Усовершенствованный алгоритм генетической диагностики агрессивных В-клеточных лимфом в детской онкогематологии: опыт НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева

Особенностью современной классификации опухолей лимфоидной и гемопоэтической ткани Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) (5-е издание, 2022 г.) является то, что все подтипы B-клеточных неходжкинских лимфом (В-НХЛ) демонстрируют существенные различия в морфологических, иммунофенотипических и генетических характеристиках, что непосредственно влияет на их клиническое течение, терапевтические подходы и прогностические параметры [1].

Агрессивные B-клеточные лимфомы отличаются быстрым прогрессированием, требуют незамедлительного начала терапии, но при этом демонстрируют более высокую чувствительность к химиотерапевтическому лечению.

Особое клиническое значение имеет подгруппа агрессивных B-клеточных лимфом, поскольку своевременность и точность их диагностики критически влияют на терапевтический исход и долгосрочный прогноз заболевания.

Современная классификация ВОЗ особое внимание уделяет цитогенетическим и мутационным профилям, что прежде всего актуально для агрессивных B-клеточных лимфом. Морфологическое и иммунофенотипическое сходство некоторых агрессивных подтипов, включая диффузную крупноклеточную B-клеточную лимфому, высокоагрессивную B-клеточную лимфому и лимфому Беркитта (ЛБ), требует применения специализированного диагностического алгоритма, основанного на анализе генетических изменений в генах MYC, BCL2, BCL6 и аберраций длинного плеча хромосомы 11 (11q).

Поскольку среди агрессивных B-клеточных лимфом присутствуют схожие по морфологическим и иммунофенотипическим характеристикам опухоли, для формирования окончательного гистологического диагноза ВОЗ был предложен алгоритм диагностики, основанный на генетических изменениях в генах MYC, BCL2 и BCL6 и длинном плече хромосомы 11 (11q) [2]. Данный алгоритм представлен на рис. 1.

Рис. 1.Алгоритм классификации агрессивных В-клеточных лимфом [2].

Помимо описанного выше цитогенетического алгоритма, существуют рекомендации по использованию в клинической практике целого ряда молекулярно-генетических тестов, которые могут применяться как для уточнения диагноза, так и для выявления потенциальных прогностических маркеров [3]. Такое обилие различных методов, использующихся для диагностики B-клеточных лимфом, обусловлено, с одной стороны, увеличением количества биологических подтипов данных новообразований, а с другой — обнаружением новых прогностических маркеров, которые затем используются для стратификации на группы риска в протоколах химиотерапии. Например, имеется ряд работ, которые показывают прогностическую роль минимальной диссеминированной или остаточной болезни МДБ/МОБ [4] и статуса гена TP53 при ЛБ [5, 6]. Так, мы уже демонстрировали эффективность использования метода NGS (секвенирование нового поколения) для детекции клональных перестроек тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов для обнаружения МДБ/МОБ [7]. Согласно данным G. Martire и соавт. [8], статус гена TP53 является гораздо более надежным предиктором развития рецидива заболевания. Таким образом, статус гена TP53 наряду с ответом на терапию является самым надежным предиктивным маркером, который можно использовать в клинической практике.

Имеются убедительные данные, что лимфомы у детей имеют свой уникальный биологический и молекулярный профиль, существенно отличающийся от такового во взрослой популяции [9, 10]. Информация о частоте встречаемости редких подтипов агрессивных B-клеточных лимфом в педиатрии крайне ограничена. Это относится к таким формам, как лимфомы с 11q-аберрацией (high-grade B-cell lymphoma with 11q aberration — HGBCL-11q), с перестройками BCL2, BCL6 (diffuse large B-cell lymphoma / high-grade B-cell lymphoma with MYC and BCL2 rearrangements — DLBCL/HGBCL-MYC/BCL2), а также лимфомы неспецифицированного подтипа (high-grade B-cell lymphoma (HGBCL NOS). Ранее считалось, что данные подтипы практически не встречаются у детей, однако последние данные говорят об обратном [11, 12] и это требует внедрения диагностических алгоритмов для их выявления. В Национальном медицинском исследовательском центре детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева Минздрава России в 2021 г. было начато мультицентровое клиническое исследование по протоколу «В-НХЛ 2021м», в рамках которого осуществлялось выявление молекулярно-генетических маркеров агрессивных B-клеточных лимфом у детей для определения биологических подтипов, требующих модификации стандартной линии терапии для улучшения результатов.

