Одним из наиболее молодых направлений в области разработки методов лечения костно-деструктивных процессов является применение бисфосфонатов (БФ). Обычно препараты этого ряда назначают женщинам с постменопаузальным остеопорозом [1, 2].

БФ применяют также в онкологии при лечении костных метастазов (при метастазировании рака молочной железы) [5].

Было показано, что длительное применение алендроната и резиндроната эффективно и безопасно [8].

Оставалась нерешенной фундаментальная проблема механизмов действия БФ, однако и в этом направлении в последние годы достигнут значительный прогресс.

Установлено, что мишенью для ингибирующего действия БФ является энзиматический комплекс пирофосфат синтазы, играющий ключевую роль в синтезе холестерина, в частности через мевалоновую кислоту, а также липидов через линии изопреноидных предшественников [3, 10].

Посттрансляционные модификации белков, образующихся в результате их изопренелизации, включая малые гуанизинтрифосфат-связанные белковые молекулы Rab, Rac и Rho, играют решающую роль в регуляции центральных по значимости проявлений активности остеокластов: в их атракции, фиксации на костной поверхности, сборке гофрированной мембраны и в поддержании функциональной активности. В условиях ингибирования активности остеокластов описанные структурные проявления сходят на нет [7], и остеокласты подвергаются апоптозу [11].

Интересно, что фарнезил пирофосфат синтаза, играющая критическую роль в синтезе липидов, экспрессируется в клетках млекопитающих «повсеместно», однако апоптозу под воздействием азотсодержащих БФ подвергаются лишь остеокласты.

БФ относят к бисфосфоновым кислотам. Они являются синтетическими аналогами пирофосфатов. Кроме того, в структуре БФ присутствуют два радикала: R1, увеличивающий физико-химическое связывание с гидроксиапатитом (ГА), R2, который определяет биологическое действие БФ на костные клетки.

Свое название эта группа лекарственных средств получила благодаря наличию в их химической структуре атома углерода, связанного с 2 атомами фосфора (негидролизируемая связь Р—С—Р).

По структуре БФ схожи с эндогенным пирофосфатом; благодаря этому они способны активно связываться с кристаллами ГА костной ткани [13].

Первым препаратом из этой группы, получившим достаточно широкое применение в клинической практике, была этидроновая кислота, вместе с клодроновой и тилудроновой кислотами эти соединения составили I поколение БФ.

Поначалу БФ использовали только для лечения болезни Педжета (деформирующего остеита) и гиперкальциемии опухолевой этиологии [15].

Антирезорбционная активность препаратов этой группы существенно варьирует, что связано с особенностями их химической структуры. OH-группа в положении R1 увеличивает сродство к ГА в 2 раза. Вместе с тем очевидные различия БФ в сродстве к костной ткани предполагают, что этот феномен зависит не только от фрагмента R1. Действительно, введение компонентов азота (первичного, третичного или гетероциклического кольца) в положении R2 увеличивает антирезорбтивный потенциал БФ в 3 раза [3].

Анализ данных литературы свидетельствует о том, что основные вопросы, которые решались в прежних работах, касались механизмов антирезорбционных эффектов БФ и разработки практических аспектов их использования. В то же время в литературе появилось некоторое число публикаций, свидетельствующих в пользу анаболического эффекта БФ, а также возможного пролиферирующего действия БФ на остеобласты [6, 10, 12].

Однако «прямые» экспериментальные исследования, отвечающие на вопрос, обладают ли БФ, помимо антирезорбционного действия, способностью вызывать новообразование костного вещества, до сего дня отсутствуют, что и послужило обоснованием к проведению настоящей работы.

Эта тема актуальна, поскольку изучение возможного остеогенететического потенциала БФ предполагает раскрытие еще одного из многих неясных и спорных аспектов биологических эффектов БФ.

Таким образом, цель представленной работы состояла в выявлении способности БФ стимулировать репаративный остеогенез в костных дефектах.

Для решения этой задачи был поставлен эксперимент на крысах линии Вистар, в котором использовалась модель критических дефектов свода черепа [14]. Под критическими дефектами указанные авторы понимали костные дефекты, которые не заживают самопроизвольно, без дополнительных воздействий, стимулирующих репаративный остеогенез.

В представленной работе в критические костные дефекты вводили блоки керамики, содержащие композицию с БФ алендронатом натрия.

Изготовление керамических блоков. Высокопористую керамику получали методом наполнения ячеистого полимерного каркаса суспензией порошок/биополимер (инверсионный метод реплик) с последующей сушкой и термической обработкой. Данная технология позволяет получать материалы с пористостью до 80 об.% с крупными взаимопроникающими порами размером 150—250 мкм; средними порами, образовавшимися при выгорании неорганической части полимерного каркаса, размером 10—50 мкм и тонкими межкристаллическими порами размером 0,1—5,0 мкм.

