Изучение и использование в клинике стволовых клеток — одна из важнейших проблем современной биологии и медицины. Принято считать, что основной функцией стволовых клеток во взрослом организме является замена отслуживших дифференцированных клеток и восстановление клеточного состава поврежденных тканей, что актуально для комплексного лечения заболеваний пародонта [7, 16, 20]. Однако ряд эффектов от применения клеток может быть связан с их паракринным действием благодаря большому числу факторов роста и цитокинов, которые они секретируют [56].

В литературе встречаются 2 классификации стволовых клеток:

— по источнику происхождения (эмбриональные, фетальные, клетки костного мозга, клетки пуповинной крови, стволовые клетки тканей взрослого организма и т.д.);

— по способности к дифференцированию: тотипотентные, образующие клетки любых типов; плюрипотентные, образующие клетки многих типов, но не всех; мультипотентные, образующие клетки нескольких типов, и унипотентные — образующие только 1 тип клеток [16, 47].

Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) выделяют из эмбрионов ранних стадий развития (от диплоидной зиготы до образования 8—16 бластомеров). На этих стадиях стволовые клетки имеют плюрипотентные свойства, высокую теломеразную активность и клоногенность [41, 61].

Однако их применение ограничено риском образования опухолей и иммунного отторжения [59], хотя в другом исследовании не было обнаружено статистически достоверного опухолеобразования [54]. Кроме того, манипуляции над яйцеклеткой и бластоцистой нарушают этические нормы, поэтому во многих странах применение эмбриональных клеток законодательно запрещено [47].

Наиболее изучены мезенхимальные стволовые клетки (МСК), выделенные из костного мозга (КМ). МСК взрослого человека из КМ представляют собой легкодоступную и относительно хорошо охарактеризованную популяцию стромальных клеток-предшественников, которые содержатся в КМ как в своеобразном депо. При необходимости они выходят в кровь, поступают в поврежденный орган или ткань и превращаются в специализированные клетки для их восстановления [18, 29, 31, 32]. МСК обнаружены не только в КМ, но и в других тканях (кровь, кожа, мышечная ткань, трабекулярная кость, периост, синовиальные оболочки, жировая ткань). Они способны к интенсивной пролиферации, могут дифференцироваться во многие клеточные типы и трансплантабельны in vivo. Доказано, что стволовые клетки, находящиеся в строме КМ, участвуют в процессах восстановления поврежденной костной ткани [34, 35].

Потенциальным источником стволовых клеток с высокой клоногенной и пролиферативной активностью является пульпа зуба (dental pulp stem cells, DPSCs) [39, 42, 53]. Основное морфогенетическое звено, регулирующее эти процессы, — окружающий дентин межклеточный матрикс, в частности костные морфогенетические белки [52, 53]. Данный вид стволовых клеток может дифференцироваться в дентинформирующие одонтобласты, что обосновывает их применение для восстановления тканей зуба [42]. По данным других авторов, в условиях in vitro эти клетки способны дифференцироваться и в нерональном направлении [49].

Незрелые стромальные клетки (СD-34–) выявлены в циркулирующей крови. В культуре эти клетки прикрепляются к подложке, формируя островки фибробластоподобных клеток. В незрелом состоянии клетки пролиферируют в течение нескольких пассажей, сохраняя мультипотентность (способность к дифференцированию в линии адипоцитов, миофибробластов, стромы гематогенной ткани, клетки хряща и кости) [63]. Однако в цельной крови стволовых клеток меньше, чем, например, в пуповинной крови или в КМ, и культивирование их является процессом трудоемким и часто нерентабельным [64, 65].

В последние годы особый интерес биологов и врачей вызывают стромальные клетки, получаемые из жировой ткани (СКЖТ). Это обусловлено в первую очередь доступностью материала для выделения клеток, поскольку одним из способов их получения является косметическая липосакция. Популяция свежевыделенных клеток жировой ткани гетерогенна и характеризуется высоким содержанием клеток, экспрессирующих антиген CD34. В процессе культивирования наблюдается обогащение популяции клетками, несущими маркеры, идентичные МСК костного мозга, — CD29, CD44, CD71, CD90, CD105, CD106, CD166 [24—26, 38, 40, 45]. Поэтому в ряде случаев СКЖТ могут представлять собой альтернативу МСК из КМ, получение которых связано с определенными техническими и медицинскими проблемами [5, 22, 43, 46].

