Известно, что понятие «пародонт» объединяет разнообразные ткани: цемент (минерализованный слой на поверхности корня зуба, напоминающий грубоволокнистую кость), периодонтальную связку (волокнистая соединительная ткань), костную ткань альвеолы и слизистую оболочку десны [1]. Гистологическое разнообразие пародонта напрямую связано с функциональным. Благодаря особенностям каждой из перечисленных структур, а также их взаимодействию, пародонтальный комплекс выполняет целый ряд функций, среди которых удержание зуба в лунке, амортизация при акте жевания, поддержание внутреннего гомеостаза и защита от проникновения микроорганизмов [2, 3]. С пониманием этого становится еще более очевиден урон, который наносят зубочелюстной системе воспалительные заболевания пародонта, сопровождающиеся деструкцией всех перечисленных выше тканей: от разрушения эпителиального десневого прикрепления до формирования костных дефектов различной глубины и конфигурации.

Основными группами перспективных биоинженерных методов исследования в настоящее время являются выделение и применение стволовых клеток (СК); синтез биологически активных (индуктивных) сигнальных молекул; разработка каркасов, обеспечивающих трехмерный рост тканей. Представляет интерес использование эндогенной системы геномного редактирования CRISPR-Cas9 для нужд пародонтологии [4], однако в настоящем обзоре внимание будет уделено клеточным, а не геномным технологиям.

Стволовые клетки — это недифференцированные клетки, которые дают начало другим, многочисленным и специфичным типам клеток. В зависимости от широты дифференцировочного потенциала СК классифицируют на плюрипотентные (эмбриональные) и тканеспецифичные [5].

Развитие эмбриональных клеток может происходить по самым различным генетическим сценариям и, таким образом, давать начало различным соматическим линиям «взрослых» клеток как in vitro, так и in vivo. Источник таких СК — бластоциста эмбриона, возраст которого составляет от 3 до 5 дней [6]. Как известно, бластоциста состоит из 2 клеточных частей: внешней, которая в последующем превращается в плаценту, и внутренней, из которой формируются ткани организма человека. Именно во внутренней части локализованы эмбриональные СК. Однако их применение в клинической практике, биологических исследованиях, регенеративной терапии и, в частности, стоматологии, сопряжено с рядом этических рисков, связанных с методами получения таких клеточных линий.

Поэтому в настоящее время выбор многих ученых останавливается на мультипотентных мезенхимальных стволовых клетках (МСК), которые можно получить непосредственно из тканей пациента и культивировать трехмерно, на биосовместимых скаффолдах. Основными источниками МСК служат красный костный мозг, жировая ткань, амниотическая жидкость, кровь из сосудов пупочного канатика [7]. СК, полученные из красного костного мозга путем трепанационной биопсии (BM-MSC), считаются «золотым стандартом» стволовой терапии. Изучается их применение для ускорения заживления ран [8], коррекции фиброзных изменений миокарда [9], лечения системной красной волчанки [10] и даже синдрома поликистозных яичников [11].

В стоматологии и челюстно-лицевой хирургии такие СК уже применяются для устранения дефектов лицевого скелета. Проводятся исследования методов лечения дегенеративных заболеваний ВНЧС с применением препаратов, содержащих экзосомальные продукты МСК [12]. СК, полученные из аспиратов костного мозга, в 10-х годах XXI века широко изучались как потенциальное средство лечения пародонтальных костных дефектов [13]. Впрочем, в 2022 г. C. Costa и соавт. (2022) также отмечали не только более интенсивное костеобразование при лечении фенестрационных дефектов с применением BM-MSC, но и восстановление внутренних волокон цемента и периодонтальной связки [14].

Важным открытием стало то, что некоторые типы МСК могут быть выделены из тканей зубов: пульпы нативного зуба (DPSC) [15], удаленных молочных зубов (SHED) [16, 17], периодонтальной связки (PDLSC) [18], апикального сосочка (SCAP) [19] и даже эпителия десны [20]. Такие клетки, очевидно, обладают бо́льшим сродством к анатомо-гистологическим структурам челюстно-лицевой области по сравнению с мезенхимальными СК костного мозга.

