ДВККЛ — диффузная В-крупноклеточная лимфома

ОВ — общая выживаемость

ПМВЛ — первичная медиастинальная В-крупноклеточная лимфома

РМЖ — рак молочной железы

IFNα — интерферон-α

JAK — Janus kinase

TLR — Toll-подобный рецептор

Основные процессы в клетке, такие как сохранение жизнеспособности, пролиферация и дифференцировка, регулируются цитокинами. Сигнальный путь JAK-STAT является основным для передачи сигнала внутри клетки с рецепторов цитокинов. Супрессоры цитокинового сигнального пути (белки SOCS) служат ингибиторами активации JAK-STAT, а нарушение регуляции белков семейства SOCS может быть одним из механизмов аномальной активации STAT [1—4].

Существует более 900 публикаций о значении генов и белков SOCS при различных онкологических заболеваниях [5]. Чаще всего описания касаются белков SOCS1 и SOCS3, которые достаточно хорошо исследованы на биологических моделях (рис. 1). Эти исследования показали роль генов — супрессоров цитокинового сигнала при различных злокачественных процессах [6—13]. Самое большое число публикаций выполнено при гемобластозах и опухолях печени. В связи с тем что сигнальный путь JAK-STAT является одним из ключевых в развитии диффузной В-крупноклеточной лимфомы (ДВККЛ), представляется интересным изучение генов SOCS, а именно SOCS1, при этих заболеваниях.

Молекулярные механизмы действия белка SOCS1. Цитокины принимают непосредственное участие в пролиферации, дифференцировке и апоптозе клеток. Преобразование внешних стимулов гормонов (лептин и пролактин) и цитокинов (интерлейкин-6 и 11, интерферон-α — IFNα, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, фактор ингибирования лейкоза) в различные стимулы для клетки осуществляется через сигнальный путь JAK-STAT. Двумя ключевыми молекулами этого пути являются нерецепторная тирозинкиназа JAK (Janus kinase) и транскрипционный фактор STAT (signal transducers and activators of transcription — передатчики сигнала и активаторы транскрипции). JAK-киназа связана с цитоплазматической частью цитокинового рецептора. После связывания определенного цитокина с рецептором JAK активируется и фосфорилирует специфические тирозиновые аминокислотные остатки в составе рецептора, что дает возможность присоединиться к ним транскрипционному фактору STAT своим доменом SH2. JAK-киназа также фосфорилирует сам фактор STAT, присоединенный к рецептору, после чего STAT димеризуется и перемещается от рецептора в ядро, где запускает экспрессию соответствующих генов (рис. 2) [14].

Вслед за этим наблюдается индуцируемая цитокинами активация белков — ингибиторов пути JAK-STAT, названных SOCS — супрессорами цитокиновой сигнализации (suppressor of cytokine signalling). Основной функцией белков SOCS является блокирование передачи сигнала от цитокиновых рецепторов к STAT. Белки SOCS, являясь классическими ингибиторами, действуют по механизму отрицательной обратной связи [15].

Существуют 4 механизма, по которым SOCS инактивирует передачу сигнала от цитокинов пути по JAK-STAT:

1) блокировка связывания белков STAT с рецептором путем конкурентного связывания с активным центром для белков STAT на рецепторе;

2) подготовка белков STAT к деградации посредством убиквитинирования;

3) связывание с JAK и блокировка ее киназной активности;

4) подготовка JAK-киназ к деградации в протеосоме [16].

Считается, что SOCS1 имеет значение в подавлении развития опухоли, благодаря своей способности контролировать и прекращать активацию STAT [17—23]. При этом влияние SOCS1 в других сигнальных путях, которое может оказывать действие на онкогенез, изучены недостаточно.