СКЖТ способны дифференцироваться в клетки костной, хрящевой, жировой, мышечной, нервной ткани, в клетки сосудистой стенки (эндотелиальные и перициты) [16, 36, 38, 50, 55, 57]. В исследованиях последних лет показано, что СКЖТ обладают выраженной ангиогенной активностью, в основном — за счет секреции ряда ключевых ангиогенных факторов роста: фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), фактора роста гепатоцитов (HGF), фактора роста фибробластов 2-го типа (FGF2) и др. [22, 44, 45, 56].

В конце XX столетия получило активное развитие новое направление реконструктивной хирургии — тканевая инженерия — tissue engineering, в основе которой — использование клеток, выращиваемых в культуральных средах, и их трансплантация на биосовместимом носителе для воссоздания тканевых структур [8]. Особенно перспективно это направление в области восстановления утраченных структур в функционально активных тканях, которыми в пародонте являются кость и периодонтальная связка [7, 9, 23].

Стромальные клетки, полученные после культивирования КМ, обладают всеми особенностями, свойственными стволовым клеткам — мультипотентностью, способностью к самоподдержанию, возможностью дифференцироваться в клетки костной ткани, хряща, жировой ткани и др. [3, 8]. Сегодня внимание сфокусировано главным образом на возможности стромальных клеток дифференцироваться в клетки костной ткани [17, 19, 23, 35].

Усилиями ряда исследователей, работающих в области тканевой инженерии, были разработаны и внедрены композиционные материалы, в состав которых входят нативный КМ, около 4% клеток которого — стромальные клетки и остеогенные клетки-предшественники, преддифференцированные в монослойных культурах КМ.

В качестве носителей для трансплантации клеток используются как ксеногенные, так и синтетические материалы — гидроксиапатитная керамика [8, 10, 33, 34].

Сотрудниками МГМСУ совместно с другими ведущими научными учреждениями разработаны методы культивирования клеток стромы КМ человека, способы оценки количества клеток в слое, формирующемся на поверхности композитов, определения цитотоксичности образцов композитов и эффективности прикрепления клеток к их поверхности. Приводятся данные об успешном применении биокомпозиционного материала «Алломатрикс-имплант» в сочетании со стромальными остеогенными клетками-предшественниками при реконструктивных операциях на альвеолярных отростках челюстей [11].

В исследовании Э.В. Фионовой (2008) установлено, что в клеточной культуре КМ на образцах остеопластического материала «Гапкол» формируется значительно больше стромальных, чем кроветворных клеток. Заселение МСК поверхности материала «Гапкол», содержащего неколлагеновые белки кости, и внесение этой конструкции в костную рану ветви нижней челюсти кролика уменьшает проявления воспалительно-деструктивных реакций, повышает активность остеогенетических процессов и усиливает процессы созревания новообразованной костной ткани [27, 28].

А.С. Григорьян и соавт. (2009) в экспериментах на кроликах с применением гистоморфометрического метода показали, что при использовании титановой пластины с культурой МСК КМ за 4 мес эксперимента происходит полное заполнение костного дефекта челюсти пластинчатой костной тканью. В контрольной группе дефект замещался регенератом, значительную часть которого составляла грубоволокнистая соединительная ткань [29].

Н.А. Боброва и соавт. (2010) описывают применение аутологичных МСК крови в хирургическом лечении хронического генерализованного пародонтита. По мнению автора, этот метод стимулирует репаративные и регенеративные процессы в тканях пародонта. Рентгенологически подтверждено восстановление костной ткани (в среднем на 30—35%) через 6 мес лечения. Восстановление костной ткани зависело от уровня резорбции, выявленной до операции: при резорбции до ¹/₃ величины корня восстановление костной ткани было полным у 48% пациентов, при резорбции ¹/₂ костная ткань восстановилась до ¹/₃ у 34,3% пациентов, а при резорбции на ²/₃ величины корня восстановление произошло до ¹/₂ у 17,1% пациентов. Денситометрия участка альвеолы после операции показала уплотнение костной ткани в среднем на 11,63% [2].

М.P. Кауламбаева (2009) вводила экспериментальным животным инъекции предкультивированных аутологичных клеток КМ в сочетании с костным коллагеном в область костного дефекта. Автор делает вывод, что применение аутологичных МСК КМ для лечения костных дефектов и генерализованного пародонтита эффективнее традиционных методов заживления вследствие трансформации кровяного сгустка. Еще более эффективным оказалось применение клеточных технологий в сочетании с костным коллагеном, поскольку на 40-е сутки эксперимента прирост костной ткани и уменьшение глубины пародонтальных карманов (ПК) в этой группе составил 78,57%, что в 2 раза больше, чем в контроле [14].