DPSC (dental pulp stem cells) представляют собой уникальную популяцию клеток, наиболее перспективную для искусственного «выращивания» зубов. Впервые DPSC были выделены из центрального и субодонтобластического слоев пульпы третьих моляров [21]. Показано, что для получения DPSC могут быть использованы даже зубы, утраченные пациентами в результате агрессивно протекающего пародонтита — как известно, эта форма заболевания встречается у молодых людей с интактными твердыми тканями зубов [22]. DPSC имеют сходный с BM-MSC паттерн экспрессии маркеров, связанных с развитием эндотелия (фактор адгезии сосудистых клеток), гладких мышц (гладкомышечный актин), костной ткани (щелочная фосфатаза, коллаген I типа, остеонектин, остеопонтин и остеокальцин) и жизнедеятельностью фибробластов (коллаген III типа и фактор роста фибробластов 2-го типа), что делает их еще более привлекательными для экспериментального, а в последствии и практического здравоохранения.

Кроме того, известно, что именно DPSC в витальном зубе генерируют третичный дентин, а под влиянием активированной щелочной фосфатазы in vitro могут образовывать и «новую» пульпоподобную ткань [23]. В эксперименте выявлено, что при подкожной имплантации грызунам СК пульпы зуба последние образовывали полноценный дентино-пульпарный комплекс. Для этого экстирпированную ткань пульпы подвергли ферментативному расщеплению, и полученные СК культивировали в растворе глюкозы. DPSC первоначально образовали множество колоний клеток, похожих на фибробласты, а впоследствии наблюдались признаки дифференцировки этих клеток в остеобластоподобные структуры: повышение активности щелочной фосфатазы, остеокальцина, коллагена I типа. Важно, что похожие результаты были достигнуты и в клиническом исследовании с участием 40 пациентов с некрозом пульпы [24].

При комбинировании пульпарных СК и ксеногенного материала Bio-Oss в исследовании in vivo также удалось добиться значительного улучшения результатов костной пластики — это было подтверждено результатами ПЦР-анализа экспрессии генов, которые служат маркерами остео-, хондро- и адипогенеза [25]. B. Hernández-Monjaraz и соавт. [26] (2020) показали, что в образцах слюны пациентов, участвовавших в исследовании коллагеновых скаффолдов, импрегнированных DPSC, значительно снижалась концентрация провоспалительного интерлейкина-1β. Более того, помимо непосредственного терапевтического эффекта важны также «манипулятивные свойства» клеток. Как и все живые клетки, в лабораторных условиях СК «склонны» к старению, тенденция к которому возрастает в воспалительном микроокружении. Профили экспрессии генов, связанных с разными фазами клеточного цикла, оценивались методом ПЦР в реальном времени, а фосфатидилсерин — один из главных маркеров апоптоза — определяли методом проточной цитометрии с помощью аннексина V с флуоресцентной меткой [27]. Выяснилось, что DPSC продемонстрировали большую устойчивость, чем BMSC и PLSC.