Суспензию порошок/биополимер готовили на основе водного раствора с соотношением 1:1 по массе. Пропитку полимерного каркаса производили следующим образом: каркас заданной формы полностью погружали в керамический шликер, деформировали каркас сжатием на 50%, после чего благодаря восстановлению объема каркаса шликер заполнял его свободное пространство. Образцы извлекали из суспензии и помещали в морозильную камеру при температуре –40 °С на 2 ч для фиксации структуры. Последующая термическая обработка приводила к выжиганию полимерного каркаса и спеканию керамики. Прочность при сжатии такой керамики около 5 МПа.

Животных использовали в эксперименте после окончания карантина, через 30 сут после поступления в виварий. В работе соблюдали требования, изложенные в Бюллетене ВАК РФ № 3 от 2002 г.

Для гистологического исследования реакции тканевых элементов в области костной раны в разных условиях использовали модель критического дефекта свода черепа крыс линии Вистар [14].

Исследовали заживление костных дефектов в следующих группах:

— группа сравнения 1 — заживление костных дефектов под кровяным сгустком (8 крыс, по 2 крысы на срок);

— группа сравнения 2 — имплантация в костные дефекты материала карбонатгидроксиапатит (КГА) — β-трикаль-ций фосфат (β-ТКФ) (8 крыс, по 2 крысы на срок);

— основная группа — имплантация в костные дефекты блоков КГА — β-ТКФ + алендронат натрия (8 крыс, по 2 крысы на срок).

Под наркозом (золетил) производили угловой разрез на своде черепа. Тупым путем отслаивали мягкие ткани. С помощью портативной бормашины на малых оборотах (500 об/мин) создавали искусственный костный дефект диаметром около 7 мм, в который вводили исследуемый материал. Операционную рану ушивали послойно кетгутом.

Животных выводили из опыта в сроки: 15, 30, 60 и 90 сут по 6 животных на точку наблюдения. Всего в опыте было 24 крысы.

Гистологическая обработка тканевого материала. Выделяли костные образования из области операции и фиксировали их в 10% нейтральном формалине в течение 48 ч с однократной сменой фиксирующего раствора. Костную ткань декальцинировали в 25% растворе Трилона Б. Степень декальцинирования ткани определяли с помощью иглы. Декальцинацию проводили до свободного без хруста прохождения иглы через костную ткань. Тканевый материал проводили через спирты восходящих концентраций для дегидратации, через хлороформ-парафиновую смесь и заливали декальцинированную кость в парафин. Готовили серийные гистологические срезы по стандартной методике с окраской гематоксилином и эозином. Гистологические препараты изучали в системе визуализации микроскопа Axioplan 2 («Zeiss», Германия).

Расчет концентрации алендроната натрия. Алендронат в количестве 1 мг растворяли в 10 мл физиологического раствора, после чего в раствор помещали блок керамического материала шириной 5 мм, длиной 1 см и толщиной 3 мм. Материал находился в растворе 5 мин. Контрольные исследования показали, что при данной концентрации алендроната 50% его остается на керамическом материале.

Группа сравнения 1. Заживление критических дефектов под кровяным сгустком во все сроки экспериментальных наблюдений происходило без признаков новообразования костных структур в краях костных дефектов.

В гистологических препаратах обычно можно было видеть костный дефект, изнутри выстланный грануляционной тканью, богатой сосудами капиллярного типа, как правило, плотно инфильтрированной лимфомакрофагальными элементами, местами — примесями полинуклеаров, далее эта ткань в центростремительном направлении постепенно подвергалась созреванию (рис. 1). Сама костная стенка, отделенная от зоны хронической воспалительной инфильтрации рыхлой молодой соединительной тканью, была неровной, слегка узурированной. В костном крае было очень слабо выражено образование линий склеивания. Вот такая картина свидетельствовала о том, что в данной группе опыта синтез костного коллагена был сведен к минимуму. Линии склеивания — это результат ритмических смен периодов синтеза костного вещества и периодов его дифференциации. В условиях критического дефекта репаративный остеогенез исключен, нарушены стереотипные механизмы синтеза костного коллагена. Это и объясняет отсутствие линий склеивания и одновременно свидетельствует о чрезвычайно низкой костеобразовательной активности либо о полном ее отсутствии (см. рис. 1).

Группа сравнения 2. В гистологических препаратах, как правило, обнаруживались поля плотной лимфомакрофагальной инфильтрации, пронизанные тяжами фиброзной соединительной ткани. Отмечались высокая плотность этих тяжей и чрезвычайная их бедность клеточными элементами, среди которых преобладали зрелые фибробласты (рис. 2). Вокруг инокулята формировалась фиброзная капсула (рис. 3).

