Сайт издательства «Медиа Сфера»
содержит материалы, предназначенные исключительно для работников здравоохранения. Закрывая это сообщение, Вы подтверждаете, что являетесь дипломированным медицинским работником или студентом медицинского образовательного учреждения.

Погорелова Т.Н.

Ростовский НИИ акушерства и педиатрии

Гунько В.О.

Ростовский НИИ акушерства и педиатрии

Никашина А.А.

ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский институт акушерства и педиатрии» Минздрава России, Ростов-на-Дону, Россия

Влияние модификации первичной структуры цитоплазматических и мембранных белков плаценты на развитие ее недостаточности

Авторы:

Погорелова Т.Н., Гунько В.О., Никашина А.А.

Подробнее об авторах

Журнал: Российский вестник акушера-гинеколога. 2017;17(1): 4‑8

Просмотров : 331

Загрузок: 4

Как цитировать:

Погорелова Т.Н., Гунько В.О., Никашина А.А. Влияние модификации первичной структуры цитоплазматических и мембранных белков плаценты на развитие ее недостаточности. Российский вестник акушера-гинеколога. 2017;17(1):4‑8.
Pogorelova TN, Gun'ko VO, Nikashina AA. Impact of modifying the primary structure of cytoplasmic and membrane proteins of the placenta on the development of its insufficiency. Russian Bulletin of Obstetrician-Gynecologist. 2017;17(1):4‑8. (In Russ.).
https://doi.org/10.17116/rosakush20171714-8

Проблема молекулярных аспектов развития акушерской патологии, несмотря на несомненные успехи в ее решении, остается весьма актуальной. Среди осложнений беременности значительное место занимает плацентарная недостаточность (ПН), являющаяся одной из серьезных причин перинатальной заболеваемости и смертности. В международную классификацию болезней ПН включена как основной диагноз патологического состояния плода (МКБ-10: 036.5). Именно от функциональной и метаболической полноценности плаценты во многом зависят характер течения беременности и ее исход. Молекулярно-клеточные процессы в плаценте в значительной степени определяются состоянием белкового компонента, поскольку белки реализуют информационную программу клеток и играют ключевую роль в регуляции всех биохимических реакций [1].

По современным представлениям, различный уровень структурной организации белковых молекул однозначно определяется первичной структурой — аминокислотным составом и последовательностью аминокислот в полипептидной цепи [2]. Именно в первичной структуре закодирована программа самоорганизации белковой глобулы. Аминокислотный состав белков используется в настоящее время для определения трехмерной (3D) структуры белка, которая определяет основные свойства белковых молекул как в интактных условиях, так и при функциональных изменениях и при патологии [3].

Модификация структуры и, следовательно, свойств белков плаценты может приводить к глубоким деструктивным процессам в фетоплацентарной системе.

Цель настоящей работы — изучение особенностей первичной структуры, а именно аминокислотного состава мембранных и цитоплазматических белков плаценты при ПН для уточнения клеточно-молекулярных механизмов развития этого осложнения беременности.

Материал и методы

В исследование были включены 43 беременные в возрасте от 23 до 32 лет (в среднем 26,5±0,4 года), у 20 из которых беременность и роды протекали без осложнений (контрольная группа), у 23 беременность осложнилась ПН, верифицированной после родов (основная группа). Критериями при постановке диагноза (и для включения в исследование) служили снижение фето- и маточно-плацентарного кровотока при допплерометрии, темпы роста плода по данным ультразвуковой биометрии, биофизический профиль плода, снижение сывороточной активности плацентарных изоферментов (глутаматдегидрогеназы и термостабильной щелочной фосфатазы). Все пациентки наблюдались в консультативной поликлинике Ростовского НИИ акушерства и педиатрии по программе «Акушерский мониторинг», предусматривающей расширенный протокол обследования во время беременности, на которое они дали информированное согласие.