Не так давно учеными открыта еще одна группа СК, выделенная из пульпы удаленных временных зубов (SHED) [28]. Они представляют собой еще одну популяцию, экспрессирующую маркеры, характерные для МСК: CD105 (эндоглин), CD73, CD29 (интегрин-β-1), CD44 и нестин. Преимущества SHED по сравнению с клетками, получаемыми из постоянных зубов, заключаются в том, что они более интенсивно ингибируют пролиферацию Т-лимфоцитов, препятствующих адаптации трансплантатов, повышают уровни противовоспалительных и снижают уровни провоспалительных цитокинов. следует отметить, что клетки Т-лимфоидного ряда, помимо прочего, провоцируют «звездчатые» перициты в ткани печени на фибробластоподобную активность, что ведет к фиброзному перерождению ткани печени. В свою очередь T. Yokoyama и соавт. (2019) [29] обнаружили, что SHED сами способны дифференцироваться в звездчатые клетки. Таким образом, они обладают потенциалом для лечения дегенеративно-воспалительных заболеваний печени (в первую очередь, алкогольного, вирусного и билиарного цирроза). Вдвойне интересно, что СК из временных зубов человека содержат маркеры эмбриональных СК, такие как OCT4 (octamer-binding transcription factor-4) и NANOG (Homeobox protein). С точки зрения регенерационной терапии и тканевой инженерии эти клетки могут дифференцироваться в клеточные линии различных типов, такие как бета-клетки поджелудочной железы, гепатоциты, нейрональные клетки, эндотелиальные клетки и одонтобласты [30]. В исследовании Y. Qiao и соавт. (2019) [31] на мышах наблюдали усиление регенерации альвеолярной кости при местной инъекции SHEDs, что тесно взаимосвязано с ингибированием инфильтрации воспалительных факторов, таких как Т-клетки CD4+ и INF-γ и TNF-α. Так, указанное исследование продемонстрировало тесную взаимосвязь между ингибированием INF-γ и TNF-α и стимулированием регенерации пародонта, хотя для выяснения деталей этого механизма требуются дальнейшие исследования.

Пародонтальная связка тоже содержит самообновляющуюся популяцию клеток‐предшественников (PDLSC), обнаруженную в периваскулярных пространствах периодонта. Эти клетки сходны с BM-MSC и используются для самообновления периодонта на протяжении всей жизни человека. PDLSC способны к остеогенной, цементогенной и фибробластической дифференцировке — т.е. в отсутствие конкуренции со стороны эпителиальной и соединительной тканей эти неспециализированные клетки могут реализовать свой потенциал и восстановить практически все структуры пародонта [32]. Неудивительно, что аутогенные периодонтальные СК внедряются в протоколы направленной регенерации тканей пародонта. В клинической практике во многих случаях PDLSC «подсаживают» в поврежденный периодонт в сочетании с заменителями кости, такими как гидроксиапатит и трикальцийфосфат, ксеногенные трансплантаты и синтетические гидрогели, чтобы повысить стабильность вновь образующихся клеток внутри дефекта.

В своем исследовании F. Chen и соавт. (2018) [33] использовали PLSC в качестве адъюванта в сочетании с ксеногенными костными минеральными материалами бычьего происхождения. Наблюдение за пациентами длилось 12 мес и показало, что в экспериментальной группе по сравнению с контрольной не было признаков более эффективной регенерации. Это означает отсутствие побочных эффектов, связанных с наличием мультипотентных клеток. Аналогичные результаты получили N. Sánchez и соавт. в 2020 г. [34]. В свою очередь X. Fu и соавт. (2014) [35] отмечают, что аллогенный синтетический материал, состоящий из смеси гидроксиапатита и фосфата кальция, в присутствии PLSC демонстрирует статистически значимо более приемлемый клинический эффект: меньшую глубину зондирования дефекта, восстановление зоны зубодесневого прикрепления, а также высокую плотность костной ткани по данным компьютерной томографии. F. Su и соавт. (2015) [36] также отмечают, что PDLSCs хорошо прикрепляются и распространяются в препаратах трикальцийфосфата. По сравнению с контрольной группой применение модифицированных аллогенных пластических материалов позволяет добиться лучших гистоморфометрических результатов. О сходных позитивных результатах сообщают исследователи, работающие с PLSC, посеянными на желатиновые губки, похожие на популярные настоящее время «чипы», пролонгированно высвобождающие антисептические препараты в зоне пародонтальных дефектов [37]. В подобных экспериментах у лабораторных животных через 21 день наблюдаются признаки формирования костной ткани, нового связочного аппарата и цементоподобной ткани.

