Диагностическое значение определения факторов ангиогенеза и показателей цитокинового состава в сыворотке крови и моче у пациентов с системной склеродермией

Системная склеродермия (ССД) - хроническое аутоиммунное заболевание соединительной ткани, которое характеризуется генерализованной микроангиопатией, фиброзом кожи и внутренних органов [1]. Гистологическими признаками ССД являются периваскулярные инфильтраты и уменьшение плотности капилляров, которым может предшествовать чрезмерное накопление белков внеклеточного матрикса [2].

Снижение плотности капилляров при ССД приводит к снижению скорости кровотока, ишемии тканей и клиническим проявлениям заболевания, например к развитию дигитальных язв [3]. Ишемия тканей способствует образованию новых кровеносных сосудов из ранее сформированной капиллярной сети. При ССД это может приводить к структурной перестройке микроциркуляторного русла и генерализованной прогрессирующей васкулопатии, которая запускает каскад тяжелых и необратимых последствий поражения внутренних органов.

Ангиогенез включает пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток и реконструкцию капиллярной сети и представляет собой сложный многоступенчатый процесс, находящийся под строгим контролем индукторов и ингибиторов ангиогенеза [4]. В норме уровень индукторов и ингибиторов ангиогенеза сбалансирован и ангиогенез в здоровых тканях не происходит.

Одним из наиболее важных факторов, обеспечивающих жизнедеятельность эндотелия, является фактор роста эндотелия сосудов - VEGF (vascular endothelial growth factor). Он способствует пролиферации эндотелия, стимулирует трофические функции, служит главным регулятором физиологического ангиогенеза, рассматривается в качестве медиатора дисфункции эндотелия (ДЭ) [5, 6]. Основным фактором, который стимулирует ангиогенез, является гипоксия [7, 8]. Известно, что гипоксия способствует накоплению факторов, индуцируемых гипоксией, - HIF (HIF-1α и HIF-1β) [9]. Эти факторы проникают в ядро клетки, связываются с соответствующим ответственным участком и изменяют транскрипцию многих генов, в том числе генов VEGF [10]. В результате увеличивается экспрессия индукторов ангиогенеза, включая VEGF.

В тот момент, когда действие индукторов ангиогенеза превышает действие ингибиторов, эндотелиальные клетки переходят из обычного «дремлющего» состояния в активное и происходит «включение ангиогенеза» [11]. В своем исследовании Maurer и соавт. [12] выявили, что при ССД высокие уровни VEGF в сыворотке крови индуцируют развитие фиброза и недостаточность ангиогенеза.

В последние годы уделяется большое значение определению ангиогенных факторов и цитокинов в сыворотке крови и моче при различных заболеваниях - ревматических, атеросклерозе, опухолях [13, 14]. В ряде работ при ССД отмечено повышение в сыворотке крови таких маркеров, как VEGF, белка-хемоаттрактанта моноцитов 1-го типа (МСР-1), α-фактора некроза опухолей (ФНО), интерлейкинов (IL) 1β, 6, 8, 10, которые играют важную роль в патогенезе васкулопатии [15, 16].

По данным некоторых исследований, повышение уровня цитокинов и факторов роста в моче наблюдается при таких заболеваниях, как хронический пиелонефрит, сахарный диабет, хронический гломерулонефрит [17]. Следует отметить, что в литературе мы не обнаружили исследований, посвященных определению содержания цитокинов в сыворотке крови и моче у пациентов с ССД и их взаимосвязей с клиническими проявлениями заболевания, поражением почек, тяжестью органных поражений, клинической формой, активностью заболевания.

Цель работы - изучить взаимосвязи концентрации интерлейкинов (IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10), α-ФНО, VEGF, МСР-1 в сыворотке крови, моче и активности заболевания, клинической формы, характера течения, клинических проявлений ССД.

В исследование включили 51 пациента с ССД, находившегося на стационарном лечении в ревматологическом отделении ГУЗ «Областная клиническая больница» (Саратов) в период c февраля по июнь 2013 г. ССД соответствовала диагностическим критериям ССД Американской ревматологической ассоциации (1980) и/или диагностическим критериям ССД, разработанным Н.Г. Гусевой и соавт. [18]. В группу сравнения вошли 32 добровольца, сопоставимых с больными ССД по полу, возрасту, индексу массы тела (ИМТ), уровню артериального давления (АД), показателям липидного состава крови. Средний возраст пациентов с ССД составил 53,9±10,8 года, средний возраст лиц группы сравнения - 49,9±7,2 года.