Г.М. Жаринов и соавт. (2007) провели апробацию эффективности использования для восстановления костной ткани при хроническом пародонтите гидроксиапатита кальция (Cerasorb), смешанного с аутологичными МСК, полученными из КМ. В работе приводится описание клинического случая. Через 2 мес после операции при зондировании глубина ПК уменьшилась до 2,5 мм, воспаления и атрофии в области вмешательства не выявлено. Компьютерная томография в дентальном режиме через 13 мес после операции не выявила границы между костными структурами челюсти и вновь образованной тканью [10].

Трансплантация стромальных клеток КМ, среди которых имеется популяция МСК, — многообещающий метод восстановления поврежденных и утраченных тканей полости рта [3, 11]. Однако в настоящее время трансплантация МСК КМ производится в основном только в эксперименте, что связано с необходимостью длительного культивирования костномозговых клеток и высокой стоимостью самого процесса [22, 47].

В работе И.П. Кайдашева и соавт. (2008) освещаются вопросы реконструктивной пародонтальной терапии с применением аутологичных стволовых клеток крови (гемопоэтических, мезенхимальных). Для подтверждения наличия и увеличения количества стволовых клеток после выращивания их на ростовой среде проведено фенотипирование биоинженерных аутотрансплантатов. Согласно данным исследования, в суспензии клеток, полученных из дезинтегрированных гранул коллапана, присутствуют стволовые клетки 2 видов — гемопоэтические клетки, экспрессирующие маркер CD34+, и мезенхимальные с иммунофенотипом CD56^lowCD54^lowCD105⁺CD34^-CD45^- [12].

Стволовые клетки из периодонтальной связки впервые выделены в 2004 г. Установлены их мультипотентные свойства и способность к дифференцированию в адипоциты, остеобласт- и цементобластподобные клетки in vitro и формированию цемента и тканей периодонтальной связки in vivo [47, 58].

Т. Nakahara и соавт. (2004) показали регенерацию альвеолярной кости и цемента на модели пародонтальных дефектов на собаках путем имплантирования аутологичных клеток из периодонтальной связки, культивированных на коллагеновой губке [43, 51].

А. Dogan и соавт. (2003) трансплантировали фибробластоподобные клетки из тканей периодонтальной связки, культивированные до 4-го пассажа, в кровяном сгустке в хирургически сформированные фуркационные дефекты II класса верхней челюсти собак. Гистоморфометрически отмечено образование новой кости и цемента [37].

W. Sonoyama и соавт. (2006) продемонстрировали возможность построения периодонтально-корневого комплекса в результате подсадки в лунку удаленного нижнего резца стволовых клеток из зубного сосочка человека на гидроксиапатит-трикальцийфосфатном блоке в форме корня в качестве носителя, покрытого желатиновой губкой (Gelfoam, Pharmacia Canada inc.), которая содержит аутологичные МСК из периодонтальной связки на мини-пигах [47, 60].

Y. Liu и соавт. (2008) на экспериментальной модели пародонтита на мини-пигах показали, что аутологичные стволовые клетки из периодонтальной связки способствуют регенерации пародонтальных тканей с образованием альвеолярной кости, цемента и периодонтальной связки [48].

В.Б. Карпюк и соавт. (2009) с целью изучения состава и свойств выделяемых из жировой ткани и используемых для аутотрансплантации стромальных клеток выполнили морфологическое и иммунофенотипическое исследование образцов от 10 здоровых взрослых людей. В результате в свежих мазках и в культуре 1-го пассажа выявлены фибробластоподобные клетки, которые, по данным иммунофлюоресцентного окрашивания, экспрессируют маркеры МСК (CD13, CD44, CD90, CD105) и активно синтезируют фибронектин и коллаген I типа. Незначительное количество клеток экспрессируют CD31, с-kit, десмин и гладкомышечный актин, CD34-позитивных клеток не обнаружено. Таким образом, выделяемые из жировой ткани и используемые для аутотрансплантации стромальные клетки обладают фибробластоподобной морфологией, активно синтезируют компоненты внеклеточного матрикса и демонстрируют фенотип МСК [13].

И.П. Савченкова и соавт. (2008) выделили клеточные популяции с фенотипом, подобным мультипотентным МСК, из 2 разных источников: КМ и подкожно-жировой клетчатки (ПЖК) человека. Для выявления различия в способности этих клеток к дифференцированию в клетки костной ткани применяли анализ экспрессии генов остеопонтина (ОП), остеокальцина (ОК) и костного сиалопротеина (КС) методом полимеразной цепной реакции. Клетки, выделенные из КМ, были позитивны по ОП на 14-е сутки. В отличие от них в клетках, выделенных из ПЖК в среде без индуктора, экспрессии гена ОП не выявлено. В клетках КМ ОК был обнаружен на 14-е сутки культивирования в индукционной среде, КС — на 21-е сутки. В клетках из ПЖК ОК и КС не были выявлены даже на 28-е сутки после начала индукции [24].

