Заболеваемость плоскоклеточным раком (ПР) слизистой оболочки рта (СОР) неуклонно растет [1]. Приблизительно в 75% случаев данное заболевание выявляют в запущенной стадии. Несмотря на все исследования, направленные на изучение патогенеза ПР СОР и его лечения, 5-летняя выживаемость пациентов не увеличивается и остается на уровне менее 50% [2]. Поздняя диагностика и наличие метастазов являются причиной плохого прогноза [3].

В основе инфильтрирующего роста и метастазирования опухолей лежит эпителиально-мезенхимальная трансформация (ЭМТ) клеток [4]. Это сложный обратимый биологический процесс, при котором эпителиальные клетки меняют свою полярность, теряют способность связываться друг с другом и приобретают свойства мезенхимальных клеток. Последние подвижны, обладают инвазивным потенциалом и повышенной устойчивостью к апоптозу. Потеря межклеточных связей в эпителии в процессе злокачественной трансформации способствует проникновению опухолевых клеток в подлежащие ткани и последующему формированию метастазов [1]. Опухолевые клетки проходят через базальную мембрану, проникают в строму и с током лимфы или крови переносятся в другие ткани, где развиваются метастазы [5].

Основными маркерами ЭМТ являются E- и N-кад-герины [1]. Они необходимы для нормального межклеточного взаимодействия, поддержания тканевой целостности и гомеостаза в эпителии и нервной ткани. Е-кадгерин — основной белок адгезионного контакта, который связывает друг с другом эпителиальные клетки СОР. N-кадгерин характерен для клеток мезенхимальной природы. Нарушение их выработки связано с опухолевой инвазией и плохим прогнозом при различных раках [6].

Цель исследования — изучить особенности локализации белков E-кадгерина и N-кадгерина в зависимости от пролиферативной активности клеток и степени неопластической трансформации эпителия СОР.

В работе использовали операционный материал отделения хирургической стоматологии (зав. — д.м.н. В.А. Сёмкин) и архивный материал лаборатории патологической анатомии (зав. — д.м.н., проф. И.И. Бабиченко) ЦНИИС и ЧЛХ Минздрава Р.Ф. за период с января 2007 г. по декабрь 2016 г. Были исследованы биоптаты СОР 48 пациентов (35 женщин и 13 мужчин; средний возраст 61,4 года) с клиническим диагнозом лейкоплакии и ПР СОР. В 12 (25,0%) случаях был поставлен диагноз очаговой эпителиальной гиперплазии (ОЭГ) СОР, в 17 (35,4%) случаях — плоскоклеточной внутриэпителиальной неоплазии (Squamous Intraepithelial Neoplasia — SIN). В 13 (27,1%) случаях при гистологическом исследовании был выявлен ПР СОР. В качестве контроля отобрано 6 случаев неизмененной слизистой оболочки с диагнозом фиброма СОР (5 женщин и 1 мужчина; средний возраст 54,3 года) без воспалительных изменений и реактивных гиперпластических процессов.

Гистологическое и иммуногистохимическое исследования биопсийного материала проводились в соответствии со стандартным протоколом [2]. Тканевые антигены определяли с помощью мышиных моноклональных антител к Ki-67 (ММ1, Diagnostic Biosystems), мышиных моноклональных антител к Е-кадгерину (клон SPM471, Thermo scientific) и кроличьих поликлональных антител к N-кадгерину (GeneTex). Для визуализации антигенов использовали систему QUANTO.

Индекс пролиферации по Ki-67 определяли по отношению клеток с иммунореактивными ядрами к общему числу клеток. Синтез E- и N-кадгеринов оценивали в условных единицах на наружной мембране эпителиальных клеток или в цитоплазме клеток соответственно: 0 — реакции не отмечалось; 1 — слабое окрашивание; 2 — умеренное окрашивание; 3 — интенсивное окрашивание, соответствующее окраске макрофагов в собственной пластинке слизистой оболочки (для N-кадгерина).

