Разработка методики количественного определения Моксонидина в крови и моче методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-селективным детектированием

Моксонидин является гипотензивным средством с центральным механизмом действия. В стволовых структурах головного мозга (ростральный слой боковых желудочков) моксонидин селективно стимулирует имидазолинчувствительные рецепторы, принимающие участие в тонической и рефлекторной регуляции симпатической нервной системы. Стимуляция имидазолиновых рецепторов снижает периферическую симпатическую активность и артериальное давление. Моксонидин отличается от других центральных гипотензивных средств более низким сродством к α2-адренорецепторам, что объясняет меньшую вероятность развития седативного эффекта и сухости во рту. Прием моксонидина приводит к снижению системного сосудистого сопротивления и артериального давления. Моксонидин улучшает на 21% индекс чувствительности к инсулину (в сравнении с плацебо) у пациентов с ожирением, инсулинрезистентностью и умеренной степенью артериальной гипертензии¹.

Терапевтические концентрации моксонидина в сыворотке крови составляют 1—4 нг/мл, токсические и летальные концентрации не определены².

Для судебно-химических анализов при летальных отравлениях, а также для контроля детоксикации при отравлении моксонидином или для выявления случаев отравления при комплексном употреблении препаратов (включая и моксонидин) необходима чувствительная и экспрессная методика для определения в крови и моче.

Цель работы — разработка чувствительной и экспрессной методики обнаружения моксонидина и его количественного определения в крови и моче методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометром (ВЭЖХ-МС/МС) для целей клинической токсикологии и судебно-химической экспертизы.

Оборудование. Жидкостный хроматограф Agilent Technologies 1260 с тандемным масс-спектрометром 6460, колонка размером 2,1×100 мм с обращено-фазным сорбентом Poroshell 120 EC-C18 и диаметром зерна 2,7 мкм, предколонка SB-C8 5 мкм, 2,1×12,5 мм. Деионизатор воды «ДВ-1». Центрифуга LABTEX micro 15. Набор пипеток-дозаторов. Весы аналитические ВЛ-124В. Бытовой холодильник с морозильным отделением.

Реактивы и материалы. Аммония формиат фирмы Fluka (Швейцария), моксонидина гидрохлорид субстанция (Sigma-Aldrich), циклизина гидрохлорид субстанция (Sigma-Aldrich), ацетонитрил для ВЭЖХ, метанол х.ч. (химически чистый), этанол 95%, муравьиная кислота х.ч., вода деионизированная.

Приготовление раствора внутреннего стандарта. Рабочий раствор с концентрацией 0,1 г/л готовили путем разведения 100 мкл раствора циклизина с концентрацией 1 г/л в 890 мкл метанола с добавлением 10 мкл муравьиной кислоты (концентрированной) для стабилизации. Рабочий раствор с концентрацией 0,001 г/л готовили разведением 10 мкл раствора с концентрацией 0,1 г/л в 990 мкл метанола. Все растворы циклизина хранили в холодильнике при 2—4 °C.

Приготовление рабочих растворов для калибраторов. Стандартный раствор Моксонидина с концентрацией 0,1 г/л готовили добавлением в пробирку с 900 мкл метанола 100 мкл раствора с концентрацией 1 г/л. Калибровочный раствор с концентрацией Моксонидина 0,001 г/л готовили разведением 10 мкл раствора с концентрацией 0,1 г/л в 990 мкл метанола. Калибровочный раствор с концентрацией 0,0001 г/л готовили разведением раствора с концентрацией 0,001 г/л метанолом 1:9. Все растворы готовили из стандартного раствора анализируемого соединения каждый раз заново.

Для исследований и отработки методики использовали трупную кровь/мочу, проверенные на отсутствие Моксонидина. До анализа образцы холостой и анализируемой крови/мочи хранили в морозильной камере при температуре −12 °C.

