В стоматологии и челюстно-лицевой хирургии пациенты в возрасте старше 50 лет с сопутствующими состояниями, провоцирующими развитие остеопороза, чаще других нуждаются в проведении костно-пластических операций и дентальной имплантации [1]. Однако восстановление костных дефектов у пациентов с остеопорозом представляет собой серьезную задачу. Нарушение процессов метаболического костного обмена оказывает негативное влияние на регенерацию костной ткани и требует применения костно-пластических материалов, отличающихся высокой эффективностью [2]. Среди них наиболее перспективными являются активированные материалы, содержащие факторы роста.

Костный морфогенетический белок-2 (BMP-2) играет важную роль в процессе регенерации костной ткани, способствует дифференцировке мезенхимальных стволовых клеток в остеобласты. За рубежом материалы, содержащие BMP-2, широко применяются для проведения костно-пластических операций в челюстно-лицевой области [3, 4]. Однако в условиях остеопороза нарушения клеточного метаболизма и дисрегуляции внутриклеточных сигнальных путей негативно влияют на способность BMP-2 индуцировать регенерацию костной ткани и приводят к снижению успеха проводимых операций [5, 6]. В связи с этим актуальным является поиск веществ, способных потенцировать остеоиндуктивные свойства BMP-2 у пациентов с остеопорозом.

Симвастатин и пентоксифиллин представляют собой лекарственные препараты для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, способные оказывать влияние на костный обмен, что было показано в отдельных экспериментах in vitro и in vivo, а также в отдельных клинических исследованиях [7—10]. Вместе с тем, остеоиндуктивные свойства симвастатина и пентоксифиллина, а также их способность потенцировать действие BMP-2 в условиях остеопороза, остаются недостаточно изученными.

Цель исследования — изучить in vivo биологические свойства симвастатина и пентоксифиллина и их способность потенцировать действие BMP-2 для регенерации костной ткани в условиях моделируемого постменопаузального остеопороза.

Материал и методы

Подготовка симвастатина и пентоксифиллина к проведению исследования

Симвастатин (Innova Healthcare, Индия) растворяли в этаноле, затем добавляли раствор NaOH и нагревали на водяной бане при температуре 50±2 °C в течение 2 часов. Затем раствором 1 моль/л HCl довели раствор симвастина до pH=7. В полученный основной раствор добавляли воду для получения раствора симвастатина в концентрации 0,13 мг/мл. Пентоксифиллин (Innova Healthcare, Индия) разводили в воде для инъекций (Солофарм, Россия) до получения концентрации 0,14 мг/мл. Для имплантации использовали rhBMP-2 (НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, Россия) в концентрации 100 мкг/мл. В качестве носителя для растворов использовали желатиновую губку Spongostan (Ethicon, США).

Исследование проводили на 60 самках крыс линии Wistar массой тела 300—350 г. Эксперимент соответствовал рекомендациям локального биоэтического комитета. При постановке эксперимента руководствовались Приказом Минздрава РФ от 01.04.2016 N 199Н «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики»; ГОСТ 31891-2012 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила оборудования помещений и организации процедур»; ГОСТ 33216-2014 «Правила работы с лабораторными грызунами и кроликами».

Для создания условий, провоцирующих развитие остеопороза, 30 крысам выполняли овариоэктомию через вентральный билатеральный доступ. Оставшимся животным проводили ложную овариоэктомию без удаления яичников. Через 8 недель у всех животных оценивали изменение уровня маркеров остеопороза: остеокальцина (OCN) и C-телопептида коллагена I типа (CTX-1) — в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа наборами Elisa kit (Cloud-Clone Corp., Китай).

Для оценки остеоиндуктивных свойств всем животным выполняли подкожную имплантацию веществ и их сочетаний с BMP-2. В зависимости от вводимого препарата как в группе с овариоэктомией, так и у ложнооперированных животных, было сформировано 5 подгрупп по 6 животных в каждой: в подгруппе 1 имплантировали симвастатин (0,13 мг/мл), в подгруппе 2 — пентоксифиллин (0,14 мг/мл), в подгруппе 3 — BMP-2 (100 мкг/мл), в подгруппе 4 — симвастатин и BMP-2 (0,13 мг/мл и 100 мг/мл), в подгруппе 5 — пентоксифиллин и BMP-2 (0,14 мг/мл и 100 мкг/мл).

