Проблема молекулярных аспектов развития акушерской патологии, несмотря на несомненные успехи в ее решении, остается весьма актуальной. Среди осложнений беременности значительное место занимает плацентарная недостаточность (ПН), являющаяся одной из серьезных причин перинатальной заболеваемости и смертности. В международную классификацию болезней ПН включена как основной диагноз патологического состояния плода (МКБ-10: 036.5). Именно от функциональной и метаболической полноценности плаценты во многом зависят характер течения беременности и ее исход. Молекулярно-клеточные процессы в плаценте в значительной степени определяются состоянием белкового компонента, поскольку белки реализуют информационную программу клеток и играют ключевую роль в регуляции всех биохимических реакций [1].

По современным представлениям, различный уровень структурной организации белковых молекул однозначно определяется первичной структурой — аминокислотным составом и последовательностью аминокислот в полипептидной цепи [2]. Именно в первичной структуре закодирована программа самоорганизации белковой глобулы. Аминокислотный состав белков используется в настоящее время для определения трехмерной (3D) структуры белка, которая определяет основные свойства белковых молекул как в интактных условиях, так и при функциональных изменениях и при патологии [3].

Модификация структуры и, следовательно, свойств белков плаценты может приводить к глубоким деструктивным процессам в фетоплацентарной системе.

Цель настоящей работы — изучение особенностей первичной структуры, а именно аминокислотного состава мембранных и цитоплазматических белков плаценты при ПН для уточнения клеточно-молекулярных механизмов развития этого осложнения беременности.

В исследование были включены 43 беременные в возрасте от 23 до 32 лет (в среднем 26,5±0,4 года), у 20 из которых беременность и роды протекали без осложнений (контрольная группа), у 23 беременность осложнилась ПН, верифицированной после родов (основная группа). Критериями при постановке диагноза (и для включения в исследование) служили снижение фето- и маточно-плацентарного кровотока при допплерометрии, темпы роста плода по данным ультразвуковой биометрии, биофизический профиль плода, снижение сывороточной активности плацентарных изоферментов (глутаматдегидрогеназы и термостабильной щелочной фосфатазы). Все пациентки наблюдались в консультативной поликлинике Ростовского НИИ акушерства и педиатрии по программе «Акушерский мониторинг», предусматривающей расширенный протокол обследования во время беременности, на которое они дали информированное согласие.

В контрольной группе 8 женщин были первобеременными и первородящими. У 9 имелось 2 прерывания беременности по желанию женщины и более. У 4 пациенток в анамнезе наблюдались воспалительные заболевания органов малого таза. В основной группе были 8 первобеременных и первородящих женщин, у 12 повторнобеременных и повторнородящих имелось 2 прерывания беременности по желанию женщины и более. У 5 женщин в анамнезе были воспалительные заболевания органов малого таза.

По возрасту, индексу массы тела, паритету беременностей и родов, соматическому и акушерско-гинекологическому анамнезу обследуемые группы беременных были сопоставимы. Из исследования были исключены пациентки с инфекционными заболеваниями, декомпенсированными формами соматических заболеваний, многоплодной беременностью, аутоиммунной патологией, признаками преэклампсии. Пациентки основной группы во II триместре беременности были госпитализированы в отделение патологии беременных, где им проводились комплексное клинико-лабораторное обследование, а также терапия плацентарной дисфункции на основании Федеральных стандартов и порядка оказания помощи в акушерстве и гинекологии (Приказ № 572н от 2 апреля 2013 г.). Комплекс медикаментозной терапии включал селективные стимуляторы β₂-адренорецепторов для улучшения фетоплацентарного кровотока, глюкокортикостероиды (бетаметазон) для профилактики респираторного дистресс-синдрома плода, дигидропиридиновые производные (нифедипин) в качестве токолитических средств.

Материалом для исследования служили плаценты, взятые сразу после родов в сроки 39—40 нед, при соблюдении холодового режима. Микроскопические исследования выявили в плацентах женщин основной группы наличие участков кальциноза, фиброза, гиперваскуляризации ворсин, мелкие межворсинчатые кровоизлияния и лимфоцитарную инфильтрацию. В последах пациенток контрольной группы видимых изменений материнской и плодовой поверхностей не обнаружено, в ряде случаев отмечались небольшие участки фибриноидных масс, умеренная гиповаскуляризация, незначительные лимфоцитарные инфильтрации децидуальной ткани.

