Разработка селективной методики определения мебеверина в волосах

Исследования, проводимые с биологическими объектами с целью выявления наркотических средств и психотропных веществ, регламентируются в том числе в соответствии с Приказом Минздрава России от 18.12.15 №933н «О порядке проведения медицинского освидетельствования на состояние опьянения (алкогольного, наркотического или иного токсического)». Исследование разделено на два этапа. В ходе первого этапа осуществляются предварительные испытания с помощью иммунохимических методов с применением анализатора, которые обеспечивают регистрацию, а также количественную оценку результатов [1]. При положительном первом этапе (предварительном) следует второй, который состоит из подтверждающих исследований, включающих в себя анализ положительных проб методами газовой и/или жидкостной хроматографии с применением масс-спектрометрического детектирования. В качестве предварительных испытаний чаще всего применяют иммунохроматографический анализ. Этот метод является простым, экономичным и экспрессным, что позволяет проводить его вне специализированных учреждений, а также дает возможность выполнения быстрого скрининга массивного количества объектов.

Следует отметить, что предварительные испытания обычно нацелены на обнаружение как нативной молекулы, так и метаболитов наркотических и/или психотропных веществ. Положительные результаты на данном этапе могут возникнуть и при наличии в исследуемых образцах мочи лекарственных препаратов или их метаболитов, которые не относятся к наркотическим и психотропным, но имеют в своей структуре характерный фрагмент, который и вступает во взаимодействие с антителом тест-полоски [2].

Одним из таких препаратов является мебеверин (дюспаталин) — спазмолитическое средство, применяемое при лечении синдрома раздраженного кишечника. Он является сложным эфиром вератровой (3,4-диметоксибензойной) кислоты и мебеверинового спирта, выводится преимущественно с мочой, а также частично в виде деметилмебевериновой кислоты. Расщепление мебеверина до мебевериновый спирта и вератровой кислоты может происходить как in vivo, так и in vitro из-за катализируемого эстеразой гидролиза. Считается, что в результате такого быстрого превращения, в дополнение к значительному метаболизму, исходное лекарственное средство мебеверин редко изолируется из крови или мочи пациентов в нативном виде [3].

По данным литературы [4] и собственным исследованиям [5], мебеверин вызывает ложноположительные результаты иммунохроматографического исследования на амфетамины, что может быть обусловлено обнаружением в этих пробах пара-метоксиамфетамина, п-метоксиэтиламфетамина и гидроксиэтиламфетамина, которые считаются метаболитами мебеверина (рис. 1).

Рис.1. Схема метаболизма мебеверина [6].

Цель исследования — разработка методики обнаружения мебеверина и его метаболитов в биологических объектах (моча и волосы) для решения вопроса возможной кросс-реакции с психоактивными вещества при предварительных исследованиях иммунохроматографическим методом.

Исследование проводили с использованием таблеток «Мебеверин» (НАО «Северная звезда», Россия), ферменты трипсин, химотрипсин и гиалуронидаза (ООО «Самсон-Мед», Россия); папаин (ООО «Вектон»).

Анализ полученных извлечений осуществляли с применением метода высокоэффективной жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС/МС) на модульном жидкостном хроматографе Nexera XR с тандемным масс-спектрометром LCMS-8050 (Shimadzu). Условия хроматографирования: колонка Shim-pack FC-ODS (2 мм × 150 мм × 3 мкм), термостатированной при температуре 40 °C. Элюирование компонентов смесей проводили бинарным элюентом, состоящим из фаз A (0,3% об. муравьиной кислоты в воде) и B (ацетонитрил) согласно следующей программе: 5% фазы B (2 мин); линейный градиент до 100% B (10 мин); сохранение состава (2 мин). Скорость подвижной фазы составляла 0,32 мл/мин, объем вводимой пробы — 0,5 мкл. Масс-спектрометр конфигурировали для работы в режиме электрораспылительной ионизации (ESI) в следующих условиях: скорости потоков газа-распылителя и осушающего газа (азот) — 1,5 и 10 л/мин соответственно; температура линии десольватации и нагревательного блока — 250 и 300 °C соответственно; напряжение на интерфейсе — 4,5 кВ, давление газа для ячейки соударений (аргон) — 230 кПа. В качестве аналитического отклика применяли площади пиков, измеряемые при регистрации спектров ионов-продуктов с энергией соударений 22 эВ.