Известно, что белок SOCS1 взаимодействует с Toll-подобным рецептором (TLR), белками NF-κB и p53, за счет чего может играть роль в процессе подавления канцерогенеза [24—27]. Кроме того, SOCS1 может способствовать фосфорилированию р53 и его активации, что приводит к реализации зависимых от р53 процессов в активированной онкогенами клетке [28, 29]. Таким образом, белок SOCS1 не только участвует в функционировании сигнальном пути JAK-STAT, но и взаимодействует с белками TLR, NF-κB и p53, за счет чего может играть роль в процессе канцерогенеза.

Клиническое значение белка SOCS1 в онкологии. Изменение функции SOCS1 в опухолевых клетках может меняться под воздействием генетических и эпигенетических событий.

Зависимое от цитокинов изменение уровня экспрессии белка SOCS1. Имеются противоречивые данные об изменении уровня экспрессии белка SOCS1 в опухолевых клетках. Уменьшение экспрессии белка SOCS1 выявляется при раке различной локализации, а также при гемобластозах (множественной миеломе, остром миелоидном лейкозе и лимфомах) [29, 30]. Исследование, выполненное у больных раком простаты, выявило уменьшение экспрессии белка SOCS1 после андрогенной супрессии и повышение экспрессии его у пациентов при рецидивах [30]. Снижение экспрессии белка SOCS1 приводит к гиперактивации STAT1 и снижению активации STAT3. Снижение экспрессии SOCS1 способствует усилению повреждения и воспалительной реакции в тканях, пролиферации эпителиальных клеток и увеличению риска их малигнизации. Такой процесс наблюдается в тканях, например в печени у пациентов с вирусным гепатитом С [11].

Повышенный уровень экспрессии SOCS1 выявлен при более ранних стадиях и благоприятном течении рака молочной железы (РМЖ) [31]. Высокая экспрессия SOCS1 выявлена в резистентных к IFN опухолевых клетках. Ингибирование экспрессии SOCS1 усиливало зависимый от IFN ответ, таким образом, было предположено, что гиперэкспрессия SOCS1 обусловливает прогрессирование заболевания.

Полученные столь различные результаты исследований уровня экспрессии SOCS1 при опухолях до сих пор полностью необъяснимы. Считается, что на уровень экспрессии SOCS1 может влиять микроокружение опухоли, продуцирующее определенные цитокины и гормоны [32, 33].

Мутации и метилирование гена SOCS1. I. Melzner и соавт. [34] провели исследование, в котором обнаружили, что различные делеции гена SOCS1 часто определяются при первичной медиастинальной В-крупноклеточной лимфоме (ПМВЛ), и определили их также в клеточной линии опухолевых клеток ПМВЛ. Делеция гена SOCS1 приводит к непрерывной активации фосфорилирования JAK2 и повышенному связыванию ДНК с фосфорилированным STAT5. Эти данные подтверждают концепцию о том, что мутации гена SOCS1 (делеции) могут быть ключевым моментом в онкогенезе при ПМВЛ [34]. Эпигенетическая инактивация SOCS1 также обнаружена в клетках пациентов с миелопролиферативными заболеваниями, имеющими мутацию JAK2 (Val617Phe) [35].

Снижение экспрессии гена SOCS1 может быть результатом гиперметилирования его промоутера. Гиперметилирование промоутера гена SOCS1 обнаруживается при различных онкологических заболеваниях, таких как гепатоцеллюлярная карцинома, рак поджелудочной железы, меланома, острый миелоидный лейкоз, множественная миелома, рак яичников, рак желудка и РМЖ железы [30, 36—39]. Гиперметилирование самого гена SOCS1 выявлено при некоторых типах лимфом и миелодиспластическом синдроме [40, 41]. Гиперметилирование гена SOCS1 может привести к повышению активности JAK2, что способствует быстрой пролиферации клеток. По данным литературы, гиперметилирование гена SOCS1 в ткани РМЖ и клетках меланомы определяется чаще, чем в нормальной ткани [42, 43].

