Среди постгеномных подходов к изучению вопросов жизнедеятельности организма важное место принадлежит протеомике, т.е. исследованию факторов конечной стадии передачи информации в клетке - белков и пептидов [1]. Достижения протеомики помогают решать вопросы внутри- и межклеточной сигнализации, посттрансляционных модификаций, структурной характеристики белков. Особое значение имеет использование протеомных технологий в медицинской молекулярной диагностике, позволяющее осуществить поиск дифференциально-экспрессирующихся белков. В настоящее время не вызывает сомнения, что проведение протеомного анализа может способствовать успешному решению проблем репродуктивной медицины, в том числе в области акушерства и перинатологии. Одной из ведущих причин, приводящих к перинатальным осложнениям, является плацентарная недостаточность (ПН), выяснение молекулярных механизмов которой остается весьма актуальным в связи с недостаточной изученностью. Функционально-метаболическая полноценность плаценты во многом зависит от экспрессии белков, играющих ключевую роль, во всех клеточных процессах. Модификация белкового баланса в плаценте может приводить к различным деструктивным процессам в фетоплацентарной системе.

Цель настоящей работы - изучение протеомного спектра плаценты при физиологической беременности и осложненной ПН.

В проспективное исследование были включены 34 женщины в возрасте от 24 до 32 лет (в среднем 26,1±0,4 года), у 15 из которых беременность и роды протекали без осложнений (контрольная группа), у 19 беременность осложнилась ПН субкомпенсированной формы, верифицированной после родов (основная группа). Критериями при постановке диагноза (и для включения в исследование) служили снижение фето- и маточно-плацентарного кровотока при допплерометрии, отставание роста плода по данным ультразвуковой биометрии, снижение сывороточной активности специфических плацентарных изоферментов (глутаматдегидрогеназы и термостабильной щелочной фосфатазы), обнаружение признаков гипоксии плода при проведении кардиотокографии и по уровням ксантина и гуанина в крови [5]. В контрольной группе 7 женщин были первобеременными и первородящими.

У 8 имели место два и более прерывания беременности по желанию женщины. У 3 пациенток в анамнезе наблюдались воспалительные заболевания органов малого таза.

В основной группе были 7 первобеременных и первородящих женщин, у 11 повторнобеременных и повторнородящих имели место два и более прерывания беременности по желанию женщины. У 6 женщин в анамнезе были воспалительные заболевания органов малого таза.

По возрасту, индексу массы тела, паритету беременностей и родов, соматическому и акушерско-гинекологическому анамнезу обследуемые группы беременных были сопоставимы. Критериями исключения из исследования явились декомпенсированные формы соматических заболеваний, многоплодная беременность, декомпенсированная ПН, антенатальная гибель плода, отсутствие информированного согласия женщины. Все пациентки наблюдались в женской консультации по месту жительства и в консультативной поликлинике ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский институт акушерства и педиатриии» Минздрава России. Беременные были родоразрешены в родильном отделении института.

Материалом исследования служили плаценты, взятые сразу после родов в сроке 39-40 нед беременности при соблюдении холодового режима.

Протеомный анализ плацентарной ткани проводили с помощью двухмерного электрофореза в полиакриламидном геле (приборы Protein IEF Cell и Protean II xi Multi-Cell) с последующей времяпролетной масс-спектрометрией экстрагированных из геля пептидов. Идентификацию белков осуществляли с использованием программы Mascot MS Search и баз данных Swiss-Prot и NCBI. Подробно метод был описан ранее [4].

Достоверность различий в белковом спектре плаценты при физиологической беременности и ПН определяли с помощью критерия &khgr;² и четырехпольных таблиц сопряженности, используемых при анализе качественных признаков (программа Statistica версия 6.0. фирмы «StatSoft. Inc.»). Достоверными считались различия при p<0,05.

Данные, полученные в результате проведенного двухмерного электрофореза, свидетельствуют о том, что плацентарная ткань характеризуется широким спектром белков с границами молекулярных масс от 15 до 116 кДа и диапазоном изоэлектрических точек от 3,0 до 10,0. С помощью масс-спектрометрического анализа были идентифицированы белки с различными функциями и свойствами, обеспечивающими возможность многосторонней регуляции метаболизма плаценты.

Результаты исследования представлены в виде таблицы и рисунка.

