Сайт издательства «Медиа Сфера»
содержит материалы, предназначенные исключительно для работников здравоохранения. Закрывая это сообщение, Вы подтверждаете, что являетесь дипломированным медицинским работником или студентом медицинского образовательного учреждения.
Разработка методики количественного определения Моксонидина в крови и моче методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-селективным детектированием
Журнал: Судебно-медицинская экспертиза. 2024;67(6): 42‑47
Прочитано: 1107 раз
Как цитировать:
Моксонидин является гипотензивным средством с центральным механизмом действия. В стволовых структурах головного мозга (ростральный слой боковых желудочков) моксонидин селективно стимулирует имидазолинчувствительные рецепторы, принимающие участие в тонической и рефлекторной регуляции симпатической нервной системы. Стимуляция имидазолиновых рецепторов снижает периферическую симпатическую активность и артериальное давление. Моксонидин отличается от других центральных гипотензивных средств более низким сродством к α2-адренорецепторам, что объясняет меньшую вероятность развития седативного эффекта и сухости во рту. Прием моксонидина приводит к снижению системного сосудистого сопротивления и артериального давления. Моксонидин улучшает на 21% индекс чувствительности к инсулину (в сравнении с плацебо) у пациентов с ожирением, инсулинрезистентностью и умеренной степенью артериальной гипертензии1.
Терапевтические концентрации моксонидина в сыворотке крови составляют 1—4 нг/мл, токсические и летальные концентрации не определены2.
Для судебно-химических анализов при летальных отравлениях, а также для контроля детоксикации при отравлении моксонидином или для выявления случаев отравления при комплексном употреблении препаратов (включая и моксонидин) необходима чувствительная и экспрессная методика для определения в крови и моче.
Цель работы — разработка чувствительной и экспрессной методики обнаружения моксонидина и его количественного определения в крови и моче методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометром (ВЭЖХ-МС/МС) для целей клинической токсикологии и судебно-химической экспертизы.
Оборудование. Жидкостный хроматограф Agilent Technologies 1260 с тандемным масс-спектрометром 6460, колонка размером 2,1×100 мм с обращено-фазным сорбентом Poroshell 120 EC-C18 и диаметром зерна 2,7 мкм, предколонка SB-C8 5 мкм, 2,1×12,5 мм. Деионизатор воды «ДВ-1». Центрифуга LABTEX micro 15. Набор пипеток-дозаторов. Весы аналитические ВЛ-124В. Бытовой холодильник с морозильным отделением.
Реактивы и материалы. Аммония формиат фирмы Fluka (Швейцария), моксонидина гидрохлорид субстанция (Sigma-Aldrich), циклизина гидрохлорид субстанция (Sigma-Aldrich), ацетонитрил для ВЭЖХ, метанол х.ч. (химически чистый), этанол 95%, муравьиная кислота х.ч., вода деионизированная.
Приготовление раствора внутреннего стандарта. Рабочий раствор с концентрацией 0,1 г/л готовили путем разведения 100 мкл раствора циклизина с концентрацией 1 г/л в 890 мкл метанола с добавлением 10 мкл муравьиной кислоты (концентрированной) для стабилизации. Рабочий раствор с концентрацией 0,001 г/л готовили разведением 10 мкл раствора с концентрацией 0,1 г/л в 990 мкл метанола. Все растворы циклизина хранили в холодильнике при 2—4 °C.
Приготовление рабочих растворов для калибраторов. Стандартный раствор Моксонидина с концентрацией 0,1 г/л готовили добавлением в пробирку с 900 мкл метанола 100 мкл раствора с концентрацией 1 г/л. Калибровочный раствор с концентрацией Моксонидина 0,001 г/л готовили разведением 10 мкл раствора с концентрацией 0,1 г/л в 990 мкл метанола. Калибровочный раствор с концентрацией 0,0001 г/л готовили разведением раствора с концентрацией 0,001 г/л метанолом 1:9. Все растворы готовили из стандартного раствора анализируемого соединения каждый раз заново.
Для исследований и отработки методики использовали трупную кровь/мочу, проверенные на отсутствие Моксонидина. До анализа образцы холостой и анализируемой крови/мочи хранили в морозильной камере при температуре −12 °C.
Пробоподготовка крови для анализа. К 0,1 мл крови в пробирке Эппендорфа добавляли 10 мкл раствора внутреннего стандарта в метаноле (с концентрацией 0,001 г/л циклизина) и 0,5 мл ацетонитрила. Пробирку центрифугировали 15 мин при 12000 об/мин, надосадочный слой переносили в виалу для автосамплера.