В настоящем исследовании мы представляем усовершенствованный алгоритм генетической диагностики агрессивных В-НХЛ и данные по его реализации в НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева.

Настоящее проспективное исследование было проведено в период с декабря 2022 по декабрь 2024 г. В обследуемую группу было включено 90 пациентов с входящим диагнозом «лимфома Беркитта». Исследование одобрено независимым этическим комитетом НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева и утверждено решением ученого совета центра.

Критериями включения в исследование служили гистологическое заключение о наличии морфологической картины и иммунофенотипа зрелой агрессивной B-клеточной лимфомы, а также возраст пациентов от 0 до 18 лет.

Первым этапом проводилось генетическое исследование с применением интерфазной флюоресцентной гибридизации in situ (FISH) на опухолевом биопсийном материале. В исследовании, согласно инструкции производителя, были использованы ДНК-зонды HealthCare: MYC/IGH Dual-Color Probe, MYC(8q24) Gene Break Apart Probe, BCL2(18q21) Gene Break Apart Probe, BCL6(3q27) Gene Break Apart Probe, P53/CEP17 Dual-Color Probe, CCND1 (BCL1) gene amplification, ATM/CEP11 dual color, 11q23.3/11q24.3 gene deletion (Wuhan HealthCare Biotechnology Co., Китай).

Анализ результатов FISH-исследования проводился в соответствии с Международной цитогенетической классификацией 2020 г. (ISCN 2020) [13]. В каждом случае анализировались не менее 100 интерфазных ядер с четкими сигналами.

Анализ статуса гена TP53 выполнялся методом NGS после таргетного ПЦР-обогащения при использовании праймеров к целевым экзонам гена TP53 (экзоны 2-11). ДНК для анализа выделялась из опухолевых биопсийных образцов с помощью набора «FFPE MAG» (ООО «Сесана», Россия). Пробоподготовка библиотеки для секвенирования выполнялась с использованием набора «Prep&Seq^tm U-target» (ООО «ПАРСЕК ЛАБ»). Секвенирование осуществлялось на секвенаторе MiSeq (Illumina, США) с глубиной покрытия не менее 400 прочтений на ампликон. Биоинформатический анализ выполнялся с помощью ПО «Seq&Go Software» (ООО «ПАРСЕК ЛАБ»).

В 90 образцах биопсийного материала было проведено цитогенетическое исследование FISH-методом для выявления перестройки t(8;14)(q24;q32) MYC::IGH. Данная транслокация была обнаружена в 77% (69/90) случаев, что с учетом морфологической картины и иммунофенотипа является критерием для постановки диагноза ЛБ. Во всех 69 образцах дополнительно были исследованы мутации гена TP53 (методами FISH и/или NGS). Так, при исследовании FISH-методом выявлены моноаллельные делеции локуса TP53 в 4% (3/69) образцов, а при использовании NGS-метода удалось выявить мутации TP53 в 26% (18/69).

В 21 из 90 исследованных образцов (23%) перестройка t(8;14)(q24;q32) MYC::IGH не была обнаружена, в связи с чем дополнительно было проведено FISH-исследование для выявления перестроек локуса MYC с другими транслокационными партнерами. Транслокации гена MYC с неустановленными хромосомными партнерами были описаны в 5 образцах, а в 11 — ген MYC не был перестроен.

