В последние 6—7 лет резко возросло злоупотребление лекарственными средствами из группы холиноблокаторов: циклопентолатом (цикломед) и тропикамида гидрохлоридом, которые применяются в офтальмологии в виде капель с диагностической целью для расширения зрачка [1]. Люди, страдающие наркозависимостью, используют данное лекарственное средство перорально или внутривенно для усиления эйфории, обусловленное последующим приемом опиатов и опиоидов, а также индивидуально для одурманивающего эффекта. Препараты тропикамида вызывают сильнейшее привыкание и психическую зависимость, регулярные инъекции приводят к тяжелым последствиям в очень короткие сроки [2—6].
Тропикамид токсичен для теплокровных организмов: LD50 для крыс составляет 865 мг/кг при пероральном, 1210 мг/кг — при интраперитонеальном и 1210 мг/кг — при подкожном введении [6]. В литературе отсутствуют сведения о фармакокинетических показателях, что затрудняет возможность лабораторной диагностики при немедикаментозном применении тропикамида, особенно для выявления сроков давности и периодичности его употребления [6—12].
Цель исследования — разработка подхода к ретроспективному определению тропикамида в биологических жидкостях (крови и моче) и волосах.
Материал и методы
Исследование проводилось с использованием субстанции тропикамида по НД ФС 001723-211217. Гидролиз проводили с помощью ферментов папаин (ЗАО «Вектон»), химотрипсин, химопсин и гиалуронидаза (ООО «Самсон-Мед»), субстанция трилона Б (чда), субстанция цистеина.
Анализ экстрактов из крови и мочи выполняли на жидкостном хроматографе Shimadzu LC-20Prominence (Япония) с диодноматричным детектором SPD-M20A, колонка Shim-pack VP-ODS (5 мкм, 150 мм * 4,6 мм). Температура термостата колонки — 30 °C; объем пробы — 20 мкл. Регистрация поглощения осуществлялась при длине волны 210 нм. Управление прибором и обработка хроматограмм проходила с использованием программы LabSolution. Скорость потока элюента (0,025 М раствора калия гидрофосфата (pH=3): ацетонитрил 85:15) для аналитической колонки — 0,5 мл/мин.
Для исследования экстрактов из шерсти применяли метод газовой хроматографии с масс-селективным детектированием (ГХ-МС) на приборе Agilent Technologies (США) 7890 A/5977 MSD, управление осуществлялось с помощью программы MassHunter GC/MS, обработку полученных данных выполняли в программах Chemstation Data Analysis, AMDIS (The Automatic Mass Spectral Deconvolution and Identification System), MassHunter Quantitative Analysis (США). Идентификацию пиков проводили в библиотеках NIST MS Search 2.2, Pmw_TOX3.1.
Предварительно были разработаны методики обнаружения и количественного определения тропикамида в извлечениях из биожидкостей методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и из шерсти с помощью ГХ-МС [9, 11]. Градуировочные графики имеют линейную зависимость в диапазоне исследуемых концентраций (10—200 мкг/мл), 0,99 ≤ R ≤1,0. Определялось значение валидационных параметров сходимости (относительное стандартное отклонение RSD%), не превышающее 2%, по показателю прецизионность не превышает 2%, открываемость (Recovery, %) находится в диапазоне 99,5—100,5%, что соответствует критерию приемлемости [12, 15, 16].
При моделировании длительного употребления тропикамида использовали лабораторных животных, крыс-самцов белого и коричневого природного окраса, возрастом около 6 мес и массой 200—250 г. Содержание лабораторных животных в экспериментально-биологической клинике (виварии) центра клинической фармакологии ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный химико-фармацевтический университет» осуществлялось в соответствии с международной системой правил и требований к лабораториям, которые занимаются изучением воздействия новых химических соединений на окружающую среду и здоровье человека (Good Laboratory Practice, GLP) [11—14, 17, 18].
Лабораторным животным в течение 28 дней один раз в сутки в хвостовую вену вводили 0,5 мл 1% раствора тропикамида, что соответствует 40 мг/кг массы тела животного. Суточную мочу получали у крыс с использованием метаболических клеток, что позволяло обеспечить разделение фекалий и мочи животного и минимизировать стресс у животных в процессе эксперимента [19, 20]. Сбор образцов крови осуществляли при помощи надреза десны пипеткой [21]. После 28 дней введения лабораторным животным раствора тропикамида данный этап эксперимента прекращали, проводили сбор суточной мочи и состригали волосы со спины и боков туловища животного. Далее сбор волос проводили каждые 28 дней.
