ГКС — глюкокортикостероиды

ГМ-КСФ — гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор

ИЛ — интерлейкин

ИФА — иммуноферментный анализ

МБВ-1b — макрофагальный белок-1b воспаления

МХБ-1 — моноцитарный хемоаттрактантный белок 1-го типа

ФЛ — фиброз легких

Th1 — Т-хелпер 1-го типа

Th2 — Т-хелпер 2-го типа

α-ФНО — α-фактор некроза опухоли

γ-ИНФ — γ-интерферон

За последние десятилетия изучение патогенеза поражения легких при саркоидозе позволило существенно расширить представления о механизмах развития гранулематозного воспаления и формирования фиброзных поствоспалительных изменений в легочной ткани. Проведенные исследования показали, что процесс фиброзообразования определяется персистирующими воспалительными стимулами, которые влияют на продукцию факторов роста и синтез фиброгенных цитокинов. При этом продолжаются процессы рекрутирования, пролиферации, дифференцировки и активации различных иммунокомпетентных клеток [1—3]. Начало воспалительного процесса сопряжено с появлением в интерстициальной ткани легких большого количества Т-клеток СD4+, интенсивно синтезирующих множество провоспалительных цитокинов, в том числе γ-интерферон (γ-ИНФ) и интерлейкин (ИЛ) 2. Нарушение апоптоза Т-клеток саркоидных гранулем приводит к хронизации воспаления и, по-видимому, способствует развитию фиброза легких (ФЛ) [2, 3].

Альвеолярные макрофаги являются клетками, представляющими антиген, и инициируют развитие саркоидного воспаления. Эти клетки синтезируют большое количество цитокинов: ИЛ-1, ИЛ-6, α-фактор некроза опухоли (α-ФНО), γ-ИНФ и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) [4]. Продукция супероксидных анионов, кислородных радикалов и протеаз легочными макрофагами, нейтрофилами, эозинофилами и тучными клетками вызывает повреждение базальной мембраны и других структур альвеол, что сопровождается рекрутированием фибробластов и эпителиальных клеток в альвеолярное пространство. Этому способствует действие местных хемоаттрактантов (хемокинов, факторов коагуляции и фибринолиза), а также матриксных протеинов (пептидов коллагена, ламинина, фибронектина и эластина). Синтез альвеолярными марофагами факторов роста (трансформирующего β-фактора роста, тромбоцитарного фактора роста, инсулиноподобного фактора роста 1-го типа) усиливает пролиферацию фибробластов и синтез этими клетками коллагена [5—7].

В настоящее время показанием к назначению стероидной терапии при саркоидозе считают наличие признаков активного системного воспаления, в то время как при развитии ФЛ наиболее эффективными оказываются противофиброзные препараты. Назначение адекватной патогенетической терапии может существенно влиять на течение болезни и определять прогноз заболевания, поэтому актуальной задачей остается поиск маркеров воспалительной активности саркоидоза и формирования фиброзных изменений в пораженных органах. Вместе с тем одновременное существование большого количества иммунопатологических процессов, регулируемых множеством факторов, затрудняет разработку методов для оценки развития заболевания.

В последние годы в иммунологических лабораториях используется метод мультиплексного анализа, который позволяет проводить одновременную оценку уровней множества цитокинов в одном образце [8, 9]. Его использование при саркоидозе может оказаться полезным для выявления тенденций в течении иммунопатологического процесса и проведения обоснованной патогенетической терапии.

Целью настоящего исследования было выявление особенностей иммунопатологического процесса у больных с различными клинико-рентгенологическими вариантами саркоидоза легких на основании одномоментной оценки цитокинового профиля периферической крови.

В исследование включали некурящих пациентов с морфологически верифицированным саркоидозом легких и внутригрудных лимфоузлов без тяжелых сопутствующих заболеваний. Обследован 41 пациент (30 женщин и 11 мужчин) в возрасте от 32 до 65 лет (средний 46,5 года). У 22 больных (группа А) отмечались признаки активности системного воспаления в виде периодического субфебрилитета, снижения массы тела, стойкого повышения уровня неоптерина в плазме крови либо прогрессирующих рентгенологических изменений в легочной паренхиме. В дальнейшем 13 пациентам этой группы проведено лечение системными глюкокортикостероидами — ГКС (преднизолон в начальной суточной дозе 0,3—0,5 мг/кг с переходом на поддерживающую дозу 0,2—0,3 мг/кг/сут в течение 6 мес). У 19 больных (группа Н) признаков активности саркоидного воспаления не выявлено; из них у 14 обнаружились рентгенологические проявления выраженного ФЛ.