Пробоподготовка крови для анализа. К 0,1 мл крови в пробирке Эппендорфа добавляли 10 мкл раствора внутреннего стандарта в метаноле (с концентрацией 0,001 г/л циклизина) и 0,5 мл ацетонитрила. Пробирку центрифугировали 15 мин при 12000 об/мин, надосадочный слой переносили в виалу для автосамплера.

Пробоподготовка мочи для анализа. К 0,05 мл мочи в пробирке Эппендорфа добавляли 5 мкл раствора внутреннего стандарта в метаноле (с концентрацией 0,001 г/л циклизина) и 0,45 мл ацетонитрила. Пробирку центрифугировали 15 мин при 12000 об/мин, надосадочный слой переносили в виалу для автосамплера.

Полученные в результате пробоподготовки крови и мочи растворы (по 2 мкл) исследовали методом ВЭЖХ-МС/МС.

Режим работы высокоэффективного жидкостного хроматографа с тандемным масс-спектрометром. Температура колонки составляла 50 °C. Элюенты — 10 мМ раствор формиата аммония с 0,1% муравьиной кислотой в деионизированной воде (A) и 0,01% муравьиная кислоты в метаноле (B), скорость подачи элюента — 0,36 мл/мин; градиентный режим: 0 мин — 95% элюента A, к 4 мин доля элюента A составляет 50%, к 14 мин — 2%, к 14,5 мин — 2%, к 15 мин — 95% и регенерация колонки в течение 4,0 мин — 95% элюента A.

Тандемный масс-спектрометр работал в режиме MRM переходов 242,1→206,1; 242,1→199,0 (Моксонидин), 267,2→152,1; 267,2→167,1 (Циклизин) с ионизацией электроспрей (ES). Поток азота в распылитель — 5 л/мин, поток газа-обдува — 11 л/мин, давление на небулайзере — 40 psi, температура осушающего газа — 325 °C, газа-обдува — 350 °C, напряжение на капилляре — 3500 вольт.

В качестве внутреннего стандарта для определения Моксонидина был выбран Циклизин (рис. 1).

Рис. 1. Структурные формулы Моксонидина и Циклизина.

Валидацию методики проводили в соответствии с общей фармакопейной статьей ОФС.1.1.00³ и методическими рекомендациями по валидации аналитических методик, используемых в судебно-химическом и химико-токсикологическом анализе биологического материала [1].

Специфичность определяли с помощью серии анализов по 5 образцов трупной крови и мочи с добавлением внутреннего стандарта Циклизина, проверенных ранее на отсутствие Моксонидина, по описанным выше методикам. Исследовали в режиме скрининга и сканирования по двум MRM-переходам, характерным для Моксонидина 242,1→206,1; 242,1→199,0. Каждую из полученных хроматограмм анализировали по заданным MRM-переходам, в соответствующих времени удерживания Моксонидина временны́х участках в пределах ±5%. На протяжении указанного интервала не наблюдали посторонних пиков с соотношением сигнал/шум (S/N) более чем 3:1. Соответственно, на результаты определения существенно не влияли ни возможные примеси в растворителях, ни компоненты биологических матриц.

На рис. 2 приведены хроматограммы контрольной крови Моксонидина и Циклизина.

Рис. 2. Хроматограмма экстракта контрольной крови с концентрацией Моксонидина 10 нг/мл. Время удерживания Моксонидина 3,670 мин., Циклизина 8,483 мин.

Для оценки эффекта переноса аналита проводили трехкратное исследование образцов биосред по приведенной выше методике с концентрацией Моксонидина 10 мкг/мл и холостого образца. В крови и моче не наблюдалось переноса Моксонидина в холостой образец.

В табл. 1 приведены данные разработанной методики по характеристикам: предел обнаружения, предел количественного определения, область линейности.