Пробоподготовка мочи для анализа. К 0,05 мл мочи в пробирке Эппендорфа добавляли 5 мкл раствора внутреннего стандарта в метаноле (с концентрацией 0,001 г/л циклизина) и 0,45 мл ацетонитрила. Пробирку центрифугировали 15 мин при 12000 об/мин, надосадочный слой переносили в виалу для автосамплера.
Полученные в результате пробоподготовки крови и мочи растворы (по 2 мкл) исследовали методом ВЭЖХ-МС/МС.
Режим работы высокоэффективного жидкостного хроматографа с тандемным масс-спектрометром. Температура колонки составляла 50 °C. Элюенты — 10 мМ раствор формиата аммония с 0,1% муравьиной кислотой в деионизированной воде (A) и 0,01% муравьиная кислоты в метаноле (B), скорость подачи элюента — 0,36 мл/мин; градиентный режим: 0 мин — 95% элюента A, к 4 мин доля элюента A составляет 50%, к 14 мин — 2%, к 14,5 мин — 2%, к 15 мин — 95% и регенерация колонки в течение 4,0 мин — 95% элюента A.
Тандемный масс-спектрометр работал в режиме MRM переходов 242,1→206,1; 242,1→199,0 (Моксонидин), 267,2→152,1; 267,2→167,1 (Циклизин) с ионизацией электроспрей (ES). Поток азота в распылитель — 5 л/мин, поток газа-обдува — 11 л/мин, давление на небулайзере — 40 psi, температура осушающего газа — 325 °C, газа-обдува — 350 °C, напряжение на капилляре — 3500 вольт.
В качестве внутреннего стандарта для определения Моксонидина был выбран Циклизин (рис. 1).
Рис. 1. Структурные формулы Моксонидина и Циклизина.
Валидацию методики проводили в соответствии с общей фармакопейной статьей ОФС.1.1.003 и методическими рекомендациями по валидации аналитических методик, используемых в судебно-химическом и химико-токсикологическом анализе биологического материала [1].
Специфичность определяли с помощью серии анализов по 5 образцов трупной крови и мочи с добавлением внутреннего стандарта Циклизина, проверенных ранее на отсутствие Моксонидина, по описанным выше методикам. Исследовали в режиме скрининга и сканирования по двум MRM-переходам, характерным для Моксонидина 242,1→206,1; 242,1→199,0. Каждую из полученных хроматограмм анализировали по заданным MRM-переходам, в соответствующих времени удерживания Моксонидина временны́х участках в пределах ±5%. На протяжении указанного интервала не наблюдали посторонних пиков с соотношением сигнал/шум (S/N) более чем 3:1. Соответственно, на результаты определения существенно не влияли ни возможные примеси в растворителях, ни компоненты биологических матриц.
На рис. 2 приведены хроматограммы контрольной крови Моксонидина и Циклизина.
Рис. 2. Хроматограмма экстракта контрольной крови с концентрацией Моксонидина 10 нг/мл. Время удерживания Моксонидина 3,670 мин., Циклизина 8,483 мин.
Для оценки эффекта переноса аналита проводили трехкратное исследование образцов биосред по приведенной выше методике с концентрацией Моксонидина 10 мкг/мл и холостого образца. В крови и моче не наблюдалось переноса Моксонидина в холостой образец.
В табл. 1 приведены данные разработанной методики по характеристикам: предел обнаружения, предел количественного определения, область линейности.
Таблица 1. Метрологические характеристики методики количественного определения Моксонидина в крови и моче
| Моксонидин, нг/мл | Кровь | Моча |
| Предел обнаружения для Моксонидина | 1 | 1 |
| Предел количественного определения | 5 | 5 |
| Линейность | 5—100 | 5—1000 |
Изучение линейности проводили на 5 количественных уровнях Моксонидина в крови (1, 5, 10, 50, 100 нг/мл) и 6 уровнях в моче (1, 5, 10, 50, 100, 1000 нг/мл), критерий приемлемости — коэффициент корреляции не ниже 0,993. Для каждой из концентраций выполняли исследование двух параллельных проб биожидкостей.
Калибровочные кривые (для крови и мочи), полученные при отработке методики, приведены на рис. 3.
Рис. 3. Градуировочная кривая Моксонидина в крови и моче.
Калибровочные кривые описываются следующими уравнениями:
для крови: Y=0,26405∙X − 0,00037, R=0,9993;
для мочи: Y=0,26398∙X − 0,00006, R=0,9997,
где Y — концентрация Моксонидина в нг/мл; X — отношение площадей пиков анализируемого вещества и внутреннего стандарта; R — коэффициент корреляции.