Для выделения цитоплазматических белков навески плацентарной ткани, гомогенизированные на холоде (2—4 °С) в 0,2N растворе сахарозы, подвергали дифференциальному ультрацентрифугированию (рефрижераторная центрифуга Beckman США, ротор 7А-14), осаждали ядра и митохондрии и получали супернатант после центрифугирования при 105 тыс. об/мин, 60 мин, который служил источником цитоплазматических белков. Мембранные белки выделяли из препаратов мембран микроворсин синцитиотрофобласта, полученных методом дифференциального центрифугирования тканевых гомогенатов, приготовленных на 0,01 М фосфатном буфере (pH 7,4), после удаления остатков неразрушенных клеток и грубых фракций [4]. Степень чистоты препарата оценивали по активности маркерных ферментов 5’-нуклеотидазы и Na⁺, K⁺-АТФазы. В указанных белках после кислотного гидролиза определяли аминокислотный состав на автоматическом анализаторе ААА Microtechno (Чехия). Исследования проводили согласно инструкции к анализатору по стандартной программе для гидролизатов белков. Наряду с исследованием мембранных и цитоплазматических белков был изучен аминокислотный состав одной из гомогенных фракций цитоплазматических белков, выделенных экстракцией 80% раствором этанола с последующей очисткой по ранее описанному методу [5]. Аликвотную часть данных белков подвергали электрофорезу в 7,5% полиакриламидном геле (приборы Protein IEF Cell и Protein IIxi Multi-Cell), при котором они разделялись на 2 фракции. Содержание белка в минорной фракции составило 5,2% от общего количества, а во 2-й фракции — 94,8%. По изоэлектрической точке (6,5) и молекулярной массе (69 750 Да) белок мажорной фракции был близок к сывороточному альбумину. Повторный анализ в 15% полиакриламидном геле свидетельствовал о гомогенности выделенного белка. Он не окрашивался дополнительными красителями, что свидетельствовало об отсутствии в его составе непротеиновых компонентов и, следовательно, об отличии от известных специфических растворимых белков беременности, которые в основном являются гликопротеинами [6—10].

Статистическую обработку данных осуществляли с использованием лицензионного пакета программ Statistica (версия фирмы «StatSoft Inc.»). Однородность дисперсий проверяли по критерию Фишера. Достоверность различий между сравниваемыми показателями определяли по критерию Стьюдента (t-критерий) и его аналогу для непараметрических распределений — критерию Манна—Уитни. Результаты оценивали как статистически значимые при p<0,05.

Проведенные исследования выявили отклонения в аминокислотном составе изученных белков плаценты при ПН (табл. 1). Характер и степень этих изменений различны для различных аминокислот и белковых фракций. В цитоплазматических белках отмечено уменьшение количества остатков аргинина на 16%, аспарагиновой кислоты — на 19%, глутаминовой кислоты — на 20%, тирозина — на 24%, фенилаланина — на 14%.

Снижение в белках содержания остатков глутаминовой и аспарагиновой кислот сопровождалось уменьшением высокореактивных карбоксильных групп, что ограничивало спектр межмолекулярных связей, необходимых для процессов рецепции, транспорта, клеточной трансформации, фолдинга (сворачивания полипептидной цепи в пространственную структуру). Одновременное уменьшение остатков белковосвязанных ароматических аминокислот, представляющих в полипептидной цепи ионизированные участки, также ограничивало регуляторные возможности белков [11, 12].

Противоположная направленность изменений установлена для остатков гистидина, треонина и глицина, количество которых увеличивалось при ПН в среднем на 14—16%, нарушая нормальное соотношение между заряженными и незаряженными аминокислотами в белковых молекулах. Повышение абсолютного уровня этих аминокислот может объясняться увеличением их относительной доли (мол.%) в белках в связи с уменьшением остатков других прежде всего отрицательно заряженных аминокислот.

Мембранные белки плаценты при ПН отличались повышенным уровнем остатков валина и лейцина на 14—15%, а также сниженным количеством остатков дикарбоновых аминокислот на 14—15%, лизина, гистидина, цистина на 18—20% и пролина на 25%. Следует отметить, что пролин мембранных белков плаценты может служить дополнительным источником свободной формы этой кислоты, являющейся важным компонентом соединительной ткани и эндотелиальных структур, с чем в определенной мере связано уменьшение его содержания в белках. Позитивность такого использования, имеющего компенсаторное значение, подтверждается снижением содержания небелковых пролина и изопролина в плаценте при ПН [13].