Отметим также более «редкие» виды СК, применяемых в экспериментальной стоматологии. Так, СК «типа» SCAP получают из периапикальной зоны. Они дифференцируются в первичные одонтобласты, а не в репаративный дентин и имеют сильный потенциал остеогенной и ангиогенной дифференцировки. G. Li и соавт. (2018) [38] на основании гистологического исследования на экспериментальной модели пародонтита у морских свинок продемонстрировали потенциал инъекций SCAP. Спустя 12 нед в группе, получавшей инъекции SCAP, наблюдались значительная редукция воспалительного инфильтрата и восстановление типичной структуры шарпеевых волокон.

СК из зубного мешочка (DFPC), обнаруживаемые в зоне гердвиговского эпителиального влагалища (HERS), непосредственно участвуют в формировании структур корня зуба и тканей пародонта, а значит, могут способствовать их регенерации [39]. У взрослых источником DFSCs могут стать зоны островков Малассе: фактически, их можно получить в ходе экстракции зуба, например, в ходе удаления ретенированных третьих моляров. В целом DFSC является многообещающим источником в тканевой инженерии пародонта, но для оценки его клинической эффективности все еще не проведены достаточные эксперименты на добровольцах.

Субпопуляция СК выделена и из тканей десны (GMSC). Эти СК также обладают мультипотентной способностью к дифференцировке и мощным иммуномодулирующим действиям как на врожденные, так и на адаптивные иммунные клетки посредством секреции биологически активных веществ с иммуносупрессивными и противовоспалительными функциями. В эксперименте GMSC способствуют регенерации пародонта и снимают местные воспалительные процессы. Согласно недавнему исследованию группой ученых во главе с M. Abdal-Wahab (2020) [41] продемонстрировано, что трансплантация во внутрикостные дефекты аутологичного β-трифосфата кальция в сочетании с GMSC с последующим покрытием дефекта коллагеновой мембраной значительно уменьшает вертикальную глубину пародонтального кармана и компенсирует клиническую потерю прикрепления [41]. Помимо улучшений рентгенологической картины спустя 6 мес наблюдений в экспериментальной группе в десневой жидкости методом иммуноферментного анализа определяли значительно большие концентрации тромбоцитарного фактора роста и костного морфогенетического белка. Возможно, клинический смысл имеет даже «биомодификация» поверхности корня суспензией GMSCs после проведения SRP, без последующей костной аугментации [42].

Индуктивные сигнальные молекулы. Дифференцировка СК и нормальная регенерация тканей не могут происходить без поддержки окружающего биохимического фона — а именно, в отсутствие регуляторных сигнальных молекул. К индуктивным «сигналам» относятся хемокины (IL-6I, IL-8), факторы роста (fibroblast growth factor — FGF, vascular endothelial growth factor — VEGF, hepatocyte growth factor — HGF), молекулы клеточной адгезии и низкомолекулярные пептиды (например, аминокислотный пептидный комплекс EAA IPH AEN).

В клинической практике в качестве источника биологических сигналов наиболее часто применяются факторы роста, извлеченные из обедненной форменными элементами плазмы крови PRP (platelets reach plasma). Сыворотка содержит большое количество тромбоцитов, тромбоцитарных регенерационных факторов и фибрина низкой плотности и используется в виде инъекций для стимулирования заживления мягких тканей [43]. При другом режиме центрифугирования образца крови пациента можно получить PRF (platelet rich fibrin) — это, собственно, фибриновый сгусток высокой плотности. В связи с более низкой скоростью вращения пробирки в центрифуге в сгустке остается большее количество тромбоцитов, а также знакомые нам по предыдущей части обзора СК. PRF-сгусток часто применяется после реконструктивных хирургических операций в полости рта, удаления ретенированных зубов или пародонтальной костной пластики. Многочисленные исследования подтверждают, что после применения PRF заживление проходит быстрее и риск развития осложнений снижается. PRF запускает миграцию «местных» МСК в участок альвеолы и ускоряет их дифференцировку и пролиферацию [44—46]. Гистологические исследования продемонстрировали значительное увеличение образования кости и цемента при лечении с помощью этой методики. Исследование проводилось на кроликах. Подопытные были случайным образом распределены на 2 группы: в одной группе сформированный костный дефект бедренной кости заполняли PRF/IGF-1 (insulin-like growth factor-1), другая получала PRP. У каждого животного один внутрикостный дефект, выполненный в контрольной боковой части бедренной кости, одновременно заполняли метилцеллюлозным гелем в качестве контроля. Последующее гистологическое исследование показало, что на клеточном уровне PRF более эффективно увеличивает количество клеток, синтезирующих коллаген, и стимулирует их созревание [47].