Канцерогенез, обусловленный делецией гена SOCS1. На биологических моделях (на мышах) проведен эксперимент, который продемонстрировал, что делеция гена SOCS1 в опухолевых клетках, как правило, связана с гиперактивацией STAT1. Он считается супрессором развития опухоли, благодаря его способности модулировать апоптоз за счет зависимого и независимого от транскрипции механизма. У мышей с делецией гена SOCS1 выявлялось развитие колоректального рака, этиологию которого связывали с нарушениями в сигнальном пути JAK-STAT. Исследователи предположили, что в условиях дефицита белка SOCS1 избыточно активируется STAT1, а это способствует развитию опухолей[10].

Исследования гена SOCS1 при ДВККЛ. Аналогично другим типам опухолей патогенез ДВККЛ включает множество последовательных процессов, приводящих к накоплению определенных генетических и молекулярных дефектов, которые способствуют селекции злокачественного клона В-клеток. В ходе «созревания» (прогрессии) клеточного клона ДВККЛ могут происходить хромосомные транслокации, нарушение процесса соматических гипермутаций и изменения уровня транскрипции про- и антионкогенов, а также мутации генов. Хотя отмечен прогресс в понимании патологии этого заболевания, многие патогенетические звенья и биологические особенности ДВККЛ остаются в значительной степени неизвестными.

В 2009 г. представлены результаты большого исследования немецких ученых по изучению мутационного статуса гена SOCS1 при различных лимфомах [44]. Исследование выполнено методом полимеразной цепной реакции и секвенирования ДНК, выделенной из замороженных биоптатов и полученной из клеточных линий ДВККЛ. Выявлено, что чаще всего мутации гена SOCS1 обнаруживаются при В-клеточных лимфомах, а именно при ДВККЛ и фолликулярной лимфоме. Частота выявления этих мутаций достигает 27%. Это происходит реже при лимфоме Беркитта, лимфоме из клеток мантийной зоны и лимфоме из клеток маргинальной зоны (см. цу).

В 16 из 19 случаев В-клеточных лимфом выявленные мутации оказались одиночными, в остальных 3 случаях наблюдались множественные мутации. Все множественные мутации выявлены в одном аллеле. Мутации, обнаруженные при ДВККЛ, представлены в основном заменой единичных нуклеотидов (миссенс-мутации), с меньшей частотой определялись делеции и/или инсерции. Все мутации обнаружены в различных участках гена, причем большое количество в нетранслируемой части гена и интроне, и скорее всего не несут никакого функционального значения. Значение же выявленных мутаций в SOCS-box (домен гена SOCS1), функционально значимой части гена, не исследовалось. Следует также отметить, что при изучении стромальных опухолей и Т-клеточных лимфом мутаций гена SOCS1 не обнаружено [44].

Еще одно крупное исследование гена SOCS1 выполнено у больных с первичной медиастинальной крупноклеточной лимфомой. Выбор именно этой группы больных обусловлен клинически значимым участием в патогенезе данного типа ДВККЛ сигнального пути JAK-STAT. Цитогенетически при ПМВЛ часто выявляются изменения в регионе хромосомы 9р, а именно 9р24, в котором локализуется ген JAK2. Кроме того, молекулярные исследования указывают на высокую экспрессию JAK2 при ПМВЛ. Встает вопрос о возможном влиянии SOCS1 на постоянную активацию JAK2 как о важном звене онкогенеза при данном типе ДВККЛ [22].