Бо́льшая часть пролиферирующих клеток при ОЭГ и SIN локализована в нижних 2/3 эпителия, поэтому оценка экспрессии белков Ki-67, E- и N-кадгерина проводилась в 300 клетках 2 зон эпителия: 1-я зона — ростковая зона эпителия (мальпигиев слой), к которой относятся базальный слой и 2 вышележащих ряда клеток; 2-я зона — шиповатый слой эпителия. При П.Р. СОР были выделены центральная и периферическая зоны опухоли. Периферическую зону ПР сравнивали с ростковым слоем в неизмененном эпителии, при ОЭГ и SIN, а центральную зону ПР — с шиповатым слоем эпителия. Показатели определяли в соответствующих участках тканей. Подсчет клеток производили при увеличении 400.

Для количественной оценки результатов проводились морфометрические исследования. Статистический анализ осуществляли при помощи программы Statistica 10.0 в среде Windows 7; после исследования нормальности распределения данных по W-критерию Шапиро—Уилка, достоверность различий для количественных признаков с ненормальным распределением определяли с помощью U-критерия Манна—Уитни, при этом указаны медианы, 25-й и 75-й перцентили признаков; различия считали статистически значимыми при р<0,05. Корреляционные взаимоотношения между пролиферативной активностью клеток и экспрессией E-кадгерина и N-кад-герина оценивали с помощью коэффициента корреляции Спирмена.

Повышение пролиферативной активности клеток — одно из важных звеньев патогенеза опухолевого роста. Белок Ki-67 считается универсальным маркером пролиферирующих клеток, так как выявляется в клетке во всех фазах митотического цикла, кроме G0 [2, 7]. Установлено, что пролиферативная активность эпителиоцитов усиливается как в базальном слое, так и в вышележащих слоях в процессе опухолевой трансформации клеток СОР [2].

В неизмененном эпителии пролиферирующие клетки локализовались в мальпигиевом слое (см. рисунок, а). При ОЭГ иммунопозитивные клетки по Ki-67 обнаружены только в ростковом слое (см. рисунок, г). При SIN во всех случаях пролиферация клеток отмечалась как в мальпигиевом слое эпителия, так и в шиповатом (см. рисунок, ж). При П.Р. пролиферация клеток выявлена по периферии и в центре солидных образований (см. рисунок, к). Количественные показатели представлены в таблице.

Поскольку Е-кадгерин является мембранным белком, при иммуногистохимическом (ИГХ) исследовании он выявляется на плазматической мембране эпителиоцитов. В неизмененном эпителии и при ОЭГ отмечалось интенсивное окрашивание мембран всех клеток мальпигиевого и шиповатого слоев (см. рисунок, б, д). При SIN в ростковом слое эпителия выраженность ИГХ-реакции варьировала от полного отсутствия до умеренной, а в шиповатом слое была интенсивной (см. рисунок, з).

При ПР в периферической зоне мембраны клеток окрашены слабо. В центральной зоне ИГХ-реакция была умеренной (см. рисунок, л, см. таблицу).

N-кадгерин не синтезируется в цитоплазме неизмененных эпителиальных клеток. В настоящем исследовании эпителий также окрашен не был ни в ростковом слое, ни в шиповатом (см. рисунок, в). При ОЭГ отмечалось слабое цитоплазматическое окрашивание клеток мальпигиевого слоя. В шиповатом слое экспрессии N-кадгерина не выявлено (см. рисунок, е). При SIN в мальпигиевом и шиповатом слоях отмечалось слабое цитоплазматическое окрашивание эпителиоцитов (см. рисунок, е). При П.Р. в периферической зоне выявлено более интенсивное окрашивание цитоплазмы опухолевых клеток, чем в центральной зоне (см. рисунок, м, см. таблицу).