Стоит отметить, что почти в четверти образцов (5/21) были обнаружены генетические аберрации с атипичными FISH-паттернами. Так, в 1 случае была выявлена высококопийная амплификация 5’-участка локуса MYC с формированием крупных гомогенно окрашенных регионов (homogenously staining regions — HSR), что не позволило количественно оценить уровень амплификации участка гена. Помимо этого, была описана транслокация MYC с атипичным FISH-паттерном 1F1R0G — один слитный сигнал от нормального MYC, по 2 сигнала от 5’-участка гена и полное отсутствие сигналов от 3’-участка гена. В эту же группу с иными генетическими аберрациями был определен образец с атипичным распределением сигналов при исследовании t(8;14)(q24;q32) MYC::IGH. В части ядер присутствовал слитный сигнал малого размера от химерного гена MYC::IGH, причем от локуса IGH наблюдалось по 2 сигнала обычного размера и 1 дополнительный малого размера (1/3 обычного), в то же время от локуса MYC присутствовало по 2 сигнала: один обычный и один малый. Данная ситуация была описана как атипичная транслокация t(8;14)(q24;q32) MYC::IGH. Вышеописанные случаи проиллюстрированы на рис. 2.

Рис. 2.Нетипичные генетические аберрации В-НХЛ.

а, б — амплификация 5’-участка локуса MYC; в — транслокация MYC с FISH-паттерном –1F1R0G; г — атипичная транслокация t(8;14)(q24;q32) MYC::IGH (стрелки — сигнал от химерного гена).

Образцы, в которых не обнаружено каких-либо структурных аберраций гена MYC, были дополнительно подвергнуты исследованию перестроек генов BCL2 и BCL6. В случае отсутствия транслокаций проводилось исследование числа копий 11q (регионы q13, q22-q24). Из 11 MYC-негативных образцов 4 имели транслокации BCL2 или BCL6, в 5 случаях они отсутствовали, а 2 образца имели аберрации 11q. В первом случае была обнаружена делеция регионов 11q23 и 11q24 (loss 11q23-q24), во втором — увеличение числа копий 11q13 (gain 11q13) и делеция 11q24 (рис. 3).

Рис. 3.Аберрации 11q в высокоагрессивных B-клеточных лимфомах.

Коделеция регионов 11q23 (а), 11q24 (б), gain 11q13 (в), делеция 11q24 (г).

Как было сказано выше, мутации в гене TP53 были исследованы двумя взаимодополняющими методами (FISH и NGS), что позволило выявить мутации суммарно в 30% случаев. Все выявленные методом NGS варианты мутаций располагались в ДНК-связывающем домене и приводили к нарушению функции белка p53 (рис. 4).

Рис. 4.Патогенные варианты мутаций TP53, выявленные методом NGS.

В результате проведенной работы мы предложили усовершенствованный цитогенетический и молекулярно-генетический алгоритм диагностики агрессивных B-клеточных лимфом у детей, который приведен на рис. 5. Начальной точкой является исследование перестройки t(8;14)(q24;q32) MYC::IGH, позитивные случаи далее отправлялись на исследование мутаций гена TP53, негативные пошагово исследовались на наличие транслокаций MYC, BCL2, BCL6, IGK, IGL и аберраций 11q.

Рис. 5.Алгоритм генетической диагностики агрессивных B-клеточных лимфом у детей.

В данном исследовании проведена комплексная оценка цитогенетических изменений у пациентов с подозрением на ЛБ, а также предложен собственный алгоритм цитогенетической и молекулярно-генетической диагностики агрессивных B-клеточных лимфом у детей. В частности, был проведен анализ частоты встречаемости «классической» для ЛБ транслокации t(8;14)(q24;q32) MYC::IGH. Полученные результаты показали, что 77% образцов демонстрируют наличие вышеописанной перестройки, что подтверждает ее статус в качестве ключевого диагностического критерия. Однако в 23% образцов данная транслокация не была выявлена, что подчеркивает необходимость углубленной диагностики. В ходе последующего цитогенетического исследования выявлен ряд других генетических аберраций в группе без классической перестройки MYC::IGH, включая случай с атипичным для t(8;14) FISH-паттерном, что указывает на возможные альтернативные механизмы активации гена MYC при ЛБ.

Анализ MYC-негативной группы пациентов позволил выявить случаи с аберрациями в длинном плече 11-й хромосомы и диагностировать HGBCL-11q. У 45% пациентов не удалось установить какие-либо генетические события, что позволило отнести их в группу HGBCL NOS. Таким образом, использование описанного алгоритма помогает идентифицировать редкие подтипы агрессивных B-клеточных лимфом у детей, ранее остававшихся недиагностированными. Это позволяет не только повысить точность диагностики, но и дает возможность анализировать результаты терапии у данных пациентов в зависимости от биологического подтипа опухоли, что может способствовать персонификации терапии в зависимости от индивидуальных факторов риска.

Анализ мутаций в гене TP53 показал, что применение NGS-метода позволило выявить мутации TP53 в 26% образцов, а результаты флуоресцентной гибридизации in situ дополнили генетический портрет исследованных лимфом. Обнаруженные с помощью FISH-метода моноаллельные делеции TP53, хотя и встречаются редко, подчеркивают разнообразие генетических изменений, связанных с ЛБ и требуют включения в диагностические алгоритмы FISH-исследования на крупные делеции гена TP53. Важно отметить, что все выявленные методом NGS мутации располагались в ДНК-связывающем домене, что подчеркивает значимость данного региона для функционирования белка.

Усовершенствованный алгоритм диагностики, основанный на последовательном анализе генетических аберраций, может существенно повысить точность диагностики, позволяя учитывать не только типичные, но и атипичные генетические вариации.

Настоящее исследование представляет комплексный анализ генетических характеристик агрессивных B-клеточных лимфом у детей и демонстрирует высокую эффективность адаптированного диагностического алгоритма в отношении стратификации пациентов с В-НХЛ. Группа агрессивных B-клеточных лимфом у детей продемонстрировала выраженную цитогенетическую неоднородность, что в ряде случаев существенно осложняет диагностический процесс. Выявление «классической» транслокации t(8;14)(q24;q32) MYC::IGH лишь в 77% образцов подчеркивает необходимость расширенного генетического анализа для точной диагностики. В группе пациентов без типичной перестройки MYC::IGH удалось идентифицировать редкие подтипы: HGBCL-11q (18% случаев) и HGBCL NOS (45%). Анализ мутаций гена TP53 NGS- методом выявил их присутствие в 26% образцов, при этом все полученные варианты локализовались в ДНК-связывающем домене, крайне значимом для функционирования белка. Дополнительное FISH-исследование позволило обнаружить моноаллельные делеции TP53, таким образом расширяя уже имеющийся спектр генетических нарушений. Однако для определения клинического значения описанных генетических аберраций необходимо проведение проспективного исследования на большой выборке.

Усовершенствованный алгоритм диагностики, основанный на последовательном анализе генетических аберраций, является эффективным инструментом выявления редких нозологических форм агрессивных B-клеточных лимфом и создает основу для анализа результатов терапии в зависимости от биологического подтипа опухоли, способствуя персонификации лечения с учетом индивидуальных факторов риска.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Волчков Е.В., Шарлай А.С., Абрамов Д.С., Коновалов Д.М., Мякова Н.В.

Сбор и обработка материала — Абрамов Д.С., Сидоров И.В., Баранова М.А., Шарлай А.С., Коновалов Д.М.

Написание текста — Шарлай А.С., Абрамов Д.С., Волчков Е.В., Мякова Н.В.

Редактирование — Коновалов Д.М., Мякова Н.В.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.