Анализ мутаций гена SOCS1 выполнен на 20 замороженных биоптатах опухоли больных ПМВЛ, а также на клеточной линии (MedB-1). При секвенировании выявлены мутации в 9 (45%) случаях из 20. Причем в 2 случаях выявлена одна и та же мутация (делеция в регионе 108—171), в то время как во всех остальных случаях позиция и вид мутаций различались. Кроме того, выполнен анализ корреляции мутаций гена SOCS1 с экспрессией JAK2 и изменениями в регионе хромосомы 9р по данным цитогенетического исследования. В 7 из 9 случаев лимфом с выявленными мутациями гена SOCS1 обнаружены цитогенетические изменения в регионе 9р хромосомы, включающей локус JAK2. Однако в 6 из 8 случаях ПМКЛ, где мутации SOCS1 не выявлены, также в 6 из 8 случаев детектированы методом FISH сигналы от этого участка хромосомы. Авторами сделан вывод, что мутации гена SOCS1 не коррелируют и не исключают изменений в локусе JAK2. В этом исследовании прогностическое значение выявленных мутаций при данном типе лимфом не изучалось. Хотя в экспериментах с клеточными линиями показано, что в зависимости от наличия или отсутствия мутаций гена SOCS1 отмечалась более интенсивная или медленная пролиферация клеток соответственно. Таким образом, мутации гена SOCS1, действительно, могут играть одну из ключевых ролей в лимфомогенезе при ПМВЛ [22].

Прогностическое значение мутаций гена SOCS1 при ДВККЛ. Впервые прогностическое значение мутаций гена SOCS1 при ДВККЛ представлено в исследовании, результаты которого опубликованы в начале 2013 г. В данном исследовании осуществлен анализ мутаций гена SOCS1 у 154 пациентов с ДВККЛ. Секвенирование нового поколения позволило выявить в 24 (16%) случаях мутации в гене SOCS1 [45]. Все случаи охарактеризованы не только клинически и в зависимости от терапии, но и с применением 6 различных прогностических моделей, общепринятых в настоящее время (иммуногистохимическая, цитогенетическая и 4 молекулярные, выделяющие различные по биологии типы ДВККЛ [46—49]).

У 24 пациентов выявлено 90 различных мутаций: 5 мутаций охарактеризованы как одиночные, остальные — как множественные. При анализе мутаций обнаружено, что большинство находятся в кодирующей части гена. Мутации характеризовались также как точечные, с заменой аминокислоты или как большие («разрывающие») мутации, которые определялись делецией гена, т. е. влияли на наличие или положение С-концевого домена гена SOCS1. По данному признаку случаи мутаций разделены для анализа на 2 группы: малые и большие мутации. В каждой группе определено по 12 пациентов.

Мутации SOCS1 предположительно происходят в результате процесса соматической гипермутации в В-клетках [43]. Число точечных мутаций варьировало от 1 до 18, а сами мутации накапливались в соматических гипермутациях (40,8%). Нуклеотиды G/C (n=64) вовлекались чаще, чем нуклеотиды A/T (n=12) — 26 против 5 в соматических гипермутациях. Частота, расположение и трансляционная последовательность мутаций SOCS1 по полученным данным подтверждали гипотезу, что они вызваны аберрантной соматической гипермутацией [45].

По данным многофакторного анализа, в параметры которого включены клинические характеристики, мутационный статус гена SOCS1 не коррелирует ни с какими из признаков и не может быть спрогнозирован ими. При анализе различных молекулярных типов ДВККЛ, основанных на 4 различных классификациях [46—49], четкой корреляции между этими типами и мутационным статусом не выявлено. Однако отмечалось, что все случаи больших мутаций («разрывающих») определялись в группе GCB (из клеток герминального центра) типа ДВККЛ.

Анализ общей (ОВ) и безрецидивной выживаемости больных ДВККЛ показал, что обнаружение мутаций гена SOCS1 не влияет на эти показатели в отличие от больных без мутаций. Однако при анализе больных, у которых мутации выявлены, получены достоверные различия по ОВ в зависимости от характера мутаций. Так, у пациентов с «большими» мутациями 5-летняя ОВ достигла 90%, а у пациентов с «малыми» — 0. Таким образом, пациенты с мутациями гена SOCS1 разделились на 2 принципиально разные группы с благоприятным и крайне неблагоприятным прогнозом (рис. 3).

