ГП — гриппозная пневмония

ОРДС — острый респираторный дистресс-синдром

ПЦР — полимеразная цепная реакция

eNOS — эндотелиальная NO-синтаза

IL-10 — интерлейкин-10

s-ICAM-1 — растворимая молекула межклеточной адгезии 1-го типа

TNF-α — α-фактор некроза опухоли

В июне 2009 г. ВОЗ объявила о начале первой в новом тысячелетии пандемии гриппа. В России в числе первых пострадавших регионов был Забайкальский край [1]. Особенностью гриппа А/H1N1 явилась высокая частота развития пневмоний. У некоторых больных поражение легочной ткани и осложнения на этом фоне развивались стремительно, несмотря на интенсивную терапию в условиях реанимационного отделения. В крае было зарегистрировано 57 летальных исходов [2]. По данным патолого-анатомических исследований у всех умерших выявлены признаки острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС) [2, 3].

Высокая частота развития поражения легких при гриппе A/H1N1 объясняется тропностью вируса к эпителиальным клеткам, в том числе к эндотелию, что определяет характерную клиническую картину гриппа и пневмонии на этом фоне [4]. Повышенная проницаемость капилляров легких, а также чрезмерная индукция цитокинов, повреждение эндотелия служат основными механизмами развития ОРДС [5].

Одним из аспектов изучения пневмоний является анализ показателей иммунной системы, в частности цитокинов, имеющих как диагностическое, так и прогностическое значение. В свою очередь известно, что уровень иммунной реактивности организма закреплен генетически [6, 7]. К настоящему времени имеются единичные сведения о роли полиморфизма генов цитокинов в иммунопатогенезе пневмоний, однако эти данные широко варьируют [8]. Не разработаны также методы выявления предрасположенности к нарушениям в системе регуляции сосудистого тонуса, обусловленных мутациями в генах [9].

Целью настоящего исследования явилось изучение особенностей полиморфизма генов цитокинов (TNF G308A, IL-10 C592A, IL-10 C819T, IL-10 G1082A) и гена регуляции сосудистого тонуса (еNOS C786T) у пациентов с гриппом A/H1N1, осложненным пневмонией.

Обследовали пациентов, находившихся на лечении по поводу пневмонии на фоне высокопатогенного гриппа в стационарах города Читы в период с октября по декабрь 2009 г. Грипп А/H1N1 верифицирован методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) и при реакции торможения гемагглютинации: 1-я группа (n=37) — пациенты с тяжелыми пневмониями на фоне гриппа А/H1N1; 2-я (n=74) — больные с нетяжелыми пневмониями на фоне гриппа А/H1N1. Оценка тяжести пациентов в стационаре основывалась на степени дыхательной недостаточности, выраженности интоксикации, объеме воспалительной инфильтрации, наличии осложнений, декомпенсации сопутствующих заболеваний [10].

В 3-ю группу (n=68) вошли здоровые лица. Все группы были сопоставимы по полу и возрасту (средний возраст 40,5±12,7 года).

Молекулярно-генетическое исследование проводили методом ПЦР с аллельспецифичными праймерами (НПФ «Литех», Москва). ДНК выделяли при помощи наборов ДНК-экспресс кровь (НПФ «Литех», Москва). Детекцию продуктов амплификации проводили электрофоретическим способом в 3% агарозном геле.

Концентрацию α-фактора некроза опухоли (TNF-α), интерлейкина-10 (IL-10) и растворимой молекулы межклеточной адгезии 1-го типа (s-ICAM-1) исследовали при гриппозных пневмониях (ГП) в 1—2-й день пребывания больных в стационаре методом твердофазного иммуноферментного анализа с помощью реактивов Вектор-Бест и Bender Medsystems соответственно.

Статистическую обработку данных проводили при помощи пакета программ Statistica 6.0. При сравнении групп использовали критерий Манна—Уитни. Для сравнения групп по качественному бинарному признаку применяли критерий χ² (точный критерий Фишера). Для определения частот аллельных вариантов генов использовался закон Харди—Вайнберга.

Анализ полученных данных показал, что распределение частоты генотипов и аллелей в группе больных гриппом А/Н1N1 и здоровых лиц для изучаемых полиморфных маркеров соответствовало закону Харди—Вайнберга.

Молекулярно-генетические исследования выявили, что гомозиготное носительство аллеля G полиморфизма (308 G/A) гена TNF в 1,5 раза (p=0,005) чаще наблюдалось у пациентов с ГП, в то время как гетерозиготы G/A встречались в 1,7 раза (p=0,005) реже среди больных, чем в контрольной группе (см. таблицу).

Как было показано ранее [11], концентрация TNF-α в периферической крови у больных ГП при тяжелом течении заболевания в 1,7 раза была выше, чем у пациентов с нетяжелым поражением. При изучении продукции TNF-α в крови в зависимости от полиморфизма (308 G/A) гена изучаемого цитокина значимых различий не выявили.