В контрольной группе 8 женщин были первобеременными и первородящими. У 9 имелось 2 прерывания беременности по желанию женщины и более. У 4 пациенток в анамнезе наблюдались воспалительные заболевания органов малого таза. В основной группе были 8 первобеременных и первородящих женщин, у 12 повторнобеременных и повторнородящих имелось 2 прерывания беременности по желанию женщины и более. У 5 женщин в анамнезе были воспалительные заболевания органов малого таза.

По возрасту, индексу массы тела, паритету беременностей и родов, соматическому и акушерско-гинекологическому анамнезу обследуемые группы беременных были сопоставимы. Из исследования были исключены пациентки с инфекционными заболеваниями, декомпенсированными формами соматических заболеваний, многоплодной беременностью, аутоиммунной патологией, признаками преэклампсии. Пациентки основной группы во II триместре беременности были госпитализированы в отделение патологии беременных, где им проводились комплексное клинико-лабораторное обследование, а также терапия плацентарной дисфункции на основании Федеральных стандартов и порядка оказания помощи в акушерстве и гинекологии (Приказ № 572н от 2 апреля 2013 г.). Комплекс медикаментозной терапии включал селективные стимуляторы β2-адренорецепторов для улучшения фетоплацентарного кровотока, глюкокортикостероиды (бетаметазон) для профилактики респираторного дистресс-синдрома плода, дигидропиридиновые производные (нифедипин) в качестве токолитических средств.

Материалом для исследования служили плаценты, взятые сразу после родов в сроки 39—40 нед, при соблюдении холодового режима. Микроскопические исследования выявили в плацентах женщин основной группы наличие участков кальциноза, фиброза, гиперваскуляризации ворсин, мелкие межворсинчатые кровоизлияния и лимфоцитарную инфильтрацию. В последах пациенток контрольной группы видимых изменений материнской и плодовой поверхностей не обнаружено, в ряде случаев отмечались небольшие участки фибриноидных масс, умеренная гиповаскуляризация, незначительные лимфоцитарные инфильтрации децидуальной ткани.

Для выделения цитоплазматических белков навески плацентарной ткани, гомогенизированные на холоде (2—4 °С) в 0,2N растворе сахарозы, подвергали дифференциальному ультрацентрифугированию (рефрижераторная центрифуга Beckman США, ротор 7А-14), осаждали ядра и митохондрии и получали супернатант после центрифугирования при 105 тыс. об/мин, 60 мин, который служил источником цитоплазматических белков. Мембранные белки выделяли из препаратов мембран микроворсин синцитиотрофобласта, полученных методом дифференциального центрифугирования тканевых гомогенатов, приготовленных на 0,01 М фосфатном буфере (pH 7,4), после удаления остатков неразрушенных клеток и грубых фракций [4]. Степень чистоты препарата оценивали по активности маркерных ферментов 5’-нуклеотидазы и Na+, K+-АТФазы. В указанных белках после кислотного гидролиза определяли аминокислотный состав на автоматическом анализаторе ААА Microtechno (Чехия). Исследования проводили согласно инструкции к анализатору по стандартной программе для гидролизатов белков. Наряду с исследованием мембранных и цитоплазматических белков был изучен аминокислотный состав одной из гомогенных фракций цитоплазматических белков, выделенных экстракцией 80% раствором этанола с последующей очисткой по ранее описанному методу [5]. Аликвотную часть данных белков подвергали электрофорезу в 7,5% полиакриламидном геле (приборы Protein IEF Cell и Protein IIxi Multi-Cell), при котором они разделялись на 2 фракции. Содержание белка в минорной фракции составило 5,2% от общего количества, а во 2-й фракции — 94,8%. По изоэлектрической точке (6,5) и молекулярной массе (69 750 Да) белок мажорной фракции был близок к сывороточному альбумину. Повторный анализ в 15% полиакриламидном геле свидетельствовал о гомогенности выделенного белка. Он не окрашивался дополнительными красителями, что свидетельствовало об отсутствии в его составе непротеиновых компонентов и, следовательно, об отличии от известных специфических растворимых белков беременности, которые в основном являются гликопротеинами [6—10].