Можно предположить, что более грубые, «разрывающие» мутации, приводят к потере функции гена SOCS1, которые приводят к длительной активации сигнального пути JAK-STAT и должны способствовать пролиферации опухолевых клеток. Исследования корреляции мутаций гена SOCS1 и индекса пролиферативной активности Ki-67 в данном исследовании не проводилось. Возможно, высокая пролиферативная активность опухоли при значительных мутациях гена SOCS1 и обусловливает хороший ответ на стандартную терапию.

Результатом данного исследования в первую очередь является впервые выявленный прогностический признак, который столь принципиально смог выделить больных ДВККЛ с различным прогнозом при стандартной химиотерапии.

Собственные данные. В нашем центре проводится исследование мутаций гена SOCS1 у больных с впервые установленным диагнозом ДВККЛ с факторами неблагоприятного прогноза. Всем пациентам в качестве терапии первой линии проводилась интенсифицированная полихимиотерапия (программа mNHL-BFM-90). Данное исследование выполнено у 22 больных с ДВККЛ, у которых из биоптатов опухолевой ткани выделена ДНК. Методом секвенирования по Сэнгеру гена SOCS1 мутации выявлены у 6 (27%) пациентов. У 50% больных обнаружено более 1 мутации исследованного гена. В 6 случаях выявлены делеции гена и столько же случаев с точечными мутациями. Планируются дальнейшее исследование мутаций гена SOCS1 у больных ДВККЛ и выполнение анализа значения данной мутации для прогноза у данной группы больных.

Исследования ключевых молекулярных механизмов при гемобластозах способствуют определению более четких критериев ответа на химиотерапию и, таким образом, определяют поиск новых подходов к терапии. Так, выявление мутаций генов FLT3, NPM и CEBRA определяет группы прогноза при острых миелоидных лейкозах [50], мутации гена p53 — при хроническом лимфолейкозе, а мутации в гене BCR-ABL — вероятность ответа на тот или иной ингибитор тирозинкиназ. Ингибиторы тирозинкиназ, моноклональные антитела, ингибиторы брутоновой киназы также являются ярким примером создания лекарственных препаратов, направленных на конкретный молекулярный механизм.

Большое количество исследований в настоящее время направлено на изучение патогенеза, молекулярных механизмов развития резистентности к химиотерапии при ДВККЛ [51]. Так, в результате исследований мутаций гена SOCS1 выявлен прогностический признак, который независимо от других критериев делит пациентов ДВККЛ на принципиально различные по прогнозу группы при стандартной химиотерапии. Хотя эти результаты являются крайне интересными, некоторые аспекты должны быть приняты во внимание. Во-первых, число больных, включенных в исследование, крайне невелико. Во-вторых, осталось неясным, является ли конкретная мутация моно- или биаллельной вследствие наличия различных количеств неопухолевых клеток в образцах. Это биологическое ограничение, однако, не уменьшает значение биомаркера. В-третьих, авторы не смогли четко объяснить, с чем конкретно связаны наблюдаемые прогностические различия у больных с разными мутациями SOCS1. Можно было бы предположить, что «большие» мутации приводят к потере супрессирующей функции (т.е. в результате происходит длительная активации сигнального пути JAK-STAT). Это подтверждено в другом исследовании на клеточных линиях ПМВЛ [22, 41]. В-четвертых, ретроспективный характер данного исследования не позволил учесть успехи лечения, достигнутые при появлении ритуксимаба.

Следует отметить, что в настоящее время большинство ранее определенных прогностических факторов, индексов при ДВККЛ сохранили свое значение у больных, которые использовали ритуксимаб (R-CHOP). Несомненно также, что актуальным является изучение известных прогностических факторов при интенсификации терапии, например при применении программ R-EPOCH, mNHL-BFM90, HyperCVAD, как наиболее эффективных при ДВККЛ с факторами неблагоприятного прогноза.

Наблюдаемая ассоциация между подтипами мутаций SOCS1 и ОВ больных делает анализ гена SOCS1 перспективным методом для определения прогноза у больных ДВККЛ.