Получение данных об эффективности методик пробоподготовки крови (прямой жидкость-жидкостной экстракции (ЖЖЭ), твердофазной экстракции (ТФЭ) и ферментативного гидролиза (ФГ)) для тропикамида проводили на обогащенных модельных образцах донорской крови: к 2,5 мл крови добавляли 2,5 мл раствора тропикамида с концентрацией 1 мг/мл в фосфатном буфере с pH=7,4 среды, тщательно перемешивали с использованием роторной мешалки (в течение 5 мин возвратно-поступательными движениями со скоростью 44 об/мин). Модельный комплекс инкубировали в течение 1 ч в термостате при 37 °C [22, 23]. Затем тропикамид извлекали с использованием следующих методик:
1) ЖЖЭ хлороформом: к 2,5 мл образца биожидкости добавляли 25% водный раствор аммиака до значений pH=9 и 2,5 мл хлороформа, перемешивали на мультиротаторе MultiBioRS-24, центрифугировали в течение 10 мин, отбирали нижний хлороформный слой, экстракцию повторяли еще один раз. Хлороформные извлечения объединяли и выпаривали до сухого остатка.
2) ТФЭ на патроне марки Oasis HBL: патроны промывали 1 мл 96% метанолома и 1 мл воды очищенной со скоростью 1 мл/мин. Через колонку пропускали 1 мл центрифугата мочи или центрифугата крови со скоростью 0,5 мл/мин и проводили элюирование 1 мл раствора аммония гидроксида 5%, второе элюирование — 1 мл метанола. Следующее элюирование проводили 1 мл 2% раствора кислоты уксусной в метаноле. Элюат выпаривали досуха, сухой остаток растворяли в 1 мл воды очищенной и количественно определяли методом ВЭЖХ [24].
3) Образцы крови также гидролизовали протеазами по методике химотрипсина, химопсина и трипсина: к 5,0 мл крови добавляли 5 мл 0,2% раствора фермента в 0,1 моль/л растворе аммония гидрокарбоната. Смесь аккуратно перемешивали и инкубировали при температуре 37 °C в течение 1 ч [25]. Далее поступали, как описано в п. 1.
4) ФГ папаином: к 5 мл модельного комплекса добавляли 5 мл раствора папаина (содержание папаина — 0,1 г) в смеси, состоящей из 3 мл раствора ацетатного буфера с pH=4,7, 1 мл 0,002 моль/л раствора трилона Б (для связывания ионов тяжелых металлов, инактивирующих фермент) и 1 мл 0,1% раствора цистеина. Полученные пробы термостатировали при 37 °C в течение 1 ч [25]. Далее поступали, как описано в п. 1.
5) ФГ гиалуронидазой: к 5 мл биожидкости добавляли 5 мл 0,2% раствора гиалуронидазы, предварительно растворенном в ацетатном буфере с pH=4,7. Пробы термостатировали при 37 °C 1—2 ч. Инкубировали полученный раствор при 37 °C в течение 1 ч. Охлажденные пробы центрифугировали, центрифугат отбирали. Коррекцию до pH=9—10 с помощью водного раствора аммиака и экстракцию хлороформом проводили, как описано в п. 1 [26].
Образцы волос подвергли деконтаминации: в стеклянном стакане, заливали водой очищенной до покрытия частиц биообъекта (в объеме примерно 9—10 мл) в течение 10 мин при комнатной температуре, постоянно перемешивали, промывали от внешних загрязнений. Процедуру повторяли, используя метанол. Волосы измельчали ножницами до размера 3—5 мм, затем в шаровой мельнице до консистенции пудры.
Пробоподготовку проводили по следующим методикам [6, 10, 13—16]:
1) ФГ протеазами: точную навеску около 100 мг порошка волос помещали в коническую пробирку, добавляли 4 мл фосфатного буфера, содержащего фермент (химопсин или химотрипсин) или 4 мл 0,5 мг/мл раствора папаина в ацетатном буферном растворе, содержащем 0,1% раствор трилона Б и 0,1% раствора цистеина, плотно укупоривали и термостатировали при 37 °C в течение 3 ч. Затем пробу центрифугировали при 4600 об/мин в течение 10 мин и отбирали центрифугат. К осадку добавляли вторую порцию раствора фермента в равном объеме (4 мл), перемешали и термостатировали следующие 3 ч при 37 °C. Полученную пробу вновь центрифугировали при 4600 об/мин в течение 10 мин, отбирали центрифугат. Общее время гидролиза составляет 6 ч. Из объединенного гидролизата проводили экстракцию при pH=9—10, экстрагировали 3 порциями хлороформа по 2 мл. Полученные вытяжки объединяли и выпаривали досуха. Сухой остаток растворяли в 500 мкл комплексного растворителя и анализировали методом ГХ—МС.