Статистическую обработку данных осуществляли с использованием лицензионного пакета программ Statistica (версия фирмы «StatSoft Inc.»). Однородность дисперсий проверяли по критерию Фишера. Достоверность различий между сравниваемыми показателями определяли по критерию Стьюдента (t-критерий) и его аналогу для непараметрических распределений — критерию Манна—Уитни. Результаты оценивали как статистически значимые при p<0,05.

Результаты и обсуждение

Проведенные исследования выявили отклонения в аминокислотном составе изученных белков плаценты при ПН (табл. 1). Характер и степень этих изменений различны для различных аминокислот и белковых фракций. В цитоплазматических белках отмечено уменьшение количества остатков аргинина на 16%, аспарагиновой кислоты — на 19%, глутаминовой кислоты — на 20%, тирозина — на 24%, фенилаланина — на 14%.

Таблица 1. Аминокислотный состав цитоплазматических и мембранных белков плаценты при физиологической беременности и плацентарной недостаточности (мол.%) Примечание. Здесь и в табл. 2: различия достоверны относительно показателей контрольной группы: * — p<0,05; ** — p<0,01; *** — p<0,001.

Снижение в белках содержания остатков глутаминовой и аспарагиновой кислот сопровождалось уменьшением высокореактивных карбоксильных групп, что ограничивало спектр межмолекулярных связей, необходимых для процессов рецепции, транспорта, клеточной трансформации, фолдинга (сворачивания полипептидной цепи в пространственную структуру). Одновременное уменьшение остатков белковосвязанных ароматических аминокислот, представляющих в полипептидной цепи ионизированные участки, также ограничивало регуляторные возможности белков [11, 12].

Противоположная направленность изменений установлена для остатков гистидина, треонина и глицина, количество которых увеличивалось при ПН в среднем на 14—16%, нарушая нормальное соотношение между заряженными и незаряженными аминокислотами в белковых молекулах. Повышение абсолютного уровня этих аминокислот может объясняться увеличением их относительной доли (мол.%) в белках в связи с уменьшением остатков других прежде всего отрицательно заряженных аминокислот.

Мембранные белки плаценты при ПН отличались повышенным уровнем остатков валина и лейцина на 14—15%, а также сниженным количеством остатков дикарбоновых аминокислот на 14—15%, лизина, гистидина, цистина на 18—20% и пролина на 25%. Следует отметить, что пролин мембранных белков плаценты может служить дополнительным источником свободной формы этой кислоты, являющейся важным компонентом соединительной ткани и эндотелиальных структур, с чем в определенной мере связано уменьшение его содержания в белках. Позитивность такого использования, имеющего компенсаторное значение, подтверждается снижением содержания небелковых пролина и изопролина в плаценте при ПН [13].

Сопоставление степени и направленности изменения содержания аминокислотных остатков в белках свидетельствует о модификации соотношения между полярными (гидрофильными) и гидрофобными аминокислотами, что может нарушать характер внутри- и межмолекулярных взаимодействий. В цитоплазматических белках плаценты при физиологической беременности данный показатель был равен 1,14, при ПН он снижался на 15,8% и составлял 0,96; одновременно на 12% увеличивался положительный заряд этих белков. В мембранных белках также отмечалось уменьшение указанного соотношения (1,71 в норме и 1,33 при ПН), за счет повышения количества остатков гидрофобных аминокислот (валина и лейцина) и обратной динамики гидрофильных, в частности, дикарбоновых — глутаминовой и аспарагиновой кислот. Кроме того, менее выраженное снижение в мембранных белках количества последних относительно диаминовых аминокислот (лизина и гистидина) приводило к снижению положительного заряда белков и, как следствие, к дестабилизации белковой структуры [14]. На изменение аминокислотного состава белков может влиять перераспределение отдельных белковых фракций между субклеточными структурами в результате модификации физико-химических свойств белков или повреждения целостности клеточных мембран [15].