Сравнительное исследование частот генотипов полиморфных локусов IL-10 продемонстрировало, что носителей гомозиготного аллеля С полиморфизма (592 C/A) гена IL-10 в группе пациентов, заболевших гриппом, зарегистрировано в 2 раза (p=0,0002) больше, чем в контроле, а гетерозигот С/А было в 1,9 раза (p=0,0008) больше среди здоровых лиц. Не обнаружено различий между группами по распространенности генотипа А/А. Примечательно, что в группе пациентов с ГП распространенность аллеля С больше, чем в контрольной группе (р=0,03) (см.таблицу).

При изучении полиморфизма (819 C/Т) гена IL-10 не выявлено различий по распространенности генотипов С/С и С/Т в изучаемых группах. Распространенность гомозиготного носительства Т/Т среди представителей контрольной группы была в 2,2 раза (р=0,03) выше, чем у заболевших пневмонией на фоне гриппа А/H1N1. Различий между группами по частоте аллельных вариантов не отмечено (см. таблицу).

Анализ полиморфизма (1082 G/A) гена IL-10 показал, что гомозиготное носительство аллеля G встречалось в 1,8 раза (р=0,000) среди пациентов с ГП, в то время как гетерозиготы G/A — в 2,6 раза (р=0,0001) чаще среди здоровых лиц. Не обнаружено существенных различий между группами по распространенности аномальной гомозиготы А/А. Отмечено, что частота аллеля G в большей степени (р=0,006) доминирует среди больных гриппом по сравнению с контролем (см. таблицу).

При сравнении генетических вариантов IL-10 в зависимости от степени тяжести пневмонии различий не выявлено. Не обнаружено достоверных различий и по содержанию IL-10 в сыворотке крови заболевших с различными полиморфизмами изучаемого цитокина. Уровень противовоспалительного цитокина IL-10 в крови различался у пациентов в зависимости от тяжести ГП — максимальные уровни выявлены в группе больных с меньшей степенью тяжести, что свидетельствовало о его подавляющей роли в отношении провоспалительных цитокинов [11].

Исследование полиморфизма гена эндотелиальной NO-синтазы — eNOS (786 С/Т) у заболевших пневмонией на фоне гриппа А/H1N1 и здоровых индивидуумов показало, что распространенность гомозиготного аллеля С не различалась в изучаемых группах. Гетерозиготы C/Т в 2 раза (р=0,001) чаще наблюдались в контрольной группы, а аномальная гомозигота Т/Т оказалась в 2 раза (р=0,005) более распространенной среди заболевших ГП (см. таблицу).

Следует отметить, что у носителей гетерозиготы С/Т полиморфизма (786 С/Т) гена eNOS выявлено меньшее содержание одного из маркера активации эндотелия — s-ICAM-1 — в периферической крови по сравнению с другими генотипами изучаемого полиморфизма (р<0,05).

Известно, что реализация воспалительного ответа у разных лиц может существенно различаться по интенсивности и продолжительности. В связи с этим значительный интерес представляет функциональный полиморфизм генов цитокинов, так как именно эти медиаторы вносят наибольший вклад в регуляцию иммунитета [6]. TNF-α является одним из наиболее значимых цитокинов при развитии патологии, и генетически запрограммированный повышенный или пониженный синтез фактора некроза опухолей сказывается на реактивности иммунной системы [12]. Промоторная зона гена TNF-α включает 8 полиморфных участков с единичными нуклеотидными заменами; важной для человека считается замещение гуанина аденином в положении 308 G/A [7, 12]. Ряд работ продемонстрировал, что полиморфизм -308А повышает транскрипционную активность гена TNF и соответственно продукцию цитокина. Так, высокопродуцирующий аллель -308А был ассоциирован с ревматоидным артритом и системной красной волчанкой, тогда как низкопродуцирующий аллель -308G — c заболеваемостью туберкулезом [13]. Вероятно, функциональный полиморфизм гена TNF (-308A), связанный с повышенной продукцией данного цитокина, служит фактором риска развития тяжелых проявлений инфекционных заболеваний и развития аутоиммунных расстройств. Однако нарушения механизмов иммунной защиты от патогенов в большей степени ассоциируются с низкопродуцирующим вариантом полиморфизма гена TNF (-308G) [12].

В работе Е.А. Байгозиной при изучении больничных пневмоний риск развития заболевания оказался выше у носителей генотипов G/А + А/А. У больных при носительстве генотипа А/А гена TNF наблюдалась максимальная концентрация данного цитокина в сыворотке крови по сравнению с таковой у носителей генотипов G/G и G/А, что обуславливало патогенетическое действие данного полиморфизма [8]. Однако полученные нами данные, напротив, продемонстрировали, что генотип G/G полиморфизма (308 G/A) гена TNF у пациентов с пневмониями на фоне гриппа А/H1N1 встречается чаще, чем в контрольной группе. Причем у всех 5 пациентов с ОРДС выявлено носительство гомозиготы G/G, 3 из них умерли. Аналогичные данные при гриппе А/H1N1 получены в исследованиях А.А. Петрова и соавт. [14]. При изучении продукции TNF-α в сыворотке крови в зависимости от генетических вариантов полиморфизма (308 G/A) гена TNF в нашей работе различий не обнаружено.

IL-10 — наиболее активный противовоспалительный цитокин. B. Schaaf и соавт. обнаружили, что концентрация IL-10 в сыворотке крови у больных с сепсисом и генотипом -1082 G/G была выше, чем у носителей генотипа А/А или А/G. Это ассоциировалось с высоким уровнем летальности [15]. P. Gallagher и соавт. выявили ассоциацию между генотипом -1082 G/G, степенью тяжести пневмонии и уровнем летальности [16]. M. Gong и соавт. продемонстрировали взаимосвязь между генотипом -1082 G/G и развитием ОРДС [17]. В нашем исследовании аллель G гена IL-10 (1082 G/A) значительно доминировал у пациентов с ГП (84,5%), преимущественно в виде гомозиготного носительства. Кроме того, данный генотип по сравнению с другими исследуемыми генетическими полиморфизмами явился наиболее распространенным среди заболевших — был выявлен в 76% случаев, включая пациентов с ОРДС.

Из немногочисленных данных о роли полиморфизма (592 С/А) гена IL-10 при инфекционных заболеваниях известно, что у больных туберкулезом преобладало гомозиготное носительство аллеля А. При этом у пациентов выявлены максимальные уровни IL-10, а у больных с генотипом С/С обнаружен наиболее низкий уровень изучаемого цитокина [18]. В нашей работе частота аллеля С гена IL-10 (592 C/A) оказалась выше среди пациентов, заболевших гриппом, при этом превалировал генотип С/С. Распространенность гомозиготы А/А у больных и здоровых лиц не различалась.

Не обнаружено различий по распространенности аллельных вариантов гена IL-10 (819 C/Т), а также по частоте генотипов С/С и С/Т в изучаемых группах. В то же время гомозиготное носительство Т/Т определялось у большего числа представителей контрольной группы по сравнению с заболевшими пневмонией на фоне гриппа А/H1N1.

Примечательно, что концентрация IL-10 в крови не различалась при сравнении показателей у пациентов с различными генетическими вариантами изучаемого цитокина, а зависела от степени тяжести пневмонии [11].

Известно, что при гриппе в основе поражения различных органов и систем большую роль играют циркуляторные расстройства [4], в этой связи особый интерес представляет выявление предрасположенности к нарушениям в системе регуляции сосудистого тонуса. К эндотелиальным факторам дилатации относится оксид азота (NO). Кроме того, NO угнетает пролиферацию клеток в гладкомышечном слое сосудов, ингибирует агрегацию тромбоцитов и адгезию нейтрофилов к эндотелию сосудов, способен вызывать повреждение клеток, в частности эндотелия, путем генерации свободных радикалов [19].

В работе K. Marco и соавт. установлено, что к уменьшению концентрации NO в кровеносном русле предрасполагает вариант -786 C гена еNOS [20].

Исследование полиморфизма гена еNOS (786 С/Т) у заболевших пневмонией на фоне гриппа А/H1N1 выявило преобладание аномальной гомозиготы Т/Т. Гетерозиготы C/Т в 2 раза чаще наблюдались в контрольной группе. Полученные нами факты согласуются с результатами исследований Е.С. Кострюкова и соавт., в которых в небольшой группе пациентов с тяжелым течением гриппа А/H1N1, включая 5 случаев с летальным исходом, продемонстрированы аналогичные данные [9].

При сопоставлении генотипа eNOS c содержанием s-ICAM-1 — одного из маркера активации эндотелия, выявлена меньшая концентрация изучаемого показателя у носителей гетерозиготы С/Т полиморфизма (786 С/Т) гена eNOS.

Таким образом, полученные нами данные продемонстрировали, что по сравнению с контрольной группой у пациентов с ГП встречалось чаще гомозиготное носительство аллеля G полиморфизма (308 G/A) гена TNF. Это могло обусловить нарушения механизмов иммунной защиты. Значительно преобладал у пациентов с ГП аллель G гена IL-10 (1082 G/A), преимущественно в виде гомозиготного носительства, что согласуется с данными других исследований при пневмониях. Среди заболевших гриппом превалировал аллель С гена IL-10 (592 C/A), в большей степени в виде гомозиготного варианта. Изучение распространенности аллельных вариантов гена IL-10 (819 C/Т) не выявило различий в изучаемых группах, а гомозиготное носительство Т/Т оказалось значительно выше среди здоровых лиц. Взаимосвязь между тяжестью пневмонии и генотипами не обнаружена. Не выявлено различий и при изучении концентрации цитокинов TNF-α и IL-10 в сыворотке крови в зависимости от генетических вариантов изучаемых полиморфизмов. В то же время констатировано преобладание аномальной гомозиготы Т/Т полиморфизма (786C/Т) гена еNOS среди заболевших ГП; напротив, в контрольной группе выявлены преимущественно носители гетерозиготы C/Т. В группе пациентов с наличием «протективного» генотипа C/Т содержание s-ICAM-1 было ниже, чем при других вариантах полиморфизма (786 C/Т). В соответствии с этим изучение генетического статуса пациента при гриппе А/H1N1 позволит оценивать тяжесть заболевания и прогнозировать возможные осложнения.