При ОЭГ, SIN и ПР СОР в собственной пластинке слизистой выявляется большое количество макрофагов с выраженной реакцией на N-кадгерин.

В процессе злокачественной трансформации эпителия от неизмененного к ПР СОР были исследованы корреляционные взаимоотношения. Между пролиферативной активностью клеток по Ki-67 и синтезом белка Е-кадгерина в мальпигиевом слое и периферической зоне эпителия выявлена достоверная умеренная отрицательная корреляция (r= –0,398; p=0,009), в шиповатом слое и центральной зоне подобные взаимоотношения не были достоверными (r= –0,279; p=0,076). Между пролиферативной активностью клеток по Ki-67 и концентрацией белка N-кадгерина показана умеренная достоверная положительная корреляция в мальпигиевом слое и периферической зоне (r=0,355; p=0,031), подобная умеренная положительная корреляция существует в шиповатом слое и центральной зоне (r=0,688; p<0,001).

Семейство белков-кадгеринов сохранилось эволюционно в качестве адгезивных молекул, обеспечивающих кальцийзависимое гомофильное межклеточное взаимодействие. Выделяют 3 группы кадгеринов: классические кадгерины, к которым относятся E- и N-кадгерины; неклассические кадгерины и протокадгерины [8, 9]. Важный момент — отсутствие N-кадгерина в нормальном эпителии. Возможно, это связано с тем, что его синтез de novo может нарушать адгезивную способность клеток. N-кадгерин, взаимодействуя с рецепторами фактора роста фибробластов (FGFR — fibroblast growth factor receptor), активирует сигнальный путь, направленный на освобождение опухолевых клеток от Е-кадгерина, и способствует приобретению ими подвижного фенотипа [10]. Установлено in vitro, что эпителиальные клетки молочной железы, экспрессирующие N-кадгерин, обладают большей подвижностью и способностью к инвазии, что приведет к быстрому метастазированию и агрессивному течению болезни in vivo [1]. В настоящем исследовании показано, что количество Е-кадгерина в эпителиальных клетках СОР уменьшается в процессе их злокачественной трансформации, в то время как N-кадгерин появляется в цитоплазме клеток от SIN к П.Р. Подобное явление называют кадгериновым переключением. Этот феномен уменьшения синтеза Е-кадгерина N-кадгерином приводит к тому, что эпителиоциты приобретают адгезивные свойства клеток стромы, такие как повышенная подвижность и инвазивность [1]. Это происходит из-за повреждения адгезивных контактов при изменении синтеза разных изоформ классических кадгеринов [6].

Известно, что феномен кадгеринового переключения является ключевым моментом ЭМТ. В процессе ЭМТ опухолевые эпителиальные клетки приобретают свойства мезенхимальных клеток. [1]. При ЭМТ образуются подвижные клетки из неподвижных «родительских» эпителиальных клеток. Подобный процесс возможен в период эмбриогенеза, заживления ран и при опухолевой трансформации [3]. В настоящем исследовании выявлена экспрессия N-кадгерина макрофагами в собственной пластинке слизистой при ОЭГ, SIN и в строме ПР (см. рисунок, и, м). Известно, что на ЭМТ влияют клетки хронического воспаления в строме, которые вырабатывают большое количество сигнальных факторов, способствующих инвазии опухолевых клеток. Т-лимфоциты и макрофаги синтезируют фактор роста опухолей-β1, который способствует ЭМТ [4]. Скорее всего, подобные процессы лежат в основе снижения синтеза Е-кадгерина на мембранах эпителиальных клеток СОР в мальпигиевом слое.

Таким образом, в настоящем исследовании установлена связь между пролиферативной активностью эпителиальных клеток и синтезом этими клетками белка N-кадгерина на фоне снижения экспрессии Е-кадгерина. Ввиду этого белки межклеточных контактов Е- и N-кадгерины могут использоваться при ранней диагностике злокачественной трансформации клеток многослойного плоского эпителия СОР.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.