Среди белков, идентифицированных с помощью масс-спектрометрии, экспрессия которых резко снижена или полностью отсутствует при патологически протекающей беременности (21 белок с диапазоном молекулярных масс от 27 до 92 кДа и изоэлектрических точек от 4,0 до 6,5), наибольшее значение в регуляторных процессах имеют следующие: аннексины^[1] А2 и А4, ингибитор диссоциации Rab, 20S протеасома, кислый рибосомальный белок 60S, митохондриальные цитратсинтаза и диеноил-КоА-изомераза, шапероны^[2] ERp 29 и прохибитин. Значительное уменьшение при ПН содержания указанных белков, участвующих в энергетическом обмене, окислительно-восстановительных реакциях, процессах клеточной трансдукции и межклеточного транспорта, может существенно изменить метаболическую полноценность плаценты и нарушить гомеостаз во всей системе мать-плацента-плод.

Так, аннексин А4, фосфолипид- и гликопротеинсвязывающий белок, широко представленный на базальной поверхности синцитиотрофобласта, модулируют внутриклеточные функции транскрипционного фактора NF-kB, взаимодействуя с его субъединицей р50 [9]. Данный процесс зависит от внутриклеточного содержания ионов кальция, которое также зависит от аннексина А4. Важным представляется способность аннексина А4 регулировать функции белков плазматической мембраны путем образования конгломератов на поверхности клетки, которые изменяют подвижность этих белков и их трансмембранный переход [12]. Уменьшение продукции аннексина А4 сопровождается нарушением вышеуказанных функций. К негативным последствиям приводит и снижение экспрессии еще одного представителя группы аннексинов - аннексина А2, локализованного как на плазматической мембране, так и в цитоплазме, что позволяет контролировать коммуникативные функции между этими клеточными структурами. Модификация продукции аннексина А2, учитывая его роль в мембранном транспорте и ремоделировании цитоскелета [10], может сопровождаться нарушением этих процессов в плаценте. Однонаправленные изменения содержания аннексинов А2 и А4 усиливают метаболические повреждения, прежде всего связанные с проницаемостью плазматических мембран.

Эндоплазматический ретикулярный белок ERp29, экспрессия которого в плаценте при ПН также снижена, является шапероном эндоплазматического ретикулума (ЭР) и ключевым фактором в фолдинге (сворачивании полипептидной цепи в пространственную структуру) эндогенных секреторных белков [13]. Известно, что подавление продукции белка ERp29 может приводить к дисфункции протеасом и изменению интенсивности клеточной пролиферации [7]. В настоящее время снижение содержания ERp29 рассматривается как новый индикатор ЭР-стресса, являющегося важным регулятором функционального состояния клеток. Приведенные функции этого белка подтверждают возможность развития гомеостатического дисбаланса в его отсутствие.

Еще один многофункциональный белок со сниженной экспрессией в плаценте - прохибитин, расположенный преимущественно на внутренней мембране митохондрий, является шапероном этих субклеточных фракций, где он регулирует клеточный цикл на уровне фаз G1 и S. Кроме того, прохибитин, взаимодействуя с различными ядерными белками, вовлекается в модуляцию экспрессии генов. Являясь потенциальным опухолевым супрессором, он действует как мощный транскрипционный модулятор α-рецептора эстрогена, что особенно важно для плацентарной ткани [6]. Отсутствие прохибитина приводит также к дезорганизации митохондриальных нуклеотидов, повышению чувствительности к стимулам, вызывающим апоптоз и увеличение генерации активных форм кислорода [5]. Последнее может сопровождаться внутриклеточной гипоксией и развитием окислительного стресса, вызывающего развитие ПН.

Снижение экспрессии при ПН еще двух белков, связанных с митохондриальными структурами, - цитратсинтазы и диеноил-КоА-изомеразы, ухудшает функционирование этих важных субклеточных структур и может сопровождаться уменьшением генерации энергии в клетках плаценты.

Отсутствие в протеомном профиле плаценты при развитии ее недостаточности характерно для таких цитоплазматических белков, как β- и γ-актины, а также актиноподобных белков (actin-related protein) - Arp 2 и 3 субъединицы 2 комплекса Arp 2/3. Указанные изоформы актина обычно выявляются в виде микрофиламентов^[3], принимающих участие в проведении внутриклеточных сигналов и, в конечном итоге, в регуляции экспрессии генов. Повреждение процессов сборки и разборки актиновых микрофиламентов приводит к нарушению целостности цитоскелета, которая является необходимым условием не только нормального проведения сигнала, но и транспорта мРНК, регуляции процессов транскрипции, активности ферментов, ионных каналов, передачи медиаторов [3].