2) ФГ гиалуронидазой [10, 26]: точную навеску около 100 мг порошка волос (шерсти) помещали в коническую пробирку, добавляли 6 мл 0,5 мг/мл раствора гиалуронидазы в ацетатном буфере, плотно укупоривали и термостатировали при 37 °C в течение 3 ч. Затем пробу центрифугировали при 4600 об/мин в течение 10 мин и отбирали центрифугат. К осадку добавляли вторую порцию раствора фермента в равном объеме (4 мл), перемешивали и термостатировали следующие 3 ч при 37 °C. Полученную пробу вновь центрифугировали. Общее время гидролиза — 6 ч. Из объединенного центрифугата проводили экстракцию по методике, представленной выше.
Пробоподготовка образцов волос щелочным гидролизом для получения сравнительных результатов. К навеске образца волос (шерсти) массой около 100 мг добавляли 1 мл 2 моль/л раствора калия гидроксида, термостатировали при 37 °C в течение 12 ч. Гидролизат охлаждали, извлечение проводили методом жидкость-жидкостной экстракции порциями хлороформа по 2 мл 3 раза при pH=10—11 [14, 17].
Полученные данные обрабатывали методами математической статистики в соответствии с рекомендациями Государственной Фармакопеи РФ XIV Общая фармакопейная статья 1.1.0013.15 «Статистическая обработка результатов химического эксперимента» [12, 15] с помощью программы Microsoft Excel 2010. Рассчитывали среднее значение и стандартное отклонение показателей в каждой исследуемой группе. Статистическую значимость различий оценивали с вероятностью p<0,1.
Результаты и обсуждение
Волосы — одна из высокоинформативных тканевых структур, которые обладают второй после костного мозга метаболической активностью. Поступившие в волос вещества не подвергаются метаболизму в его ткани и, единожды включившись в организм, не вступают с ним в обратную связь, откладываются в волосах, составляя «архив» организма [6—8, 12].
Практика обязательного направления на исследование волос с целью установления факта употребления запрещенных и\или лекарственных веществ с немедикаментозной целью для решения вопросов в рамках судебного разбирательства уже давно введена в странах Европы, например, в Германии. Граждан по решению суда направляют для обязательного прохождения теста в случае окончания срока лишения лицензии на право управления транспортным средством водителем по причине управления в состоянии наркотического опьянения [27, 28]. В России данные исследования только регламентируются приказом Минздрава России от 18.12.15 №933н (ред. от 25.03.19) «О порядке проведения медицинского освидетельствования на состояние опьянения (алкогольного, наркотического или иного токсического)» [29].
Разработанные и валидированные методики ферментативного гидролиза биожидкостей и волос (шерсти) дали механизм, позволяющий провести исследования с высокой степенью достоверности [16, 30]. С целью ретроспективного анализа, т.е. выявления возможности определения срока давности последнего приема лекарственного вещества, проводили моделирование на лабораторных животных. После длительного периода введения в течение 6—8 мес лабораторным животным прекращали давать тропикамид, в интервале от 6 ч до 12 дней собирали суточную мочу. Пробоподготовку биологических жидкостей проводили по представленным методикам (рис. 1). Результаты количественного определения тропикамида в извлечениях из биологических жидкостей представлены в табл. 1.
Рис. 1. Хроматограмма извлечения тропикамида из крови лабораторного животного методом ЖЖЭ после ферментативного гидролиза.
Таблица 1. Результаты статистической обработки данных количественного содержания тропикамида в экстрактах из образцов биологических жидкостей
| Методика изолирования | Метрологические характеристики | ||||
| степень экстракции | S | ε, % | RSD, % | ||
| мкг/мл | X ± X , % | ||||
| Кровь* | |||||
| Ферментативный гидролиз папаином | 338,0 | 34,26±2,47 | 1,16 | 7,20 | 3,38 |
| Ферментативный гидролиз химопсином | 317,7 | 31,80±3,02 | 1,50 | 9,49 | 4,71 |
| Ферментативный гидролиз химотрипсином | 305,9 | 30,59 ±3,63 | 1,70 | 11,85 | 5,56 |
| Ферментативный гидролиз трипсином | 322,2 | 31,09±5,00 | 2,35 | 16,09 | 7,55 |
| Ферментативный гидролиз гиалуронидазей | 509,3 | 50,98±5,38 | 2,89 | 10,56 | 5,68 |
| Жидкость-жидкостная экстракция | 309,1 | 20,01 +2,23 | 1,59 | 5,51 | 5,54 |
| Твердофазная экстракция Oasis HLB | 198,32 | 28,30±1,19 | 1,59 | 0,93 | 5,68 |
| Моча** | |||||
| Жидкость-жидкостная экстракция | 152,46±6,67 | — | 8,76 | 0,32 | 5,71 |
| Твердофазная экстракция Oasis HLB | 141,01±21,30 | — | 28,16 | 0,71 | 19,97 |
| Ферментативный гидролиз гиалуронидазей | 627,6±25,93 | — | 35,05 | 1,20 | 5,58 |
Примечание. * — исследовались модельные образцы крови с раствором тропикамида; ** — определить степень экстракции было невозможно.