Для количественного анализа биомаркеров образцы крови у пациентов и лиц группы сравнения брали натощак, в утренние часы из локтевой вены с использованием систем для забора крови Vacuette с активатором свертывания крови и разделительным гелем. Первую порцию утренней мочи в объеме не менее 100 мл собирали в специальные стаканы с крышками. Предварительно в емкость для забора мочи вносили 20 мкл раствора ProClin 300 («SUPELCO», США). Аликвоты сыворотки крови и мочи разливали в пробирки с крышками типа Eppendorf емкостью 2 мл и хранили до проведения исследования при температуре –25 °С.

Концентрацию интерлейкинов (IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10), VEGF, α-ФНО, МСР-1 в сыворотке крови и моче обследуемых пациентов и лиц группы сравнения определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа, используя соответствующие наборы реагентов ЗАО Вектор-Бест (Новосибирск).

Выполняли следующие исследования: объективное обследование с расчетом ИМТ; измерение АД с расчетом среднего АД; общий анализ крови; общий анализ мочи; биохимическое исследование крови с определением общего холестерина, креатинина в сыворотке крови по Яффе на биохимическом анализаторе Hitachi 912 с использованием реагентов фирмы «DiaSys»; С-реактивный белок высокочувствительным фотометрическим турбидиметрическим методом с применением реагентов DiaSis на автоматическом анализаторе крови Hitachi; у некоторых больных исследовали суточную протеинурию, проводили пробу Нечипоренко.

Эхокардиографию выполняли на комплексе Acuson 128 XP/10, использовали М-модальный режим, двумерный (В) режим, режимы импульсной и постоянноволновой допплерографии в стандартных эхокардиографических позициях. Систолическое давление в легочной артерии (СДЛА) оценивали при регистрации транстрикуспидального потока в постоянноволновом допплерографическом режиме. Определяли максимальную скорость потока трикуспидальной регургитации, по которой с помощью модифицированного уравнения Бернулли рассчитывали систолический транстрикуспидальный градиент давления. Легочную гипертонию констатировали при СДЛА ≥36 мм рт.ст.

Всем пациентам выполнили рентгенологическое исследование кистей, стоп, органов грудной клетки; отдельным пациентам - высокого разрешения компьютерную томографию органов грудной клетки.

Для оценки функции внешнего дыхания с помощью спирографа Micro GP (Англия) проводили спирографию с пробой с бронхолитиком и определением жизненной емкости легких (ЖЕЛ), форсированной жизненной емкости легких (фЖЕЛ), объема форсированного выдоха за 1-ю секунду (ОФВ1), ОФВ1/фЖЕЛ.

Для оценки выраженности уплотнения кожи применяли модифицированный счет G. Rodnan. Выделяли диффузную, лимитированную и перекрестную формы ССД. Для оценки активности ССД рассчитывали индекс активности Valentini (European Scleroderma Study Group, 2001) [19].

Учитывали особенности лечения пациентов: D-пеницил­ламин принимали 40% пациентов, глюкокортикостероиды - 79%, нестероидные противовоспалительные препараты - 48%, альпростадил - 9%, базисные препараты - 21% больных (из них 6% получали метотрексат, 10% - 4-аминохинолиновые препараты, 3% - азатиоприн, 2% - микофенолата мофетил).