Таблица 1. Метрологические характеристики методики количественного определения Моксонидина в крови и моче

Изучение линейности проводили на 5 количественных уровнях Моксонидина в крови (1, 5, 10, 50, 100 нг/мл) и 6 уровнях в моче (1, 5, 10, 50, 100, 1000 нг/мл), критерий приемлемости — коэффициент корреляции не ниже 0,99³. Для каждой из концентраций выполняли исследование двух параллельных проб биожидкостей.

Калибровочные кривые (для крови и мочи), полученные при отработке методики, приведены на рис. 3.

Рис. 3. Градуировочная кривая Моксонидина в крови и моче.

Калибровочные кривые описываются следующими уравнениями:

для крови: Y=0,26405∙X − 0,00037, R=0,9993;

для мочи: Y=0,26398∙X − 0,00006, R=0,9997,

где Y — концентрация Моксонидина в нг/мл; X — отношение площадей пиков анализируемого вещества и внутреннего стандарта; R — коэффициент корреляции.

Коэффициент корреляции градуировочной кривой был не менее 0,99, а свободный член уравнения для расчета концентрации близок к нулю, все концентрации градуировочной кривой отличались от целевых не более чем на 10%. В точке «Бланк» анализируемое соединение не обнаруживалось. Для нижней калибровочной концентрации отношение сигнал/шум составляло не менее 3/1.

Правильность и воспроизводимость методики определяли по результатам 5 серий проб для каждого из 3 уровней определяемых величин (нижнего, среднего и верхнего), лежащих в пределах аналитической области методики³, содержащих для крови по 5, 10 и 100 нг/мл моксонидина, для мочи по 5, 50 и 1000 нг/мл.

В табл. 2 и 3 приведены результаты контрольных анализов трупной крови и мочи, полученные в рамках оценки правильности и прецизионности.

Таблица 2. Результаты экспериментальной оценки правильности и прецизионности количественного определения Моксонидина в крови

Таблица 3. Результаты экспериментальной оценки правильности и прецизионности количественного определения Моксонидина в моче

Как следует из полученных результатов, относительное стандартное отклонение на всех исследуемых уровнях концентрации Моксонидина не превышало 15%, что соответствует установленному критерию приемлемости для биожидкостей [1].

Поскольку данная методика не используется в рутинных исследованиях, то целесообразно совместно с анализируемой пробой готовить две контрольные пробы крови с концентрациями 0,005 и 0,05 мкг/мл. Рабочие растворы для контрольных проб готовили с использованием новых разведений стандартных растворов Моксонидина, которые не использовали для приготовления калибраторов.

1. Разработана методика обнаружения и количественного определения моксонидина в трупной крови и моче с использованием метода ВЭЖХ-МС/МС. Методика обеспечивает высокую чувствительность, специфичность и экспрессность определения аналита. На результаты определения существенно не влияют ни возможные примеси в растворителях, ни компоненты биологических матриц. Простая пробоподготовка позволяет уменьшить финансовые и временные затраты на исследование.

2. Проведена валидационная оценка разработанной методики: высокая специфичность, предел обнаружения соответствует нижней границе терапевтического интервала концентраций (1 нг/мл), предел количественного определения (5 нг/мл), линейность калибровочной кривой представлена для крови 5—100 нг/мл с коэффициентом корреляции R=0,9993, для мочи 5—1000 нг/мл с R=0,9997. Относительное стандартное отклонение при исследовании правильности и прецизионности не превышает 6 % во всем интервале определяемых концентраций.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

¹ РЛС: регистр лекарственных средств России. Ссылка активна на 15.12.2023. https://www.rlsnet.ru/drugs/moksonidin-sz-65996

² TIAFT reference blood level list of therapeutic and toxic substances. 2004. Accessed December 15, 2023. https://sudmed-ms.ru/Articles/DrugsConcentrations2005.pdf

³ Государственная фармакопея Российской Федерации XV издания. ОФС.1.1.0012. Ссылка активна на 15.12.2023. https://pharmacopoeia.regmed.ru/pharmacopoeia/izdanie-15/1/1-1/validatsiya-analiticheskikh-metodik/