Кроме того, в практике хирургической пародонтологии применяются костные морфогенетические белки (BMPs) [48]. Сочетание костных трансплантатов с факторами роста приводит к эффективной регенерации тканей. Так, рекомбинантный BMP-2, добавленный к костному аллографту, индуцирует рост костной ткани, более чем в 2 раза увеличивая ее плотность. A. Jones и соавт. [49] сообщили о более высоком проценте заполнения дефектов и нового контакта с костью в местах имплантации, обработанных BMP-2. В то же время S. Novak и соавт. [50] считают, что сочетанное применение тромбоцитарного фактора роста PRF с костными протеинами нецелесообразно. В эксперименте на мышах с дефектами бедренной кости авторы показали, что применение коллагеновой губки, содержащей оба фактора, оказывало более слабый анаболический эффект по сравнению с раздельным их применением.

Каркасы, обеспечивающие трехмерный рост тканей. Наличие материалов, имитирующих структуру внеклеточного матрикса (скаффолдов) — один из элементов «триады тканевой инженерии» наряду с живыми клетками и факторами роста. В практике хирургической пародонтологии широко распространены остеокондуктивные материалы — продукты, не содержащие активных клеток и биологических молекул, но предоставляющие развивающейся костной ткани пространство и опору для роста [51, 52].

Обычно они представляют собой полимеры биологического происхождения, выделенные из тканей животных, растений или морских водорослей: коллаген I типа или фибронектин крупного рогатого скота, альгинат из бурых водорослей, хитозан из раковин моллюсков, или синтетические. Другие материалы могут быть синтезированы искусственно, например, гидроксиапатит, керамика с трикальцийфосфатом, полилактид и полигликолид и их комбинация в форме поли DL-молочной-ко-гликолевой кислоты (PLGA) [53]. Одним из нетривиальных природных источников для костных скаффолдов являются кораллы — виды Porites, Acropora, Lobophyllia, Goniopora, Polyphillia и Pocillopora, которые имеют даже внешнее сходство с губчатой костью человека [54]. Такие каркасы биосовместимы и резорбируемы, имеют взаимосвязанную пористую структуру, которая улучшает заселение клеток, врастание костей и выдерживает высокие механические нагрузки.

C. Vaquette и соавт. (2012) [55, 56] разработан и исследован двухфазный каркас с клеточными листами PDLSC с использованием биоразлагаемых наноразмерных волокон из поли-ε-капролактона. Моделирование методом наплавленного осаждения использовали для изготовления каркасов из культуры СК и синтетического гидроксиапатита. Результаты наглядно продемонстрировали, что подобная PDLSC-мембрана создавала условия для стабильной группировки клеток периодонтальной связки на поверхности дентина корня зуба, способствовала прикреплению волокнистой соединительной ткани между новообразованным связочным аппаратом и костью. Кроме того, этот метод, адаптированный для нужд челюстно-лицевой хирургии, позволил срастить костные отломки при дефектах костей лицевого отдела черепа, не вызывая при этом значительных побочных эффектов [57].

Заключение

В настоящем обзоре литературы авторы попытались систематизировать лишь малую часть тех экспериментальных исследований, посвященных методам клеточной инженерии, над которыми работают ученые в последние годы. Пародонтология крайне восприимчива к последним достижениям общемировых научных тенденций и профессиональных исследовательских школ. И если цифровые, компьютерные, 3D-протоколы первыми адаптировали для своих нужд стоматологи-ортопеды и стоматологи хирургического профиля, то передовые приемы клеточной и молекулярной биологии в настоящее время так же активно осваиваются именно специалистами-пародонтологами.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.