После проведения наркоза шерсть в области лопаток и средней трети спины удаляли. Операционную зону обрабатывали раствором хлоргексидина биглюконата 0,05% (Росбио, Россия). В межлопаточной области и средней трети спины выполняли линейный разрез длиной 2—3 см. Над правой и левой лопатками и в области спины тупым способом формировали карманы длиной 1,5—2 см. Губку размером 0,5 см³, смоченную растворами веществ или их сочетаний, укладывали в сформированные карманы. Раны послойно ушивали материалом Vicryl 4.0 (Ethicon Inc, США) и обрабатывали раствором хлоргексидина биглюконата 0,05% (Росбио, Россия).

Выведение животных из эксперимента проводили на 14-е сутки после операции. Область имплантации губки с окружающими мягкими тканями забирали с помощью ножниц. Полученные образцы фиксировали в 10% нейтральном растворе формалина и подвергали гистологическому исследованию. Полученные срезы окрашивали гематоксилин-эозином и по Массону анилиновым синим, изучали на световом микроскопе Axio Imager A1 (Carl Zeiss, Германия). Препараты сканировали, количественную морфометрию цифровых изображений проводили в программе «Adobe Photoshop 2023» (Adobe, США).

Статистический анализ выполняли в программе GraphPad Prism v10.2 (США). Данные представляли как среднее±SD (стандартное отклонение). Нормальность распределения проверяли с помощью теста нормальности Дагостино—Пирсона. Для межгруппового сравнения использовали метод однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с применением критерия Краскела—Уоллиса, в качестве порога статистической значимости принималось значение p<0,05.

Результаты и обсуждение

Через 8 недель после операции у крыс с овариоэктомией отмечали статистически значимое (p<0,001) увеличение показателей остеокальцина и С-телопептида коллагена I типа, что свидетельствовало об изменении метаболизма костной ткани, характерного для остеопороза.

При подкожной имплантации, в отсутствии костного окружения, симвастатин и пентоксифиллин не способствовали формированию очагов неоостеогенеза, что свидетельствует об отсутствии у них остеоиндуктивных свойств (рис. 1).

Рис. 1. Подкожная имплантация симвастатина и пентоксифиллина у крыс с овариоэктомией (OVX) и ложнооперированных животных (Sham).

Окраска гематоксилин-эозин, ув. ×40. Обозначения: BV — кровеносный сосуд, S — остатки желатиновой губки.

На препаратах обнаруживали незначительное скопление лейкоцитов и макрофагов. В группе ложнооперированных крыс при имплантации пентоксифиллина количество новообразованных сосудов различного диаметра, пронизывающих губку, было выше, чем в группе, где использовали симвастатин. Полученный результат может свидетельствовать о наличии у пентоксифиллина более выраженных ангиогенных свойств.

Имплантация BMP-2 в концентрации 100 мкг/мл приводила к неоостеогенезу в обеих группах животных. У крыс с овариоэктомией относительный объем новообразованной костной ткани составил 0,5±0,2%. В группе ложнооперированных животных — 2,8±1,5% (рис. 2). В группе крыс с овариоэктомией очаги неоостеогенеза располагались преимущественно на периферии материала, внутри и на периферии имплантата определяли наличие грануляционной ткани, незначительного количества макрофагов и лейкоцитов. В группе ложнооперированных животных костная ткань была сформирована как на периферии, так и в центре имплантата (рис. 3).

Рис. 2. Подкожная имплантация BMP-2 и его сочетаний с симвастатином и пентоксифиллином у крыс с овариоэктомией (OVX) и ложнооперированных животных (Sham).

Окраска гематоксилин-эозин, по Массону. Ув. ×40. Обозначения: Nb — новообразованная костная ткань, Col — коллагеновые волокна, BV — кровеносные сосуды, S — остатки желатиновой губки.

Рис. 3. Относительный объем новообразованной костной ткани в группах ложнооперированных животных (Sham) и крыс с овариоэктомией (OVX) при имплантации BMP-2 и его сочетаний с симвастатином и пентоксифиллином.

В зоне имплантации симвастатина в сочетании с BMP-2 наблюдали формирование очагов костной ткани. Пространство между остатками губки и новообразованной костной тканью заполняли коллагеновые волокна. На препаратах отмечали наличие плазматических клеток, макрофагов и лейкоцитов (см. рис. 2). У крыс с овариоэктомией относительный объем новообразованной костной ткани составил 7,4±4,2%, в группе ложнооперированных животных — 5,4±1,5% (см. рис. 3).

Имплантация пентоксифиллина с BMP-2 приводила к формированию отдельных небольших очагов остеогенеза. У крыс с овариоэктомией относительный объем новообразованной костной ткани составил 0,01±0,001%. В группе ложнооперированных животных объем новообразованной костной ткани соответствовал 2,1±1,5 % (см. рис. 3).

Статистический анализ результатов морфометрии показал, что при имплантации пентоксифиллина с BMP-2 относительный объем новообразованной костной ткани значимо не отличался от объема, сформированного под действием BMP-2, как в группе крыс с овариоэктомией, так и у ложнооперированных животных. В свою очередь в группе крыс с овариоэктомией применение симвастатина с BMP-2 относительный объем новообразованной костной ткани был статистически значимо выше, чем при имплантации только BMP-2 (p<0,001).

В ходе исследования были изучены остеоиндуктивные свойства веществ, традиционно применяемых для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, а также их способность потенцировать действие BMP-2 в условиях моделируемого у крыс с овариоэктомией постменопаузального остеопороза.

При имплантации симвастатина с BMP-2 в группе крыс с овариоэктомией объем новообразованной ткани был значительно выше, чем у крыс, которым имплантировали только BMP-2. В отсутствие остеоиндуктивных свойств симвастатина его потенцирующее действие может быть обусловлено способностью влиять на остеогенез через дополнительные сигнальные пути, способствующие экспрессии BMP-2 [11]. Кроме того, было показано, что симвастатин характеризуется ангиогенными свойствами, что может положительно влиять на процесс регенерации костной ткани, особенно в условиях остеопороза [12].

Комбинация BMP-2 с пентоксифиллином не привела к увеличению относительного объема новообразованной костной ткани по сравнению с применением только BMP-2. Препарат демонстрировал отсутствие остеоиндуктивных свойств. В связи с этим способность вещества улучшать регенерацию костной ткани, отмеченная в других исследованиях, могла быть обусловлена не потенцированием действия BMP-2 или усилением его экспрессии, а наличием противовоспалительных и ангиогенных свойств, положительно влияющих на образование кости в области костного дефекта [10,13].

Полученные результаты свидетельствуют о том, что локальное применение симвастатина в сочетании с BMP-2 может представлять собой многообещающий подход для усиления регенерации костной ткани в условиях постменопаузального остеопороза. Однако необходимы дальнейшие исследования для изучения механизмов синергетического действия симвастатина и BMP-2, определения оптимальных путей доставки, а также оценка эффективности их совместного применения в клинических исследованиях у пациентов с остеопорозом.

Заключение

В условиях моделируемого постменопаузального остеопороза симвастатин и пентоксифиллин продемонстрировали отсутствие остеоиндуктивных свойств. Однако у крыс с овариоэктомией симвастатин усиливал действие BMP-2 и приводил к формированию большего объема костной ткани, чем при использовании только BMP-2. При имплантации комбинации пентоксифиллина с BMP-2 потенцирование действия остеоиндуктора не было отмечено. Полученные результаты демонстрируют возможности применения известных фармакологических субстанций для усиления остеоиндуктивного действия BMP-2 и могут быть использованы при создании новых эффективных костно-пластических материалов в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 23-75-01116).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.