В целом на основании представленных гистологических картин можно заключить, что в этой группе наблюдений преобладающим было развитие хронической воспалительной реакции. Признаков остеогенетической активности как реакции на введение в область дефекта фосфатов кальция данного вида не наблюдалось. Ведущей формой реакции на контакт с материалом были плотная лимфомакрофагальная инфильтрация и образование тяжей фиброзной соединительной ткани, которая носила преимущественно зрелый фиброзный характер и в срок 90 сут проявляла тенденцию к образованию вокруг инокулята плотной фиброзной капсулы (см. рис. 3). В некоторых участках костная стенка имела слегка зазубренный край, что свидетельствовало о развитии ее умеренных резорбтивных реакций на контакт с имплантированным материалом.

Разрастания фиброзной соединительной ткани при отсутствии новообразованных костных структур — картина, наблюдавшаяся у всех животных этой группы; она свидетельствовала о том, что комплекс КГА—β-ТКФ при имплантации в критические костные дефекты свода черепа не проявлял способность к сколько-нибудь выраженной стимуляции тканевых элементов к новообразованию костного вещества в области их контакта с имплантированным материалом.

В данной группе исследовали реакцию тканевых элементов на введение в критические дефекты свода черепа материала, состоящего из комплекса КГА—β-ТКФ + БФ алендронат натрия.

Положительным критерием остеогенетической активности, а именно стимуляции костеобразования, должно служить появление в критических костных дефектах новообразованной костной ткани.

Как показало проведенное исследование, новообразование костного вещества обнаруживалось уже в ранние сроки наблюдений (15—30 сут). Вновь образованное костное вещество имело ретикулофиброзный характер строения и в виде оксифильных полосок и вкраплений зачастую соседствовало с обширными полями лимфомакрофагальной инфильтрации (рис. 4).

По мере увеличения сроков наблюдения (60—90 сут) удавалось проследить динамику созревания костных структур от ретикулофиброзной костной ткани до компактизирующейся пластинчатой кости. К 60—90-м суткам тенденция костной ткани к приобретению компактного строения и соответственно к дальнейшей дифференциации становилась преобладающей, появлялись участки, имеющие остеонное строение (рис. 5). Наряду с этим встречались картины узурирования костного края (рис. 6).

В некоторых участках наблюдалось образование полей макрофагальной инфильтрации. Макрофаги имели широкий ободок цитоплазмы, содержащей нежнозернистый материал коричневого цвета. Этот же зернистый материал заполнял межклеточные пространства, а кое-где образовывал экстрацеллюлярные скопления, которые можно было расценить как результат разрушения некоторых групп макрофагальных клеток с опорожнением содержимого их цитоплазмы (рис. 7).

В процессе исследования нередко возникали проблемы с интерпретацией гистологических картин. Так, в ряде случаев на обзорных (малых) увеличениях создавалось впечатление об образовании перерывов в отложении нового костного вещества в зоне контакта с имплантированным материалом (рис. 8).

Однако углубленный анализ гистологических картин позволял убедиться в том, что развитие репаративного остеогенеза имело место и в этих участках. При ×1000 можно было видеть, что в пространстве, где при малых и средних увеличениях отложений нового костного вещества, казалось бы, не было, на самом деле обнаруживались отложения оксифильной субстанции остеоида с активными остеобластами, представленными овоидными клетками с вытянутым ядром, погруженными в оксифильную гомогенную матрицу (рис. 10).

В основной группе костный дефект уже на 30-е сутки опыта был неравномерно заполнен новообразованным костным веществом фиброретикулярного типа (рис. 9). К зоне новообразования костного вещества примыкала густая сеть капилляров, осуществляющих трофическое обеспечение процесса остеогенеза (рис. 11).

В целом, как показало проведенное экспериментальное исследование, комплекс КГА—β-ТКФ с бисфосфонатом алендронатом натрия при его инокуляции в критические костные дефекты вызывает активное новообразование костного вещества, чего не наблюдалось в группах сравнения (заживление под кровяным сгустком и группа животных с комплексом КГА—β-ТКФ).

В литературе есть указания на то, что длительное применение БФ может приводить к снижению численности популяции макрофагов, чем, очевидно, объясняется развитие при приеме БФ в ряде случаев остеонекроза челюсти [4].

В наших экспериментальных наблюдениях местами отмечалось образование полей макрофагальной инфильтрации, причем макрофаги активно захватывали чужеродный материал. Часть из них при этом подвергалась разрушению, в результате чего образовывались экстрацеллюлярные скопления инородного материала (см. рис. 7).