Исследовали исходные концентрации ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-18, α-ФНО в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа (ИФА) на коммерческих наборах Bender Med Systems, а также уровень неоптерина на наборах IBL (Австрия), LOT 65769047, 68238023, 67256016, 71074016, 130228, соответственно. Количество определяемых значений составляло 96. Предел чувствительности измерения для ИЛ-2 0,1 пг/мл, для ИЛ-4 0,2 пг/мл, для ИЛ-18 9,2 пг/мл, для α-ФНО 2,3 пг/мл, для неоптерина 0,7 ммоль/л.

В 13 случаях исследование повторяли после курса терапии ГКС. У 9 больных с признаками выраженного ФЛ концентрацию цитокинов в сыворотке крови определяли с использованием технологии xMAP (27-plex) на анализаторе BioPlex-200 («Bio-Rad», США). Использовали наборы Bio-Plex Pro Human Cytokine Standard Group I 27-Plex («Bio-Rad», США). Число определяемых значений для анализатора BioPlex-200 составляло 27, предел чувствительности метода — 0,7 пг/мл.

Контрольную группу составили 30 здоровых доноров. Исследуемые сыворотки хранили при температуре –70 °С.

Статистическую обработку данных осуществляли с использованием пакета программ Stаtistica 6.0 (StatSoft, США) методами дискриптивной статистики и дисперсионного анализа. При сравнении уровней цитокинов у пациентов различных групп использовали критерий Манна—Уитни (различия по уровню α-ФНО оценивали методом χ² с применением точного критерия Фишера). При оценке динамики концентрации цитокинов использовали тест Вилкоксона. Результаты представлены в виде медианы (Ме) с интерквартильным размахом (25-й процентиль; 75-й процентиль) либо в виде среднего значения показателя и его стандартной ошибки. Различия считали достоверными при p<0,05.

В общей группе больных уровень ИЛ-2 крови тесно коррелировал с количеством неоптерина (r=0,44; p<0,04), что свидетельствует о согласованности механизмов воспаления при саркоидозе. Подобная закономерность отмечается в исследованиях ряда авторов и объясняется участием ИЛ-2 в активации альвеолярных макрофагов (в частности, ИЛ-2 усиливает выработку ГМ-КСФ этими клетками) [2, 10, 11].

У 6 из 10 включенных в исследование больных без признаков активного течения болезни уровень α-ФНО в крови оказался ниже пределов чувствительности используемого метода ИФА, у остальных 4 пациентов этой группы его значения соответствовали 5,4, 3,1, 5,0 и 5,1 пг/мл, в то время как у 22 пациентов с проявлениями воспалительной активности саркоидоза все значения были определяемы. Различия между группами больных по уровню α-ФНО оказались достоверными (р=0,015) и значительно выше в группе А (табл. 1).

Уровень ИЛ-4 (цитокина, синтезируемого главным образом Т-хелперами 2-го типа — Th2), в группах А и Н не различался, однако отношение ИЛ-4/ИЛ-2 оказалось достоверно выше при неактивном течении заболевания (см. табл. 1).

Для больных с ФЛ было характерно значительное повышение отношения ИЛ-4/ИЛ-2 в отличие от остальных пациентов (326,4±122,6 и 88,2±28,6% соответственно; р=0,002) (см. рисунок).

В настоящем исследовании не удалось выявить достоверного различия отношения ИЛ-4/ИЛ-2 в крови у больных саркоидозом с ФЛ и у пациентов с саркоидозом неактивного течения без признаков ФЛ, что было связано с малым числом наблюдений при выраженной вариабельности полученных данных.

Длительная терапия ГКС у 13 больных с признаками воспалительной активности саркоидоза привела к значительному улучшению клинико-рентгенологической картины и достоверному снижению уровня провоспалительных цитокинов в крови (табл. 2).