При моделировании длительного (в течение 30 сут) употребления мебеверина использовали лабораторных животных, морских свинок в возрасте около 6 мес и массой около 500 г. Содержание лабораторных животных в экспериментально-биологической клинике (виварии) центра клинической фармакологии ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный химико-фармацевтический университет» осуществлялось в соответствии с международной системой правил и требований к лабораториям, которые занимаются изучением воздействия новых химических соединений на окружающую среду и здоровье человека (Good Laboratory Practice, GLP) [5, 7, 8].

Препарат животным вводили перорально, однократно в дозировке 200 мг в пересчете на животное массой 500 г. Сбор мочи осуществляли с помощью метаболических клеток. Данное устройство позволяет получить чистые образцы мочи без фекалий благодаря использованию специальной конструкции воронки и разделительного конуса [5, 9, 10].

Образцы шерсти получали следующим образом: для сравнения накопления вещества в волосах с разным количеством пигмента (феомеланина) использовали 3 морских свинок с рыжим окрасом и 3 морских свинок с белым окрасом средней массой 500±25 г. Готовили водные растворы лекарственных средств в дозе, соответствующей 200 мг для человека, с пересчетом на массу животного, и ежедневно однократно вводили перорально в организм морских свинок по 1 мл полученного раствора в течение 30 сут, независимо от приема пищи [7].

Забор шерсти производили после 30 сут введения препарата. Хирургическими ножницами состригали шерсть максимально близко (2—3 мм) к коже со спины животного, а также с левых и правых боков [7, 11].

Изолирование из мочи проводили по ранее разработанной собственной методике [10, 15]: к 5 мл мочи, полученной после приема препарата мебеверина, прибавляли 0,1 М раствор хлористоводородной кислоты до pH 3—4 и 10% раствор аммиака до pH 8—9 по универсальной индикаторной бумаге. К образцам прибавляли 5 мл хлороформа, перемешивали на мультиротаторе 15 мин со скоростью 50 об/мин, затем отделяли хлороформный слой, выпаривали при 40 °C и проводили исследования методом ВЭЖХ-МС/МС.

Изолирование из образцов шерсти (волос) лабораторных животных проводили по следующей методике [11—15]: точную навеску около 350 мг порошка волос помещали в коническую пробирку, 4 мл 0,5 мг/мл раствора трипсина или химотрипсина в 0,1 М раствор аммония гидрокарбоната с pH 7,9, или 4 мл 0,5 мг/мл раствора папаина в ацетатном буферном растворе, содержащем 0,1% раствор трилона Б и 0,1% раствора цистеина, плотно укупоривали и термостатировали при 37 °C в течение 3 ч. Затем пробу центрифугировали при 4600 об/мин в течение 10 мин и отбирали центрифугат. К осадку добавляли вторую порцию раствора фермента в равном объеме (4 мл), перемешивали и термостатировали следующие 3 ч при 37 °C. Полученную пробу вновь центрифугировали при 4600 об/мин в течение 10 мин, отбирали центрифугат. Общее время гидролиза составляло 6 ч. Из объединенного гидролизата проводили экстракцию при pH 3—4, экстрагировали 3 порциями хлороформа по 2 мл. Полученные вытяжки объединяли и выпаривали досуха, затем анализировали методом ВЭЖХ- МС/МС [5].

Гидролиз гиалуронидазой проводили по следующей методике [12, 15]: точную навеску около 350 мг порошка волос (шерсти) помещали в коническую пробирку, добавляли 4 мл 0,5 мг/мл раствора гиалуронидазы в ацетатном буфере, плотно укупоривали и термостатировали при 37 °C в течение 3 ч. Затем пробу центрифугировали при 4600 об/мин в течение 10 мин и отбирали центрифугат. К осадку добавляли вторую порцию раствора фермента в равном объеме (4 мл), перемешивали и термостатировали следующие 3 ч при 37 °C. Полученную пробу вновь центрифугировали. Общее время гидролиза составляло 6 ч. Из объединенного центрифугата проводили экстракцию по методике, представленной выше.

Количественное определение мебеверина в извлечениях выполняли по градуировочному графику. Градуировочный график имел линейную зависимость в диапазоне концентраций (10—200 мкг/мл), 0,99≤R≤1,0. Было установлено, что RSD % сходимости результатов количественного определения не превышает 2%, RSD % прецизионности не превышает 2%, открываемость находится в диапазоне 99,5—100,5%, что соответствует критерию приемлемости [7, 15].

Внутрилабораторную (промежуточную) прецизионность валидируемых методик оценивали в условиях работы одной лаборатории в разные дни, разные исполнители. Относительное стандартное отклонение (RSD, %) не превышало 6,55%, что соответствует критерию приемлемости 15,00% [14].