Статистическую обработку данных проводили с использованием программ Microsoft Office Excel 2010 («Microsoft Corp.», США) и Statistica 8.0 («StatSoft Inc.», США). Характер распределения данных оценивали графическим методом и с использованием критерия Шапиро-Уилка. Описание признаков, которые имеют нормальное распределение, представлено в виде M±SD, где М - среднее арифметическое, SD - стандартное отклонение; для признаков с распределением, отличным от нормального, результаты представлены в виде Ме [Q1; Q3], где Me - медиана, Q1 и Q3 - первый и третий квартили. Для обработки данных, имеющих нормальный тип распределения, использовали параметрические методы: t-критерий для независимых группировок, парный t-критерий. При характере распределения данных, отличном от нормального, применяли непараметрические методы: критерий Манна-Уитни, критерий Вальда-Вольфовица, критерий &khgr;², критерий Вилкоксона, критерий знаков. При сравнении более двух независимых группировок использовали методы дисперсионного анализа: параметрический дисперсионный анализ для нормально распределенных данных и ранговый анализ вариаций Крускала-Уоллиса для данных с распределением, отличным от нормального. Для оценки взаимосвязи отдельных показателей использовали корреляционный анализ с расчетом параметрического коэффициента Пирсона или непараметрического коэффициента корреляции Спирмена. Значения показателей считали достоверными при p<0,05.

Клиническая характеристика обследованных больных ССД представлена в табл. 1.

Для определения содержания провоспалительных цитокинов и VEGF в крови и моче у пациентов с ССД в зависимости от длительности заболевания выделены соответствующие группы больных. В 1-ю группу включены больные ССД c длительностью заболевания от 1 года до 5 лет, во 2-ю группу - с длительностью ССД от 5 до 10 лет, в 3-ю группу - с длительностью более 10 лет (табл. 3).

У больных ССД различной длительности заболевания отмечено достоверное повышение уровня MCР-1 в сыворотке крови, VEGF в сыворотке крови и моче, IL-6, IL-8 в моче по сравнению с показателями лиц группы сравнения. Наибольшее повышение уровня цитокинов и VEGF выявлено в моче при длительности заболевания от 5 до 10 лет. Определена тенденция к различию между больными ССД по уровню VEGF в моче (n=25; h=2; p=0,09). Обращает внимание, что при увеличении длительности заболевания уровень VEGF в моче снижается.

Для определения взаимосвязей цитокинов и VEGF в сыворотке крови и моче у пациентов с ССД в зависимости от клинической формы заболевания выделены следующие группы: 1-я группа - больные с диффузной формой ССД, 2-я группа - пациенты с лимитированной формой, 3-я группа - больные с перекрестным синдромом (табл. 4).

У пациентов с ССД вне зависимости от клинической формы заболевания отметили повышение уровня MCP-1 в сыворотке крови, VEGF и IL-8 в моче по сравнению с таковыми у лиц группы сравнения. У больных с перекрестной формой ССД уровень MCP-1 в крови, VEGF и IL-8 в моче в большей степени превышал аналогичные показатели у лиц группы сравнения, чем у пациентов других клинических групп. Несмотря на установленные различия по уровню VEGF в моче больных и здоровых лиц, уровни VEGF в сыворотке крови в указанных группах были сопоставимы.

Для определения взаимосвязей уровня цитокинов и VEGF у пациентов с различной степенью активности ССД выделены 3 группы пациентов: с низкой, умеренной и высокой степенью активности (табл. 5).

У пациентов с различной степенью активности выявлено повышение уровня MCP-1, VEGF в сыворотки крове и VEGF в моче по сравнению с показателями группы сравнения. В сыворотке крови наибольшее повышение уровня VEGF констатировано при высокой степени активности, в моче - при умеренной. Статистически значимых различий между группами больных по уровню VEGF не получено.

Проведен анализ уровня цитокинов и VEGF при наличии и в отсутствие ФА у больных ССД (табл. 6).

У больных ССД с ФА уровни IL-8, VEGF в моче были значительно выше, чем у лиц группы сравнения и у больных ССД без ФА, а уровень MCP-1 в крови у больных с ФА - достоверно выше уровня MCP-1 у больных ССД без ФА (рис. 1).

При проведении непараметрического корреляционного анализа выявлены взаимосвязи уровня IL-6 в сыворотке крови и ОФВ1 (r=–0,6; p=0,01), уровня MCP-1 в крови и ОФВ1 (r=–0,5; p=0,02).

Проведена оценка уровней цитокинов и VEGF в крови и моче при наличии или в отсутствие у больных миокардиофиброза (табл. 7).

У больных ССД без указания на наличие или отсутствие перикардита по сравнению с лицами группы сравнения выявлено повышение уровня MCP-1 и VEGF в крови, IL-8 и VEGF в моче (табл. 8).