Коэффициент корреляции градуировочной кривой был не менее 0,99, а свободный член уравнения для расчета концентрации близок к нулю, все концентрации градуировочной кривой отличались от целевых не более чем на 10%. В точке «Бланк» анализируемое соединение не обнаруживалось. Для нижней калибровочной концентрации отношение сигнал/шум составляло не менее 3/1.
Правильность и воспроизводимость методики определяли по результатам 5 серий проб для каждого из 3 уровней определяемых величин (нижнего, среднего и верхнего), лежащих в пределах аналитической области методики3, содержащих для крови по 5, 10 и 100 нг/мл моксонидина, для мочи по 5, 50 и 1000 нг/мл.
В табл. 2 и 3 приведены результаты контрольных анализов трупной крови и мочи, полученные в рамках оценки правильности и прецизионности.
Таблица 2. Результаты экспериментальной оценки правильности и прецизионности количественного определения Моксонидина в крови
| Концентрация, мкг/мл | Генеральное среднее значение | Правильность, % | Стандартное отклонение повторяемости (σr) | Относительное стандартное отклонение, % (S) |
| 0,005 | 0,005 | 0,4 | 0,0001 | 2,02 |
| 0,01 | 0,01 | 3,1 | 0,0006 | 5,56 |
| 0,1 | 0,1 | 1,1 | 0,002 | 2,02 |
Таблица 3. Результаты экспериментальной оценки правильности и прецизионности количественного определения Моксонидина в моче
| Концентрация, мкг/мл | Генеральное среднее значение | Правильность, % | Стандартное отклонение повторяемости (σr) | Относительное стандартное отклонение, % (S) |
| 0,005 | 0,005 | 0,04 | 0,00009 | 1,85 |
| 0,05 | 0,05 | 0,6 | 0,0005 | 1,07 |
| 1,0 | 1,0 | 0,3 | 0,008 | 0,83 |
Как следует из полученных результатов, относительное стандартное отклонение на всех исследуемых уровнях концентрации Моксонидина не превышало 15%, что соответствует установленному критерию приемлемости для биожидкостей [1].
Поскольку данная методика не используется в рутинных исследованиях, то целесообразно совместно с анализируемой пробой готовить две контрольные пробы крови с концентрациями 0,005 и 0,05 мкг/мл. Рабочие растворы для контрольных проб готовили с использованием новых разведений стандартных растворов Моксонидина, которые не использовали для приготовления калибраторов.
1. Разработана методика обнаружения и количественного определения моксонидина в трупной крови и моче с использованием метода ВЭЖХ-МС/МС. Методика обеспечивает высокую чувствительность, специфичность и экспрессность определения аналита. На результаты определения существенно не влияют ни возможные примеси в растворителях, ни компоненты биологических матриц. Простая пробоподготовка позволяет уменьшить финансовые и временные затраты на исследование.
2. Проведена валидационная оценка разработанной методики: высокая специфичность, предел обнаружения соответствует нижней границе терапевтического интервала концентраций (1 нг/мл), предел количественного определения (5 нг/мл), линейность калибровочной кривой представлена для крови 5—100 нг/мл с коэффициентом корреляции R=0,9993, для мочи 5—1000 нг/мл с R=0,9997. Относительное стандартное отклонение при исследовании правильности и прецизионности не превышает 6 % во всем интервале определяемых концентраций.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
1 РЛС: регистр лекарственных средств России. Ссылка активна на 15.12.2023. https://www.rlsnet.ru/drugs/moksonidin-sz-65996
2 TIAFT reference blood level list of therapeutic and toxic substances. 2004. Accessed December 15, 2023. https://sudmed-ms.ru/Articles/DrugsConcentrations2005.pdf
3 Государственная фармакопея Российской Федерации XV издания. ОФС.1.1.0012. Ссылка активна на 15.12.2023. https://pharmacopoeia.regmed.ru/pharmacopoeia/izdanie-15/1/1-1/validatsiya-analiticheskikh-metodik/
Подтверждение e-mail
На test@yandex.ru отправлено письмо со ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.
Подтверждение e-mail
Мы используем файлы cооkies для улучшения работы сайта. Оставаясь на нашем сайте, вы соглашаетесь с условиями использования файлов cооkies. Чтобы ознакомиться с нашими Положениями о конфиденциальности и об использовании файлов cookie, нажмите здесь.