Исследование цитокинового профиля, включающего цитокины и хемокины моноцитарно-макрофагального, Th1- и Th2-клеточного происхождения и факторы фиброзообразования у больных с выраженным ФЛ и здоровых доноров, выявило следующие закономерности (табл. 3).

В настоящее время γ-ИНФ считается одним из ключевых триггеров воспаления при саркоидозе и экспрессируется главным образом клетками Th1 [10]. Участвуя в реакции гиперчувствительности замедленного типа, γ-ИНФ способствует повышению фагоцитарной активности легочных макрофагов, синтезу молекул ко-стимуляции и хемокинов семейства СХС, а также препятствует апоптозу клеток. При этом γ-ИНФ оказывает антифибротическое действие, ингибируя пролиферацию эндотелиальных клеток и синтез фибробластами коллагена в легочной ткани. В проведенном исследовании уровень γ-ИНФ в крови больных с ФЛ оказался существенно ниже, чем в группе здоровых доноров. Данные изменения не были ожидаемыми и, возможно, объясняются значительным снижением синтеза этого цитокина клетками Th1 в условиях редукции саркоидного воспаления при прогрессировании ФЛ.

МБВ и МХБ являются важными хемокинами, участвующими в привлечении и иммобилизации иммунокомпетентных клеток в зонах воспаления [11]. У пациентов с ФЛ снижение концентрации этих провоспалительных цитокинов в крови сопровождалось одновременным повышением уровня ИЛ-4, относящегося к кофакторам пролиферации фибробластов, который синтезируется в основном Т-хелперами 2-го типа.

Полученные результаты согласуются с концепцией нарушения баланса цитокинов Тh1/Th2 при развитии фиброза в легочной ткани. Согласно этой концепции появление ФЛ связано с возрастанием функциональной активности клеток Th2 и снижением синтетической активности клеток Th1, что приводит к соответствующему смещению цитокинового равновесия [3, 12].

Выявленное в данном исследовании повышение отношения ИЛ-4/ИЛ-2 при выраженном ФЛ соответствует преобладанию функциональной активности Th2 над Th1. Мы полагаем, что исследование соотношения цитокинов Th1 и Th2 у больных саркоидозом легких целесообразно для ранней диагностики ФЛ и определения показаний к назначению патогенетической противовоспалительной и противофиброзной терапии. Увеличение отношения ИЛ-4/ИЛ-2 в периферической крови при саркоидозе может свидетельствовать о начавшемся процессе фиброзообразования в легочной ткани.

У пациентов с ФЛ по сравнению со здоровыми донорами обнаружены нормальное содержание в крови ИЛ-12 (макрофагального цитокина, инициирующего активность клеток Th1 на этапе формирования саркоидных гранулем) и существенное снижение уровня ИЛ-8. Синтезируемый преимущественно легочными фибробластами ИЛ-8 относится к хемокинам семейства СХС и играет важную роль в привлечении Т-лимфоцитов и нейтрофилов в легочную ткань. Уменьшение концентрации этого хемокина в крови при ФЛ можно расценивать как признак редукции воспалительной активности заболевания [3, 4]. Вместе с тем повышение уровня ИЛ-1β в крови при одновременном снижении концентрации ИЛ-1ra (специфического антагониста рецепторов к ИЛ-1) свидетельствует о сохранении провоспалительного потенциала циркулирующих моноцитов и альвеолярных макрофагов у больных с выраженным ФЛ.

Полученные результаты позволяют считать, что при саркоидозе развитие и прогрессирование ФЛ происходит на фоне смещения равновесия цитокинов Th1/Th2 в сторону Th2, проявляющегося повышением отношения ИЛ-4/ИЛ-2 и снижением уровня γ-ИНФ в периферической крови, что можно использовать для ранней диагностики ФЛ при этом заболевании.

У больных саркоидозом с признаками ФЛ в отсутствие симптомов воспалительной активности заболевания обнаруживаются повышение уровня провоспалительного цитокина ИЛ-1 и снижение количества антагониста рецепторов к ИЛ-1 в периферической крови, что свидетельствует о сохраняющейся активности текущего гранулематозного воспаления.