Исключить влияние данного фактора позволило изучение первичной структуры выделенного и очищенного нами гомогенного альбуминоподобного белка плаценты. При беременности, осложненной ПН, молекулярная масса данного белка обнаруживала тенденцию к снижению и составляло 69 550 Да. Что касается аминокислотного состава, то при ПН в нем происходили существенные изменения по сравнению с таковым в контрольной группе (табл. 2). Количество треонина и цистина увеличивалось на 23 и 19% соответственно, а валина, изолейцина, тирозина, аспарагиновой и глутаминовой кислот уменьшалось в среднем на 15—20%. Наиболее значительное снижение обнаружено для аргинина (32%). Важно отметить, что среди белковосвязанных аминокислот аргинин обладает уникальными физико-химическими свойствами из-за имеющегося в его составе гуанидинового радикала, являющегося активным акцептором протонов и способного к целому ряду реакций замещения [16]. Поэтому уменьшение количества его остатков в белках способно существенным образом нарушить способность белков ассоциировать друг с другом и с небелковыми компонентами. Снижение уровня остатков аргинина в белках плаценты может быть обусловлено активацией специфических трипсиноподобных протеиназ, атакующих пептидные связи, образованные карбоксилом аргинина [17]. Подобно аминокислотному составу фракций мембранных и цитоплазматических белков, в гомогенном белке также имелось нарушение отношения между количеством гидрофобных и гидрофильных, основных и кислых аминокислот, следствием чего являлось изменение таких физико-химических характеристик, как коэффициент полярности (повышение на 25%) и величина положительного заряда (снижение на 28%).

Таблица 2. Аминокислотный состав гомогенного альбуминоподобного белка плаценты при физиологической беременности и плацентарной недостаточности (мол.%)

Рассматривая причины изменения аминокислотного состава изученных белковых фракций, можно полагать, что определенную роль в этих изменениях играет нарушение протеомного профиля и посттрансляционных реакций плаценты при ПН [18]. Дифференциально экспрессирующиеся протеины плаценты могут различаться своей первичной структурой в результате модификации процессов синтеза mРНК и белка [14]. Кроме того, большое значение, по-видимому, имеет повышение при ПН активности пептидгидролаз с различной клеточной локализацией [19]. В условиях внутриутробной гипоксии значительную активность проявляют кислые пептидгидролазы, в большей степени локализованные в цитоплазме синцитиотрофобласта. Даже незначительная протеолитическая деструкция белков вряд ли остается без последствий для их структуры и свойств. Снижение молекулярной массы альбуминоподобного белка подтверждает возможность участия пептидгидролаз в изменении аминокислотного состава белков за счет ограниченного протеолиза. В то же время по принципу обратной связи появление белков с измененной первичной структурой будет отражаться на составе протеома плаценты, что создает предпосылки для развития функционально-клеточных повреждений [1].

Резюмируя полученные данные, можно заключить, что развитие ПН происходит на фоне модификации первичной структуры белков, проявляющейся в изменении их аминокислотного состава. Выявленные повреждения белков плаценты, учитывая их многочисленные функции, могут быть важными звеньями в общей цепи молекулярно-биохимических нарушений при ПН.

Выводы

1. Первичная структура цитоплазматических и мембранных белков плаценты, оцененная по аминокислотному составу, при ПН отличается от таковой при физиологической беременности. Изменение аминокислотного состава установлено и для гомогенного белка, подобного по основным свойствам альбумину сыворотки крови.

2. При П.Н. происходят снижение молекулярной массы выделенного гомогенного белка с 69 750 до 69 550 Да, снижение величины суммарного заряда и повышение коэффициента полярности составляющих его аминокислот.

3. Цитоплазматические и мембранные белки плаценты различаются по степени и направленности изменения содержания заряженных и незаряженных, а также гидрофильных и гидрофобных аминокислот.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail