ВКМ — внеклеточный матрикс

ДС — диабетическая стопа

ИГХИ — иммуногистохимические исследования

ММП — матриксные металлопротеиназы

НК — нижние конечности

СД — сахарный диабет

СД-2 — СД 2-го типа

СКП — содержащие коллаген повязки

TIMP-1 — тканевый ингибитор металлопротеазы-1

Лечение длительно незаживающих раневых дефектов является серьезной медицинской проблемой. По данным литературы, распространенность в общей популяции хронических ран (трофических язв) различной природы составляет от 1 до 4% [1]. Значительный вклад в эту проблему вносят поражения мягких тканей нижних конечностей (НК) на фоне сахарного диабета (СД), в первую очередь синдром диабетической стопы (ДС), который регистрируется у 10—12% больных СД [2]. Данное осложнение служит причиной более 1,2 млн ампутаций в год [3]. Все перечисленное определяет актуальность разработки новых методов стимулирования репаративной активности у лиц с нарушенным углеводным обменом.

Большинство закономерностей течения раневого процесса установлено в ходе исследований острых травматических или хирургических ран. Травма служит пусковым механизмом процесса заживления, включающего 4 основные стадии [4]: коагуляция, воспаление, клеточная пролиферация и восстановление матрикса, эпителизация и ремоделирование рубцовой ткани. Эти стадии в отдельности и весь процесс в целом при остром повреждении могут длиться от 10 дней до нескольких месяцев.

Хронические или незаживающие раны (трофические язвы) характеризуются дефектным ремоделированием внеклеточного матрикса (ВКМ), нарушением реэпителизации и длительной воспалительной фазой. Эпидермис не может мигрировать в раневую зону, развивается гиперпролиферация на краях дефекта, которая мешает нормальной клеточной миграции по раневому ложу. Возможная причина этого — ингибирование апоптоза среди популяций фибробластов и кератиноцитов. Язвы стоп при СД считаются «замершими» на фазе пролиферации [5]. В подобных случаях происходит чрезмерная экспрессия фибронектина и тромбоспондина, что приводит к клеточной дисфункции и дисрегуляции. Кроме того, установлено, что процесс тормозят протеиноподобные молекулы, поступающие из кровеносного русла [4].

Исследования продемонстрировали и такое различие между острой и хронической раной, как уровень воспалительных цитокинов и протеаз [6]. Как только хроническая рана начинает заживать, концентрация этих веществ снижается. Протеазы могут разрушать факторы роста и цитокины, необходимые для заживления [7]. Матриксные металлопротеиназы (ММП) относятся к семейству зависимых от цинка эндопептидаз, которые обеспечивают деградацию белковых компонентов межклеточного матрикса и базальных мембран. На основании данных о первичной структуре, субстратной специфичности и клеточной локализации эти ферменты делят на 4 основных подсемейства: коллагеназы, желатиназы, стромелизины, мембраносвязанные ММП. К подсемейству желатиназ относят желатиназу, А (ММП-2) и желатиназу В (ММП-9). Они способны расщеплять коллаген IV и V типов, эластин, входящий в состав базальных мембран, и денатурированный коллаген, что дает ММП-2 и ММП-9 способность участвовать в деградации фибриллярных коллагенов совместно с коллагеназами [8]. Желатиназы также способны гидролизировать коллагены других типов и ряд белков соединительнотканного матрикса [9].

Известно, что на первой стадии раневого процесса (воспаления) основными клетками, участвующими в репарации, являются макрофаги, которые активно продуцируют факторы роста [10]. Последние способствуют переходу раны в следующую стадию (пролиферации) за счет организации ВКМ и коллагеновой сети. На этом этапе происходят снижение уровня макрофагов и миграция кератиноцитов в раневое ложе, взаимодействие между раневыми протеолитическими ферментами — ММП, интегринами, цитокинами, в результате которого происходит продукция ВКМ [11, 12].

Уровень ММП существенно влияет на заживление раневых дефектов за счет замедления перестройки ВКМ и формирования коллагена. Доказано, что высокий уровень ММП-9 в раневом экссудате является маркером воспаления и нарушенного заживления ран при сахарном диабете [13, 14].

Установлено, что отношение MMП-9 к тканевому ингибитору металлопротеазы-1 (TIMP-1) в экссудате снижалось в ходе эффективного лечения раневых дефектов у пациентов с СД 2-го типа (СД-2) в отличие от группы лиц с плохо заживающими язвенными дефектами и нормальным углеводным обменом, у которых этот показатель остается повышенным [15].

Имеются данные о влиянии некоторых фармакологических препаратов на уровень ММП. N. Trengove и соавт. [16] продемонстрировали снижение уровня ММП на 90% при использовании тканевого ингибитора, а также значительное снижение исходно повышенного уровня ММП при заживлении хронической раны. Теми же исследователями доказано, что применение факторов роста в лечении пациентов с варикозной болезнью ведет к увеличению содержания тканевых ингибиторов ММП.

Проблема местного лечения раневых дефектов у больных с синдромом ДС широко обсуждается различными специалистами, работающими в этой области. Ежегодно появляются новые средства закрытия ран, разработчики которых предлагают препараты, воздействующие на различные патогенетические звенья раневого процесса. Препараты на основе коллагена — группа современных средств местного лечения трофических язв, в том числе у больных С.Д. Коллаген является основным структурным белком в тканях животных и человека. На его долю приходится почти 25% всех белковых структур организма, он содержится в коже, костях, связках, мышцах и сухожилиях [17, 18]. При производстве раневых покрытий наиболее часто используется коллаген типа I, выделенный из кожи или сухожилий животных. Он обеспечивает гемостаз, обладает низкой провоспалительной и антигенной активностью, позволяет формироваться новому коллагену, тем самым вызывая сокращение размеров раны, снижает активность MMП и способствует заживлению, уменьшает воспаление, стимулирует выработку факторов роста и пролиферацию клеток в области раны.

В исследованиях in vitro и клинических испытаниях доказано, что на фоне применения содержащих коллаген повязок (СКП) снижается уровень провоспалительных цитокинов и протеаз [19—25]. Этот вид раневых покрытий способен связывать свободные радикалы, конечные продукты воспаления, эндотоксины и избыточные ионы железа и цинка, что косвенно обеспечивает уменьшение воспалительного процесса [26].

В различных исследованиях доказано положительное влияние коллагена на заживление хронических ран у пациентов с синдромом Д.С. Так, в исследовании А. Veves и соавт. [27] продемонстрировано полное закрытие раневых дефектов в течение 6 мес на фоне местного применения повязки Промогран. В исследовании R. Lobmann и соавт. [28] отмечено сокращение размеров раневых дефектов НК на 16% по сравнению с группой контроля, в которой данный показатель составил 1,65% за 8 дней у лиц с СД, а также снижение уровня экспрессии MMП-9/TIMP-2 по данным лабораторных исследований крови.

Несмотря на достаточное количество данных литературы, свидетельствующих об эффективности местного применения СКП при лечении хронических ран у больных СД, однозначной оценки молекулярных механизмов действия данного средства местного лечения пока нет.

Цель данной работы: оценить интенсивность репаративных процессов в мягких тканях НК у пациентов с синдромом ДС на фоне местного применения СКП по сравнению со стандартной консервативной терапией.

В исследование включили 42 пациента с нейропатической и нейроишемической (после реваскуляризации) формами синдрома ДС, которым проведена хирургическая обработка раневого дефекта, после чего в течение 9±2 дня у 21 больного (1-я группа) проводилось местное лечение СКП Промогран (Systagenix, Великобритания). У 21 больного из контрольной группы проводилась стандартная терапия атравматичными повязками и жидкими антисептиками.

При каждой смене повязки оценивали состояние пациента, диаметр и глубину раневого дефекта, наличие и качество грануляций, а также чрескожное напряжение кислорода до начала и после окончания местного лечения.

До и после местного лечения выполняли биопсию тканей раневого ложа с последующим гистологическим и иммуногистохимическим исследованиями (ИГХИ). Пациенты обеих групп сопоставимы по возрасту, уровню контроля углеводного обмена, выраженности микрососудистых осложнений, состоянию артериального кровотока НК, площади и глубине раневых дефектов (см. таблицу).

Площадь раны определяли методом очерчивания ее контуров через прозрачную масштабную пленку с последующим подсчетом площади внутри контура по специальным формулам (Opsite Flexgrid, Smith & Nephew, Великобритания).

Чрескожная оксиметрия выполнена на аппарате Radiometer (Дания). Датчики накладывали на расстоянии 0,5—1 см от краев раны.

Морфологический анализ биопсийного материала включал гистологический метод и ИГХИ до и после лечения. Материал фиксировали в 10% растворе формалина, затем заливали в парафин по стандартной методике. Серийные срезы толщиной 3—5 мкм депарафинировали по стандартной схеме и окрашивали гематоксилином и эозином.

Гистологические критерии воспаления, регенерации и состояния грануляционной ткани оценены количественным методом (по балльной системе) согласно общепринятым принципам. Фазы раневого процесса оценены по классификации М.И. Кузина (1990 г.).

ИГХИ выполнили на иммуностейнере Leica BOND-MAX. Использовали антитела фирмы «Dako» в стандартных разведениях с положительным контролем. Применяли антитела к TIMP-1, ММП-9, маркеру макрофагов CD68.

Оценку экспрессии цитоплазматических маркеров (TIMP-1, ММП-9, CD68) проводили полуколичественным методом: 1«+» окрашивание единичных клеток (менее 30% клеток), 2«+» — 30—60% клеток, 3«+» — 60—90%, 4 «+» — более 90% клеток.

Исследование проведено как сравнительное в параллельных группах. Протокол исследования одобрен на заседании этического комитета ФГБУ ЭНЦ от 28 ноября 2012 г. (протокол № 18).

Статистическая обработка полученных данных выполнена с использованием пакета прикладных программ Statistica («StatSoft Inc.», США, версия 6.0). Для анализа вида распределений применяли критерии Шапиро—Уилка и Лиллиефорса, дисперсии распределений признаков оценивали с помощью критерия F в процедуре дисперсионного анализа ANOVA. Учитывая небольшие объемы выборок и распределения, отличающиеся от нормального, использовали непараметрические методы анализа данных. Сравнение независимых групп по количественным признакам осуществляли непараметрическим методом с использованием критерия U Манна—Уитни. Сравнение зависимых групп по количественным признакам осуществляли непараметрическим методом с использованием критерия Вилкоксона. Сравнение независимых групп по качественным признакам выполняли непараметрическим методом путем анализа таблиц сопряженности с использованием двустороннего точного критерия Фишера для несвязанных групп. Статистически значимыми считали различия при p<0,05. Анализ связи (корреляции) двух количественных признаков осуществляли непараметрическим методом ранговой корреляции Спирмена.

На фоне терапии в обеих группах удалось достичь сокращения размеров ран, однако в 1-й группе отмечалось более выраженное уменьшение площади и глубины раневых дефектов по сравнению с таковыми во 2-й группе (p=0,02; рис. 1). На фоне местной терапии коллагеном разница площади составила 26,4 (11,7; 32,4) % в отличие от стандартной терапии, при которой разница площади на фоне лечения составила 17 (13,3; 26,7)%; p=0,002. В 1-й группе глубина раневых дефектов сократилась на 30,4 (20,0; 41,1) % по сравнению с исходными данными, в то время как во 2-й группе данный показатель равнялся 16,6 (12,5; 32,2)%; p=0,002.

По данным чрескожной оксиметрии отмечено более выраженное усиление локальной микрогемодинамики в 1-й группе по сравнению со 2-й после 9±2 дня терапии (p=0,02; рис. 2, а).

При анализе результатов гистологического исследования и ИГХИ биоптатов тканей раневых дефектов, полученных после хирургической обработки и до начала местного лечения, установлено, что обе группы сопоставимы по интенсивности репаративных процессов в мягких тканях. В ранах обеих групп отмечались выраженный отек, плохо организованный ВКМ, низкое содержание фибробластоподобных клеток и выраженная воспалительная инфильтрация.

По данным гистологического исследования тканей раневых дефектов на фоне лечения в обеих группах выявлено уменьшение отека как в 1-й группе до лечения — 3 (3; 4), после лечения — 2 (2; 2; p<0,001), так и во 2-й группе до лечения — 4 (3;4), после лечения — 2 (2;3; p=0,002). Однако различия между группами статистически незначимы (p=0,79).

Достоверных данных об изменениях организации ВКМ не получено ни в одной из групп после терапии, в чем группы оказались сопоставимы (p=0,77).

В ходе лечения в обеих группах отмечен достоверный переход ран из фазы воспаления в фазу эпителизации (в 1-й группе p<0,001, во 2-й группе p=0,02). Однако статистически значимых различий между группами не выявлено (p=0,6).

По данным световой микроскопии в 1-й группе выявлен процесс перехода от молодой грануляционной ткани к зрелой (p<0,001) в отличие от контрольной группы, в которой отмечено появление созревающей грануляционной ткани на фоне терапии (p<0,001). Однако, несмотря на это, показатели между группами статистически значимо не различались.

По результатам ИГХИ в обеих группах исходно отмечалось окрашивание средней интенсивности маркера макрофагов (CD68) и ММП-9, слабое окрашивание TIMP-1 (р>0,05).

На фоне лечения по данным ИГХИ с антителами к маркеру макрофагов CD68 отмечено статистически значимое увеличение количества макрофагов в 1-й группе (p=0,018), во 2-й группе увеличение количества макрофагов статистически незначимо (p=0,19; рис. 2, б).

В обеих группах выявлено снижение экспрессии MMP-9 после лечения, в 1-й группе отмечалась тенденция к более выраженному снижению активности данной коллагеназы, но различия между группами статистически незначимы (p=0,38). Динамика прироста TIMP-1 на фоне терапии в обеих группах также статистически незначима (в 1-й группе p=0,64, во 2-й группе р=0,09).

Изучены особенности репаративных процессов в мягких тканях НК у 42 пациентов с нейропатической и нейроишемической формами (после восстановления кровотока) синдрома ДС, получавших в периоперационном периоде местную терапию с применением СКП или стандартное лечение. Больные были сопоставимы по возрасту, длительности СД, выраженности микрососудистых осложнений СД, размерам и состоянию раневых дефектов, оксигенации мягких тканей.

По данным морфологического исследования биоптатов тканей раневых дефектов до лечения отмечено замедление репаративных процессов у больных с синдромом ДС, что проявлялось выраженным межклеточным отеком, дезорганизацией ВКМ и воспалительными проявлениями, у большинства больных отмечено наличие воспалительной фазы раневого процесса по данным световой микроскопии. Полученные данные совпадают с результатами опубликованных ранее исследований, свидетельствующих о замедлении процессов заживления у лиц с СД [30—32].

Известно, что раны при нарушениях углеводного обмена характеризуются более продолжительной фазой воспаления, снижением активности воспалительных клеток и замедлением перестройки ВКМ. Эти нарушения способствуют хронизации раневого процесса [33].

Отмечено, что у лиц с нарушенным углеводным обменом снижено количество продуцируемого коллагена, а это ведет к замедлению сокращения размеров раны. Когда фаза воспаления сменяется фазой пролиферации, происходят снижение уровня провоспалительных макрофагов, миграция кератиноцитов в раневое ложе, взаимодействие между ММП, интегринами и цитокинами, в результате чего осуществляется продукция ВКМ [31]. При ИГХИ мягких тканей ран до лечения отмечено усиление экспрессии ММП-9 и снижение уровня TIMP-1.

Таким образом, полученные клинические, гистологические и иммуногистохимические данные свидетельствуют о хронизации раневого процесса у больных СД уже в 1-е сутки после первичной хирургической обработки дефекта. Наиболее вероятной причиной замедления заживления является «застревание» ран в фазе воспаления, что подтверждается результатами морфологических исследований.

В ходе лечения в 1-й группе отмечались более выраженные репаративные процессы, что подтверждается как клинически (более интенсивное сокращение площади и глубины раневых дефектов), так и морфологически (см. рис. 3, а и далее). Кроме того, на фоне лечения в 1-й группе зафиксировано усиление локальной микрогемодинамики по данным чрескожной оксиметрии, что также подтверждается данными гистологического исследований: грануляционная ткань в большинстве случаев была зрелой, после чего формировалась здоровая соединительная ткань.