На основании предварительных данных по определению эффективности методик пробоподготовки биологических жидкостей (крови и мочи) прямой ЖЖЭ, ТФЭ и гидролизом протеазами и гиалуронидазой установлено, что наиболее эффективным является гидролиз гиалуронидазой как для крови, так и для мочи. Эффективность гидролиза протеазами была показана в нашей предыдущей работе на широком спектре лекарственных веществ для образцов крови [25]. Вероятно, гиалуронидазу можно считать селективным ферментом для пробоподготовки крови и мочи при целенаправленном исследовании на тропикамид, который использовался при дальнейшем ретроспективном анализе (табл. 2).
Таблица 2. Динамика изменения концентрации в биожидкостях после прекращения регулярного приема терапевтической дозы тропикамида
| Время от момента последнего введения, ч | 6 | 24 | 48 | 72 | 96 | 120 | 144 | 240 |
| Концентрация тропикамида в крови, мкг/мл | 191,6 | 25,0 | 22,8 | 20,5 | 19,3 | — | — | — |
| Концентрация тропикамида в моче, мкг/мл | 627,7 | 489,9 | 322,8 | 316,4 | 112,0 | 25,1 | 17,5 | 10,3 |
В первые 6 ч после последнего введения тропикамида его количество в крови было максимальное (191,6 мкг/мл) и в течение 4 сут снизилось в 10 раз; в моче в первые 24 ч снизилось от 627,7 до 489,9 мкг/мл, затем 2—3 сут сохранялось примерно на одном уровне, начиная с 4-х суток концентрация существенно снижалась и на 11—12-е сутки вещество в моче не обнаруживалось.
На хроматограммах экстрактов из образцов волос (рис. 2) имеется пик со временем удерживания около 12 мин и соответствующий ему масс-спектр, идентифицированный по базе данных прибора как тропикамид с вероятностью совпадения не менее 90%. Пик обладает достаточной интенсивностью, спектрограммы высокого разрешения и не требуют дополнительного вычитания фона как для идентификации, так и для количественного определения. На хроматограмме отмечались пики эндогенных веществ, аналогичные пикам веществ, идентифицированных на хроматограммах проб шерсти контрольных животных, представленные преимущественно эфирами высших жирных кислот и холестерином [30]. На хроматограммах не обнаружены основные метаболиты тропикамида: N-этил-N-(пиридин-4-ил-метил)-фенилацетамид, N-этил-2-фенил-N-(пиридин-4-ил-метил)-пропенамид и N-этил-3-ацетокси-2-фенил-N-(пиридин-4-ил-метил)-пропанамид [9, 17, 31].
Рис. 2. Хроматограмма (а) и масс-спектр (б) экстрактов после гидролиза папаином образцов шерсти белого окраса, содержащих тропикамид.
Методика гидролиза протеазами позволила провести ретроспективное исследование и выделить тропикамид из образцов шерсти (табл. 3), оценить их в экстрактах количественно через 4 нед после окончания приема тропикамида. Методика щелочного гидролиза не позволила обнаружить тропикамид в экстрактах из волос методом ГХ-МС через 4 нед даже в следовых количествах. Результаты количественной оценки отягощены систематической ошибкой, поэтому в данном случае следует говорить только о факте обнаружения токсиканта, а не о содержании вещества в волосах.
Таблица 3. Результаты количественного определения тропикамида в экстрактах из образцов волос (шерсти) при ретроспективном анализе через 4 недели (ферментативный гидролиз папаином)
| Окраска шерсти | Метрологические характеристики результатов количественного определения тропикамида, нг/мг | |||
| X±(∆X) | S | ε, % | RSD, % | |
| Белая | 1,25±0,07 | 0,10 | 13,63 | 8,00 |
| Коричневая | 2,20±0,56 | 0,72 | 10,03 | 32,97 |
Заключение
Методика ферментативного гидролиза протеазами низкой специфичности может быть рекомендована для проведения пробоподготовки волос при диагностике немедикаментозного применения лекарственных средств, содержащих тропикамид, в том числе и при ретроспективном анализе.
Значение валидационных параметров сходимости и внутрилабораторной воспроизводимости удовлетворяет критериям приемлемости для биоаналитических методик, что позволяет рекомендовать предлагаемую методику для работы в практике лабораторий.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.