В исследовании у пациентов с ССД мы выявили достоверное повышение уровня VEGF как в сыворотке крови, так и в моче по сравнению с лицами группы сравнения. Повышение уровня данного ангиогенного фактора у больных ССД может быть использовано для оценки ДЭ.

У пациентов с ССД установлено существенное повышение уровня провоспалительных цитокинов в крови и моче (IL-6 и MCP-1 в крови; IL-6 и IL-8 в моче), что может указывать на участие данных цитокинов в системном воспалении. Наибольшее повышение уровня MCP-1 в сыворотке крови, IL-8 в моче отмечено при перекрестной форме ССД, что, вероятнее всего, обусловлено сочетанием нескольких нозологических форм, высокой активностью воспалительного процесса и полиорганностью поражения. Мы полагаем, что установленная в настоящем исследовании ассоциация ФА со значительным повышением уровня MCP-1 в сыворотке крови объясняется тем, что MCP-1 характеризует выраженность инфильтрации тканей моноцитами. Повышение уровня IL-6 в сыворотке крови при ССД может регулировать функцию Т- и В-клеток и стимулировать развитие склероза тканей [20]. Определение концентрации IL-6 в сыворотке крови можно использовать для оценки степени активности воспаления, тяжести заболевания, прогноза и эффективности терапии [20].

В моче мы выявили достоверное повышение уровня провоспалительных цитокинов (IL-6, IL-8) по сравнению с показателями у лиц группы сравнения. Повышение уровня IL-6, IL-8 в моче, с одной стороны, приводит к активации воспалительной реакции в интерстициальной ткани, а с другой - способствует формированию гемодинамических и метаболических нарушений на уровне почечных канальцев, мезангиоцитов клубочков [21]. В результате повреждаются стенки сосудов, изменяется тонус сосудистого русла и усугубляется ишемия почечной паренхимы, которая стимулирует секрецию VEGF. Однако, по данным H. Gerber и соавт. [22], при хронических заболеваниях почек уровень VEGF снижается, что связано с высокой степенью тубулоинтерстициального воспаления и макрофагальной инфильтрацией.

G. Red и соавт. [23] выявили, что в стареющей почке снижается пролиферация эндотелия, что связано с дефектом ангиогенеза. Данный факт подтверждается и в нашем исследовании - при длительности заболевания более 10 лет уровень VEGF снижается. Кроме того, при высокой степени активности воспалительного процесса отмечается прогрессивное снижение уровня VEGF в сыворотке крови и моче, что, вероятнее всего, связано с прогрессирующим снижением числа капилляров, обусловленное длительным воспалительным процессом. Мы полагаем, что при наличии миокардиофиброза и перикардита также отмечается снижение уровня VEGF в сыворотке крови и моче, что связано как с высокой степенью воспалительного процесса, так и нарушением экспрессии рецепторов VEGF.

У пациентов с ССД выявлено повышение уровня VEGF и цитокинов в сыворотке крови, что свидетельствует о выраженности ДЭ. Повышение уровня VEGF и цитокинов в моче может указать на вовлечение в воспалительный процесс тубулоинтерстициальной ткани почек при ССД. В прогрессировании заболеваний почек имеет большое значение потеря сосудов микроциркуляторного русла, что связано с дисбалансом экспрессии ангиогенных факторов в почечной ткани. Учитывая выявленные изменения уровней ангиогенеза и цитокинов в крови и моче у пациентов с ССД, можно предполагать, что дальнейшие исследования в этом направлении позволят получить новые данные и определить, где, когда, у каких категорий больных наиболее рационально проводить исследования. Например, изучение уровней VEGF и цитокинов в сыворотке крови можно использовать для оценки выраженности ДЭ, исследование концентрации IL-6 в сыворотки крови - для оценки активности, тяжести и прогноза заболевания, а концентрация МСP-1 - для оценки степени активности воспаления при ФА. Определение уровней IL-6, IL-8 в моче у больных ССД может быть рекомендовано для оценки выраженности тубулоинтерстициального воспаления, а уровня VEGF в моче - для прогнозирования формирования интерстициального фиброза.