Что касается актиноподобных белков, выполняющих как структурные функции, так и регуляторные, связанные с их способностью взаимодействовать с сигнальными молекулами, то снижение продукции указанных белков будет сопровождаться угнетением этих функций. Среди последних следует выделить полимеризацию актина и регуляцию транскрипции [3]. В то же время при ПН нарушаются и процессы трансляции, поскольку в контроле над ними участвует кислый рибосомальный белок 60S [14], экспрессия которого при данном осложнении беременности также снижена.

Наряду с отсутствием в плаценте при ПН ряда белков отличия установлено появление дополнительных белков, из которых идентифицировано 6 с диапазонами молекулярных масс от 32 до 116 кДа и изоэлектрических точек от 5,0 до 7,0.

К их числу относится α-актинин-4. Этот цитоскелетный белок, опосредованно участвующий в передаче сигналов в ядро, способен комплексироваться с фактором NF-kB, что приводит к модификации внутриклеточных функций последнего, в частности, способствует увеличению экспрессии генов, усиливающих апоптоз [3].

Еще один белок цитоскелета с повышенной продукцией при ПН - виментин. Он представляет собой белок, отвечающий за сохранность структуры клетки, участвующий во взаимодействиях различных систем цитоскелета и мембранном транспорте между ЭР и комплексом Гольджи [8]. Повышение продукции этого белка, с одной стороны, может иметь компенсаторное значение, направленное на поддержание целостности клетки, а с другой - являться отражением нарушения баланса между плацентарным аргинином и цитруллином, усиления генерации оксида азота и пероксинитрита в условиях хронической гипоксии при ПН [2]. В качестве компенсаторного фактора при ПН можно рассматривать увеличение в плаценте экспрессии β-тропомиозина, который в комплексе с другими белками принимает участие в формировании структуры и функционировании цитоскелета [11].

Компенсаторную роль, по-видимому, играет и повышение продукции митохондриальной α-кетоглутарат­дегидрогеназы, катализирующей наиболее уязвимый участок цикла трикарбоновых кислот. Однако такая направленность динамики этого белка может одновременно приводить к увеличению активности аспартатаминотрансферазы [5].

При ПН появляется также глюкозорегулируемый белок - эндоплазмин, относящийся к молекулярным шаперонам и играющий важную роль в ЭР при ядерной сигнализации, фолдинге и секреции ряда белков [15]. Усиление его продукции в плаценте, очевидно, имеет позитивное значение в белковом гомеостазе, клеточной дифференцировке и защите от ЭР-стресса, т.е. в процессах, находящихся в сфере влияния данного белка. Такая направленность изменений его содержания, возможно, способствует предотвращению развития декомпенсированной ПН. В свою очередь, повышение содержания эндоплазмина может быть результатом ингибирования процессов гликозилирования, которое отмечается при ПН [5], поскольку блокада этой посттрансляционной модификации, как известно, сопровождается увеличением его экспрессии [15].

Представляет интерес сопоставление протеомного состава плаценты при ПН и других осложнениях беременности. Как следует из проведенных нами ранее исследований при преэклампсии [4], формирование этой акушерской патологии происходит на фоне определенных отличий в количественном и качественном составе отсутствующих или, напротив, появляющихся белков плаценты относительно такового при ПН, что может приводить к развитию разных клинических проявлений.

Резюмируя полученные данные, можно заключить, что модификация в составе структурных, транспортных и регуляторных белков плаценты может быть первичным звеном в общей цепи молекулярно-биохимических нарушений при ПН.

1. Протеомный спектр плаценты при ПН отличается от такового при физиологической беременности. Идентифицированы 27 белков отличия, которые не были обнаружены или, напротив, появлялись в плаценте при ее недостаточности.

2. К числу белков со сниженной экспрессией относятся аннексин А2 и А4, эндоплазматический ретикулярный белок ERp29, прохибитин, β- и γ-актины, актиноподобные белки Arp 2 и 3, кислый рибосомальный белок 60S, митохондриальные цитратсинтаза и диеноил-КоА-изомераза.

3. Повышение экспрессии в плаценте при ПН установлено для эндоплазмина, α-актинина, виментина, β-тропомиозина, α-кетоглутаратдегидрогеназы.