У пациентов 2-й группы показатели чрескожного напряжения кислорода существенно не отличались от исходных. По данным гистологического исследования (см. рис. 3, б), грануляционная ткань была созревающей, определялись клетки воспалительного инфильтрата. Неудовлетворительное состояние раневых дефектов на фоне стандартного лечения потребовало повторной хирургической обработки и увеличило сроки пребывания больных в стационаре.

Как известно, неоваскуляризация и усиление локальной гемодинамики являются важнейшими факторами, способствующими заживлению раневых дефектов. Так, исследование Т. Dinh и соавт. [34] продемонстрировало, что количество сосудов в дерме (по данным световой микроскопии) больше у пациентов, чьи язвенные дефекты при ДС быстрее эпителизировались.

Следствием улучшения микрогемодинамики можно считать существенное уменьшение отека, тенденцию к организацию ВКМ, практически полное исчезновение воспалительного инфильтрата и формирование здоровой состоятельной грануляционной ткани, достоверно более выраженные в 1-й группе, что подтверждается результатами гистологического исследования и ИГХИ.

По результатам ИГХИ в 1-й группе зафиксировано более выраженное увеличение количества макрофагов, что свидетельствует о более интенсивном переходе раневого процесса из фазы воспаления в фазу пролиферации, а затем в фазу эпителизации (рис. 4).

Известно, что ММП-9 и TIMP-1 непосредственно участвуют в формировании ВКМ. У лиц с раневыми дефектами НК и СД соотношение ММП-9/TIMP-1 повышено и является одной из причин замедленного заживления ран [13]. В настоящем исследовании в 1-й группе зафиксировано уменьшение экспрессии ММП-9 на фоне лечения (p=0,007) (рис. 5). Отмечена тенденция к повышению уровня TIMP-1 на фоне терапии в обеих группах (p=0,34) (рис. 6). Таким образом, можно констатировать, что СКП снижают протеолитическую активность, способствуют более выраженной организации ВКМ и как следствие лучшему заживлению язвенных дефектов.

В исследовании Т. Dinh и соавт. [34] получены аналогичные результаты: уровень ММП-9 статистически значимо повышен у пациентов с плохим заживлением раневых дефектов при синдроме ДС по сравнению с группой без такового и группой, в которой язвенные дефекты хорошо поддавались консервативному лечению.

Несмотря на небольшой объем выборки больных, на основании полученных данных можно сделать вывод, что местное применение СКП положительно влияет на репаративные процессы в мягких тканях НК у лиц с нарушенным углеводным обменом и может служить методом выбора для достижения заживления раны вторичным натяжением после хирургической обработки.

Местное лечение с применением СКП ведет к более быстрому сокращению площади и глубины раневых дефектов у лиц с различными клиническими формами синдрома Д.С. Применение коллагенового раневого покрытия достоверно повышает количество новообразованных сосудов, что способствует ускорению процессов заживления раневых дефектов у лиц с нейропатической и нейроишемической формами синдрома ДС.

Использование СКП у лиц с СД сокращает сроки перехода раневого процесса из фазы воспаления в фазу пролиферации, позволяет быстрее достичь эпителизации раневого дефекта, что выражается в уменьшении количества клеток воспалительного инфильтрата, уменьшении отека и организации ВКМ, появлении зрелой грануляционной ткани по результатам световой микроскопии и в снижении экспрессии маркера макрофагов CD68 по данным ИГХИ.

Отмечены достоверное (р<0,05) снижение уровня экспрессии ММП-9 и тенденция к повышению синтеза TIMP-1 на фоне применения СКП, что способствует ускорению организации ВКМ и формированию качественной грануляционной ткани. Выявлено достоверное увеличение количества новообразованных сосудов по данным ИГХИ при окрашивании маркера CD31 при использовании раневых покрытий на основе коллагена.

Исследование проведено при спонсорской поддержке ФГБУ ЭНЦ в рамках утвержденной темы научно-исследовательской работы.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, связанных с рукописью.