Полученные данные обрабатывали методами математической статистики в соответствии с рекомендациями Государственной фармакопеи РФ XIV Общая фармакопейная статья 1.1.0013.15 «Статистическая обработка результатов химического эксперимента», рекомендациями Евразийского экономического союза и FDA (Управление по контролю пищевых продуктов и лекарственных средств США) к валидации биоаналитических методик [16—18] с помощью программы Microsoft Excel 2010. Рассчитывали среднее значение и стандартное отклонение показателей в каждой исследуемой группе. Статистическую значимость различий оценивали с вероятностью p<0,1.

Исследование метаболитического состава (извлечения из) мочи лабораторных животных показало сопоставимые результаты с данными литературы [2—6].

На хроматограмме извлечения из мочи (рис. 2, а) наблюдали 6 пиков: пик со временем удерживания около 3,2 мин соответствовал мебевериновому спирту, 3,26 мин — п-метоксиэтиламфетамину, 3,37 мин — п-метоксиамфетамину, 3,45 мин — мебевериновой кислоте, 4,35 мин — пик нативного мебеверина, 0,93 мин — вератровой кислоты. Масс-спектры компонентов представлены на рис. 2, б. Следовательно, несмотря на то что в моче присутствовали нативный мебеверин и его характерные метаболиты (мебевериновая и вератровая кислоты), однозначного ответа на вопрос «было ли только медикаментозное применение мебеверина или была попытка замаскировать употребление психоактивных веществ приемом данного лекарственного средства», дать невозможно.

Рис.2. Хроматограмма (ВЭЖХ-МС/МС) (а) и масс-спектры компонентов (б) извлечения из мочи лабораторных животных (пояснения в тексте).

Как свидетельствуют данные литературы, проведение исследования волос с целью выявления факта употребления психоактивных веществ позволит повысить достоверность аналитической диагностики и снизить вероятность получения ложноположительных результатов анализа [13, 14]. Ткань волоса не обладает метаболитической активностью, и в ней накапливаются преимущественно нативные вещества или метаболиты с относительной высокой липофильностью [14]. Методика ферментативного гидролиза зарекомендовала себя, с одной стороны, как высокоэффективная, а с другой — как не вызывающая гидролитического расщепления целевого токсиканта, что особенно актуально в случае мебеверина, который, как было показано в предыдущем исследовании, легко разрушается в щелочной среде или нагревании [10].

На хроматограмме (рис. 3, а) извлечения из гидролизата шерсти (волос) наблюдался пик нативного мебеверина (масс-спектр, см. рис. 3, б) со временем удерживания около 4,35 мин и отсутствовали сигналы описанных выше метаболитов (см. рис. 2).

Рис.3. Хроматограмма (ВЭЖХ-МС/МС) (а) и масс-спектр (б) извлечения из рыжих волос после гидролиза гиалуронидазой.

Результаты статистической обработки данных по содержанию мебеверина в волосах (шерсти) показали (см. таблицу), что токсикант накапливается в ткани волос, богатых феомеланином (природно рыжих), в значительных количествах. Фермент гиалуронидаза продемонстрировал высокую эффективность. Особенности механизма действия данного фермента не позволяют разрушить связь вещества с белком и пигментами шерсти (волос), однако увеличивают пористость волоса, что и приводит к значительному повышению степени экстракции токсиканта в извлечении. Методика ферментативного гидролиза волос не вызывает химическую или термическую деструкцию лабильной нативной молекулы мебеверина, следовательно благодаря данному подходу повышает достоверность всего исследования.

Результаты статистической обработки данных количественного определения мебеверина в экстрактах из образцов волос

В результате проведенного исследования:

1) были определены основные метаболиты мебеверина и установлено присутствие в моче нативного мебеверина и его маркерных метаболитов (мебевериновой и вератровой кислот) при применении с медикаментозной целью в терапевтических дозах (200—400 мг) данного лекарственного средства;

2) применение методики ферментативного гидролиза волос позволило установить, что в ткани волоса накапливается только нативная молекула мебеверина, следовательно, только по результатам анализа волос можно предположить, имело место медикаментозное применение данного лекарственного средства или употребление психоактивных веществ из группы фенилалкиламинов;

3) показана эффективность ферментативного гидролиза гиалуронидазей для изолирования мебеверина из волос: при исследовании накопления в рыжей шерсти количество извлеченного мебеверина с использованием гиалуронидазы в среднем на 50% больше, чем при применении других ферментов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.