

У участников исследования взяты орофарингеальные мазки с помощью стерильной палочки с ватным тампоном на конце, помещаемой в пробирку. Экстракцию ДНК выполняли с использованием набора FastDNA SPIN Kit for Soil («MPBIO», США) согласно протоколу, оптимизированному сотрудниками National Heart and Lung Institute (Лондон, Великобритания) для повышения выхода ДНК. Выделение ДНК выполнено на базе Центральной научно-исследовательской лаборатории ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России (Томск, Россия). Выделенную ДНК хранили при температуре –20 °С до проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Видовая идентификация стрептококков и анализ генетических маркеров лекарственной устойчивости выполнены с использованием экспериментального набора «Стрептопол+» производства OOO «НПФ «Литех» (Москва, Россия) согласно протоколу производителя.

Диагностическая тест-система «Стрептопол+» реализует принцип количественной ПЦР с регистрацией сигнала в реальном времени и включает два триплексных набора: 1) Streptococcus spp. (FAM)/S. pyogenus (HEX)/S. agalacticae (ROX); 2) S. pneumoniae (FAM)/Mef (HEX)/Erm (ROX).

В каждом тестируемом образце выполнена амплификация внутреннего контроля (детектируемого по каналу Cy5), что свидетельствует об адекватности проведенных процедур пробоподготовки и отсутствии ингибирования ПЦР.

Статистический анализ выполнен с использованием программы Statistica 10.0. Поиск признаков, по которым различаются группы образцов, проведен при помощи теста Манна—Уитни, анализ корреляционных связей — по методу Спирмена.

В целом группа больных БА отличалась от пациентов с ХОБЛ меньшими индексом курения, количеством эпизодов обострений и курсов антибиотикотерапии в течение года. Пациенты с БА характеризовались менее выраженным кашлем и продукцией мокроты, однако демонстрировали более частое применение системных ГКС (СГКС) на протяжении предшествующих 12 мес и короткодействующих β2-агонистов (КДБА) в сутки, а также более высокие уровни ОФВ1 до и после бронходилатационного теста (табл. 1).

У пациентов с ХОБЛ средней степени тяжести по сравнению с больными ХОБЛ тяжелого и очень тяжелого течения отмечались меньшая частота обострений и госпитализаций за предшествующий год, более редкие эпизоды приема СГКС, менее выраженная суточная потребность в КДБА и тяжесть одышки по Модифицированной шкале оценки нарушения дыхания (mMRC), более высокая толерантность к физической нагрузке по результатам теста с 6-минутной ходьбой (ТШХ) и большее насыщение артериальной крови кислородом (SatО2) до нагрузки и после нее, а также более высокий ОФВ1 до бронходилатации в стандартной пробе с сальбутамолом и после нее (табл. 2).

Схожие закономерности наблюдались и в группе больных БА. У пациентов с менее выраженной тяжестью заболевания в отличие от больных тяжелой неконтролируемой БА наблюдались относительно редкие эпизоды обострения. На протяжении предшествующих 12 мес пациенты с легкой персистирующей БА не госпитализировались по поводу обострения, большинство из них не нуждалось в применении СГКС. Данная группа больных отличалась сопоставимо более редкой среднесуточной потребностью в применении КДБА, лучшими оценками по шкале mMRC и ACT-тесту, их реже беспокоили кашель и отделение мокроты. Пациенты с легкой контролируемой и частично контролируемой БА в отличие от тяжелых больных демонстрировали лучшую переносимость физической нагрузки в ТШХ, большее насыщение артериальной крови кислородом, а также более высокие ОФВ1 и форсированную жизненную емкость легких (ФЖЕЛ) до стандартного теста с сальбутамолом и после него (табл. 3).

Образцы тотальной ДНК, изолированной из орофарингеальных мазков больных ХОБЛ (n=89) и БА (n=51), протестированы с помощью экспериментальной диагностической панели «Стрептопол+» (OOO «НПФ «Литех»). Достоверно стрептококки определялись в 83 (93,3%) из 89 образцах от пациентов с ХОБЛ и в 50 (98%) из 51 образцах от пациентов с БА. У одного пациента с ХОБЛ стрептококки в мазке не обнаружены, 6 образцов (5 от пациентов с ХОБЛ и 1 от больного БА) попали в так называемую серую зону, характерную для низких титров ДНК.

Гены mef обнаружены у всех пациентов с ХОБЛ. Ген ermB в проанализированной группе больных ХОБЛ встречался реже, чем mef, и обнаружен в 81 (91%) образце, из которых в 28 (31,3%) результат его идентификации расценен как слабоположительный. Вероятно, наличие генов устойчивости орофарингеальной микробиоты у больных ХОБЛ может быть связано с высокой частотой зависимых от инфекционного процесса обострений, ассоциированных с применением АБП в группе пациентов с ХОБЛ. Так, только 6 из всей группы обследованных больных ХОБЛ характеризовались отсутствием обострений на протяжении предшествующих 12 мес. Эти пациенты относились к группе больных ХОБЛ средней степени тяжести (степень II по классификации GOLD, 2010) со слабо выраженными (<2 баллов по шкале mMRC) или выраженными (≥2 балла по шкале mMRC) симптомами заболевания и низким риском развития обострений (типы, А и В по классификации GOLD, 2011). Следует отметить, что у 5 из них стрептококки орофарингеальных мазков также отличались отсутствием гена ermB. В целом в группе больных ХОБЛ средней степени тяжести частота обострений составила 1,81±1,2 за год, а у пациентов с тяжелым и очень тяжелым течением — 2,6±1,7 за год. При этом данные группы больных характеризовались статистически значимыми различиями по частоте обострений (p=0,017). У 34 (38,2%) обследованных пациентов с ХОБЛ за предшествующий год зарегистрировано по 1 эпизоду обострения, у 19 (21,35%) — по 2 эпизода, у 14 (15,73%) на протяжении года развилось 3 эпизода обострения ХОБЛ и у 16 (17,97%) — 4 эпизода и более. Следует отметить, что частота курсовой терапии АБП по поводу респираторных инфекций в группе обследованных больных ХОБЛ существенно варьировала — от 0 у пациентов с ХОБЛ средней степени тяжести до 5—6 эпизодов у больных тяжелого и очень тяжелого течения заболевания (средняя частота 1,69±1,48 эпизода в год).

У пациентов с БА ген mef также обнаружен во всех образцах, 2 из которых оценены как слабоположительные по содержанию данного гена. В группе пациентов с БА гены ermB встречались несколько реже, чем в образцах больных ХОБЛ, — в 42 (82,4%) из 51; из них слабоположительный результат идентификации гена определен для 21 (41,2%). Следует отметить, что группа пациентов с БА, в образцах мазков которых отсутствовали гены ermB, не характеризовалась единообразием по тяжести заболевания и количеству обострений за прошедший год, однако всем этим больным не проводилась антибиотикотерапия на протяжении предшествующих 12 мес. В то же время статистически значимые различия по представленности гена ermB между группами образцов орофарингеальных мазков от больных БА и ХОБЛ, а также внутри группы пациентов с БА не выявлены.

С целью оценки уровня представленности генов mef и ermB в образцах выполнен анализ количественных данных по циклам выхода сигнала амплификации данных генов. Косвенно величина, обратная значению цикла выхода, отражает степень представленности анализируемых генетических детерминант устойчивости. При проведении корреляционного анализа в обобщенной группе образцов мазков ротоглотки у больных БА и ХОБЛ отмечена прямая связь между уровнем представленности генов mef и ermB (r=0,55; p=1,54E—11). Схожий характер корреляции сохранялся и при изолированном анализе по группе ХОБЛ (r=0,55; р=3,09Е—08), а также в группе больных БА (r=0,58; р=0,000088).

Кроме того, выполнен корреляционный анализ по Спирмену между уровнем представленности генов mef и ermB (по значениям циклов выхода сигнала амплификации данных генов) и некоторыми клинико-функциональными характеристиками. Так, в группе больных ХОБЛ высокая представленность гена еrmB в образце соотносилась с более высоким индексом курения и статистически значимо коррелировала с более частыми обострениями ХОБЛ у пациентов, увеличением частоты приема АБП и более выраженной продукцией мокроты (табл. 4).

Схожие результаты у пациентов с ХОБЛ получены при анализе представленности гена mef — высокая представленность этого гена статистически значимо ассоциировалась с частыми эпизодами обострения ХОБЛ и большим числом курсов АБТ за предшествующие 12 мес (см. табл. 4).

В группе больных БА выявлена прямая корреляция между представленностью гена ermB и частотой антибиотикотерапии за предшествующий год (r=0,37; р=0,037).

С целью анализа ассоциации наличия стрептококков в образцах орофарингеальных мазков у больных БА и ХОБЛ с клиническими признаками посчитана безразмерная величина (ΔСt), отражающая разность между пороговыми значениями накопления сигнала от ДНК человека и от ДНК стрептококков. Опосредованно эта величина характеризует степень бактериального обсеменения. Для исследованной выборки (n=140) полученные значения варьировали от –7,34 до 19,9. Анализ частот распределения позволил отнести 34 (24,3%) из 140 образцов в группу с низким обсеменением, 92 (65,7%) — в группу с высоким бактериальным обсеменением, 14 (10%) — в «серую» зону. При проведении корреляционного анализа в обобщенной группе больных БА и ХОБЛ выявлено, что уровень обсемененности стрептококками орофарингеальных мазков прямо коррелирует с представленностью генов mef (r=0,51; p=6,04E—10) и ermB (r=0,29; p=0,001). При изолированном анализе в группе БА значение ∆Сt также прямо коррелировало с представленностью генов mef (r=0,57; p=0,000019) и ermB (r=0,57; p=0,0001); у пациентов с ХОБЛ большее значение ΔСt в образцах соотносилось с более высокой представленностью гена mef (r=0,45; р=0,000009).

По данным видовой идентификации в группе больных ХОБЛ S. рneumoniaе достоверно определялся в 2 образцах, еще в 4 (6,74%) наблюдался слабоположительный сигнал. Во всех этих образцах имелись гены mef. Гены ermB обнаруживались в 5 (83,3%) образцах из 6. У 2 пациентов в данной группе заболевание характеризовалось тяжелым течением, высоким риском развития обострения (2 эпизода и более за 12 мес) и потребностью в применении антибиотиков один эпизод или более в год. Так, у одного из этих больных на протяжении 12 мес зарегистрированы 6 эпизодов обострения ХОБЛ, ассоциированных с назначением АБТ. При этом в 2 случаях обострения у данного больного использовались макролидные антибиотики (азитромицин и кларитромицин). Еще у 2 пациентов из группы ХОБЛ с выявленным S. рneumoniaе зарегистрирована средняя степень тяжести по спирометрической классификации GOLD (2010), высокий риск развития обострения (2 и 4 эпизода обострения) и один эпизод назначения АБТ за предшествующие 12 мес. У 2 пациентов со средней степенью тяжести ХОБЛ риск обострений определен как низкий и назначения АБТ за 12 мес не было.

Среди пациентов с БА S. рneumoniaе определялся в 4 (7,8%) образцах, однако в низких (слабоположительных) титрах. Следует отметить, что эти пациенты с БА относились к группе частично контролируемой и неконтролируемой БА и перенесли на протяжении предшествующих 12 мес минимум по 1 эпизоду обострения заболевания. При этом у 2 пациентов в качестве базисной терапии использовались ингаляционные ГКС (ИГКС) в низких дозах; еще 2 пациента получали фиксированные комбинации ИГКС и пролонгированных β2-агонистов. Во всех случаях обнаружение ДНК S. рneumoniaе в образцах мазков больных БА, как и в образцах пациентов с ХОБЛ, сопровождалось выявлением генов mef и ermB, предопределяющих устойчивость к макролидам.

Низкие титры (слабоположительный сигнал) S. pyogenus зафиксированы у 60 (42,9%) из совокупной выборки образцов, S. agalacticae не обнаружено, что закономерно при исследовании биологических проб со слизистых оболочек верхних дыхательных путей.

Большинство стрептококков, выявленных в орофарингеальных мазках больных БА и пациентов с ХОБЛ, представлены зеленящими стрептококками группы mitis.

Согласно результатам видовой идентификации микроорганизмов, изолированных из образцов орофарингеальных мазков, микробиотический пейзаж дыхательных путей у пациентов со стабильным течением ХОБЛ и больных БА вне обострения характеризуется рядом особенностей. Так, стрептококки, являясь одним из наиболее типичных представителей бактерий-контаминантов слизистой оболочки дыхательных путей у больных БА и ХОБЛ, в большинстве случаев представлены зеленящими стрептококками группы mitis. В стабильный период заболевания S. рneumoniaе в орофарингеальных мазках определяется лишь у 7,8% пациентов с БА и у 6,74% больных ХОБЛ, общей чертой для которых является склонность к тяжелому течению заболевания и наличию повторяющихся эпизодов обострения с потребностью в назначении АБП. В 42,9% случаев в орофарингеальных мазках у больных БА и ХОБЛ в отсутствие обострений обнаруживается S. pyogenus. При этом статистически значимых различий по частоте его выявления между группами больных нет.

Идентифицированные стрептококки являются резервуаром генетических детерминант устойчивости к АБП — генов mef и ermB, которые кодируют механизмы устойчивости стрептококков к воздействию макролидных антибиотиков, а гены ermB также ответственны за развитие невосприимчивости стрептококков и стафилококков к линкозамидам и стрептограминам. Степень представленности этих генов в мазках различается между пациентами и прямо коррелирует с выраженностью обсемененности образца стрептококками, при этом уровни их представленности находятся в прямой зависимости друг от друга. Следует отметить, что гены mef обнаружены у 100% пациентов с БА и ХОБЛ в орофарингеальных мазках, в то время как ген ermB встречался у 91% больных ХОБЛ и у 82,4% пациентов с Б.А. Примечательно, что образцы мазков без гена ermB принадлежали больным ХОБЛ, характеризовавшимся низким риском обострений (по классификации GOLD, 2011), а также пациентам с БА и ХОБЛ, не получавшим на протяжении предшествующих 12 мес антибиотикотерапию. Вероятно, высокая распространенность генов устойчивости стрептококков дыхательных путей к макролидным антибиотикам в популяции пациентов с хроническими бронхообструктивными заболеваниями, относящихся к группе высокого риска развития эпизодов респираторных инфекций, обусловлена частым, порой бесконтрольным, применением АБП широкого спектра действия, среди которых современные макролиды — одна из наиболее клинически востребованных групп.

Традиционно настороженность медицинского сообщества вызывает рост резистентности микроорганизмов на фоне нерационального применения противомикробных лекарственных средств. Результаты анализа генов антибиотикорезистентности mef и ermB в образцах орофарингеальных мазков у больных ХОБЛ и БА также подтверждают, что представленность указанных генов прямо коррелирует с частотой эпизодов приема АБП.

Важно, что представленность указанных генов в образцах орофарингеальных мазков соотносится с некоторыми клинико-анамнестическими особенностями течения заболевания у больных ХОБЛ. Так, выявлена прямая корреляция представленности гена ermB с выраженностью продукции мокроты и индексом курения при ХОБЛ; гены mef и ermB напрямую коррелирует с частотой обострений у больных ХОБЛ.

Приобретение на фоне повторяющихся эпизодов противомикробной терапии пациентом с ХОБЛ контаминантной микробиоты дыхательных путей, характеризующейся сниженной чувствительностью к антибиотикам широкого спектра действия, благоприятствует дальнейшей бактериальной колонизации респираторного тракта и препятствует эффективной эрадикации возбудителя. Это может обусловливать увеличение частоты обострений и более тяжелое течение болезни, снижая эффективность базисной терапии.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ №НК 13−04−01854 и федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014—2020 годы» (ГК № 14.604.21.0075, уникальный идентификатор RFMEFI60414X0075), с использованием оборудования Междисциплинарного центра коллективного пользования Казанского Федерального (Приволжского) Университета (ГК № 14.594.21.0003, уникальный идентификатор RFMEFI59414X0003).