Сопоставление степени и направленности изменения содержания аминокислотных остатков в белках свидетельствует о модификации соотношения между полярными (гидрофильными) и гидрофобными аминокислотами, что может нарушать характер внутри- и межмолекулярных взаимодействий. В цитоплазматических белках плаценты при физиологической беременности данный показатель был равен 1,14, при ПН он снижался на 15,8% и составлял 0,96; одновременно на 12% увеличивался положительный заряд этих белков. В мембранных белках также отмечалось уменьшение указанного соотношения (1,71 в норме и 1,33 при ПН), за счет повышения количества остатков гидрофобных аминокислот (валина и лейцина) и обратной динамики гидрофильных, в частности, дикарбоновых — глутаминовой и аспарагиновой кислот. Кроме того, менее выраженное снижение в мембранных белках количества последних относительно диаминовых аминокислот (лизина и гистидина) приводило к снижению положительного заряда белков и, как следствие, к дестабилизации белковой структуры [14]. На изменение аминокислотного состава белков может влиять перераспределение отдельных белковых фракций между субклеточными структурами в результате модификации физико-химических свойств белков или повреждения целостности клеточных мембран [15].

Исключить влияние данного фактора позволило изучение первичной структуры выделенного и очищенного нами гомогенного альбуминоподобного белка плаценты. При беременности, осложненной ПН, молекулярная масса данного белка обнаруживала тенденцию к снижению и составляло 69 550 Да. Что касается аминокислотного состава, то при ПН в нем происходили существенные изменения по сравнению с таковым в контрольной группе (табл. 2). Количество треонина и цистина увеличивалось на 23 и 19% соответственно, а валина, изолейцина, тирозина, аспарагиновой и глутаминовой кислот уменьшалось в среднем на 15—20%. Наиболее значительное снижение обнаружено для аргинина (32%). Важно отметить, что среди белковосвязанных аминокислот аргинин обладает уникальными физико-химическими свойствами из-за имеющегося в его составе гуанидинового радикала, являющегося активным акцептором протонов и способного к целому ряду реакций замещения [16]. Поэтому уменьшение количества его остатков в белках способно существенным образом нарушить способность белков ассоциировать друг с другом и с небелковыми компонентами. Снижение уровня остатков аргинина в белках плаценты может быть обусловлено активацией специфических трипсиноподобных протеиназ, атакующих пептидные связи, образованные карбоксилом аргинина [17]. Подобно аминокислотному составу фракций мембранных и цитоплазматических белков, в гомогенном белке также имелось нарушение отношения между количеством гидрофобных и гидрофильных, основных и кислых аминокислот, следствием чего являлось изменение таких физико-химических характеристик, как коэффициент полярности (повышение на 25%) и величина положительного заряда (снижение на 28%).

Рассматривая причины изменения аминокислотного состава изученных белковых фракций, можно полагать, что определенную роль в этих изменениях играет нарушение протеомного профиля и посттрансляционных реакций плаценты при ПН [18]. Дифференциально экспрессирующиеся протеины плаценты могут различаться своей первичной структурой в результате модификации процессов синтеза mРНК и белка [14]. Кроме того, большое значение, по-видимому, имеет повышение при ПН активности пептидгидролаз с различной клеточной локализацией [19]. В условиях внутриутробной гипоксии значительную активность проявляют кислые пептидгидролазы, в большей степени локализованные в цитоплазме синцитиотрофобласта. Даже незначительная протеолитическая деструкция белков вряд ли остается без последствий для их структуры и свойств. Снижение молекулярной массы альбуминоподобного белка подтверждает возможность участия пептидгидролаз в изменении аминокислотного состава белков за счет ограниченного протеолиза. В то же время по принципу обратной связи появление белков с измененной первичной структурой будет отражаться на составе протеома плаценты, что создает предпосылки для развития функционально-клеточных повреждений [1].

Резюмируя полученные данные, можно заключить, что развитие ПН происходит на фоне модификации первичной структуры белков, проявляющейся в изменении их аминокислотного состава. Выявленные повреждения белков плаценты, учитывая их многочисленные функции, могут быть важными звеньями в общей цепи молекулярно-биохимических нарушений при ПН.

1. Первичная структура цитоплазматических и мембранных белков плаценты, оцененная по аминокислотному составу, при ПН отличается от таковой при физиологической беременности. Изменение аминокислотного состава установлено и для гомогенного белка, подобного по основным свойствам альбумину сыворотки крови.

2. При П.Н. происходят снижение молекулярной массы выделенного гомогенного белка с 69 750 до 69 550 Да, снижение величины суммарного заряда и повышение коэффициента полярности составляющих его аминокислот.

3. Цитоплазматические и мембранные белки плаценты различаются по степени и направленности изменения содержания заряженных и незаряженных, а также гидрофильных и гидрофобных аминокислот.