М.Д. Перовой и соавт. (2006) проведено клиническое исследование роста нового зубодесневого прикрепления после аутотрансплантации СКЖТ при развившемся пародонтите. Показано, что тестируемый метод лечения расширяет возможности замещения глубоких пародонтальных дефектов, когда наблюдается критический дефицит собственного костного субстрата. Определено влияние курения и возраста на рост нового зубодесневого прикрепления [20, 21].

А.С. Григорьян и соавт. (2010) в работе на 8 кроликах с экспериментально воспроизведенными критическими дефектами свода черепа выполняли пластику дефектов биоинженерными конструкциями на основе пористого политетрафторэтилена с мультифункциональным наноструктурированным нерезорбируемым покрытием Ti-C-Ca-P-O-N и аутогенными стромальными клетками из жировой ткани (основная группа — 4 кролика). В группе сравнения (4 кролика) дефекты возмещали абиологическим имплантатом. В сроки 3 и 6 мес в основной группе под имплантатами наблюдали образование в области дефектов свода черепа полноценного костного регенерата. Уровень коммитирования клеток, достигнутый при описанном методе культивирования СКЖТ, позволяет получить популяцию преостеобластически дифференцированных клеток, обладающую столь мощным остеогенетическим потенциалом, что он достаточен для регенерации костной ткани в критических дефектах свода черепа, костная ткань которого, как известно, обладает относительно низким репарационным потенциалом. В группе сравнения в костных дефектах формировался регенерат из грубоволокнистой соединительной ткани [15].

На модели дефекта угла нижней челюсти кролика сравнение результатов гистологического исследования, сканирующей электронной микроскопии и микрофокусной рентгенографии показало, что аутологичные СКЖТ, дифференцированные в остеогенном направлении, больше способствуют регенеративному остеогенезу, чем клетки аллогенного происхождения. Использование трансплантатов с аллогенными СКЖТ помогает ускорить закрытие дефекта костной ткани, однако созревание костного матрикса в данном случае происходит медленнее [6].

И.Ю. Чаусская и соавт. (2010) использовали клеточную культуру СКЖТ у 15 больных: при деформации альвеолярного отростка верхней челюсти в области 1 зуба — у 5, при синус-лифтинге — у 4, при деформации альвеолярного отростка нижней челюсти в дистальных отделах — у 6. Полученные в клиническом исследовании данные показали, что применение аутогенных СКЖТ в сочетании с гидроксиапатитом исключает риск развития аллергических и побочных реакций, обеспечивает длительный клинический эффект, приводит к сокращению сроков реабилитации пациентов с деформацией альвеолярных отростков верхней и нижней челюстей [30].

Сотрудниками ЦНИИС совместно с ЗАО «РеМеТэкс» проведено пилотное клиническое исследование новой биомедицинской технологии по восстановлению костных дефектов и дефицита костной ткани верхней и нижней челюстей. Клинический протокол костной пластики для дентальной имплантации состоял из нескольких этапов: создание из частично деминерализованного костного блока трехмерной модели, которая анатомически соответствовала костному дефекту у пациента; заселение костного матрикса аутологичными МСК из жировой ткани, преддифференцированными в остеогенном направлении; трансплантация биоинженерной конструкции в место дефекта. В исследование были включены 7 пациентов с выраженной атрофией костной ткани в области ранее утраченных зубов. Выявлены ускорение сроков заживления операционной раны без врастания слизистой в трансплантат, замещение трансплантата в течение 3—6 мес на собственную костную ткань, количество которой было достаточным для установки имплантатов и первичной фиксации уже через 3—4 мес после трансплантации [1, 4].

М. Tobita и соавт. (2008) показали, что СКЖТ с обогащенной тромбоцитами плазмой поддерживают регенерацию периодонтальных тканей, включая альвеолярную кость и структуры периодонтальной связки на дефектах пародонта крыс in vivo [62].

Таким образом, создание тканеинженерных конструкций, содержащих недифференцированные стромальные и остеогенные клетки-предшественники, является перспективным высокотехнологичным методом. Приведенные данные позволяют предположить, что применение стромальных клеток в стоматологии открывает широкие возможности для использования клеточных технологий в челюстно-лицевой хирургии, пародонтологии и имплантологии.