Генетические параллели в мультифакторных моделях пародонтита с агрессивным течением и остеопороза

Пародонтит - хроническое воспалительное заболевание тканей пародонта. Последняя классификация болезней пародонта, принятая на Международном симпозиуме ААР и EFP (1999-2000), выделяет пародонтит с агрессивным течением в особую группу (тип III). Согласно клинической характеристике, к агрессивным формам пародонтита (АФП) относят: препубертатный, ювенильный и быстропрогрессирующий пародонтиты. Отличительной особенностью данной группы заболеваний является: раннее начало, активное течение, приводящее к быстрой потере прикрепления зуба, частые рецидивы, сопровождающиеся абсцедированием и гноетечением из пародонтальных карманов, быстрая резорбция костной ткани альвеолярных отростков, устойчивость к традиционной терапии. Исследования состояния пародонта, по данным ВОЗ, показали, что распространенность и тяжесть воспалительных заболеваний пародонта в разных странах различается и составляет от 40 до 70%. При этом просматривается тенденция к увеличению частоты распространенности АФП. Увеличение частоты заболеваемости, отсутствие четких диагностических критериев для АФП (за исключением возраста - от 18 до 35 лет), отсутствие длительного положительного эффекта лечения обусловливают значительный интерес стоматологов к данной проблеме.

Пародонтит является полиэтиологичным заболеванием [1, 8]. В настоящее время существует несколько теорий его развития. Главным местным фактором, вызывающим альтерацию тканей пародонта, считают пародонтопатогенную флору [10]. Согласно другой теории, возникновение пародонтита связывают с несостоятельностью неспецифической резистентности и системы иммунитета. Наряду с указанными теориями важным фактором развития заболевания является генетическая компонента.

В большом количестве работ исследуется генетическая предрасположенность к пародонтиту, в том числе и к агрессивной его форме в результате снижения неспецифической резистентности [17], изменений в системе иммунитета [12, 13] и цитокиновом профиле [6].

Однако резорбция альвеолярной кости при пародонтите с агрессивным течением, происходит, возможно, не только под влиянием таких местных факторов, как воздействие пародонтопатогенной флоры и ответная реакция тканей пародонта, но и при нарушении системного регулирования метаболизма костной ткани в целом.

Зная о гетерогенности локализации остеопоротических изменений, схожести характера минерального обмена при пародонтите и остеопорозе (ОП), которую выявили при изучении показателей кальциевого гомеостаза и уровня кальцийрегулирующих гормонов [1], а также опираясь на теорию о том, что гены влияют на восприимчивость к заболеваниям, имеющим общее происхождение, мы предположили, что полиморфные варианты, предрасполагающие к ОП, могут влиять и на развитие АФП.

Рецептор 1-го типа паратиреоидного гормона и рецептор кальцитонина располагаются на поверхности клеток, участвующих в костном ремоделировании (остеобласты), и относятся к одному субсемейству GSRCs (G protein-coupled receptors), общей структурой для которых является наличие 7 трансмембранных доменов, 3 экстрацеллюлярных и 3 интрацеллюлярных петель, аминотерминального экстрацеллюлярного домена и карбоксильного конца.

Ген PTHR1 (ген рецептора 1-го типа паратиреоидного гормона) располагается на длинном плече хромосомы 3 (3p22-p21.1). Тетрануклеотидный повтор -/AAAG (rs10533296) располагается в промоторе 3 (точнее, Р3-8) экзона U4, непосредственно перед экзоном S. Минисателлитный повтор c.48-360AAAG, по данным разных авторов, может состоять от 3 до 9 тандемных тетрануклеотидных повторов. Изменение числа тандемных повторов влияет на активность промотора и, по данным исследователей [2, 3, 9, 16, 22] отражается на росте и достижении пика костной массы.

Ген CALCR (ген рецептора кальцитонина) (rs1801197) располагается на коротком плече хромосомы 7 (7q21.3). Замена пролина (ССG) на лейцин (CTG) в положении 463 в экзоне 17 была открыта в 1997 г. с помощью рестриктазы ALUI (способной распознавать умеренно повторяющиеся последовательности ДНК). Повторы, относящиеся к семейству ALU, состоят в среднем из 300 пар нуклеотидов и примерно в 170 парах нуклеотидов от начала повтора располагается сайт узнавания ALU рестриктазы. Ген кодирует изоформу-1 высокоаффинитивного рецептора для гормона кальцитонина. Замена основания 1340С>Т, по свидетельству ряда авторов [2, 3, 5, 7, 14, 21, 24], влияет на плотность костной ткани, однако в одном исследовании снижение минеральной плотности было связано с С/С генотипом у мужчин.

Ген COLIA1 (ген α1-цепи коллагена I типа) располагается на длинном плече хромосомы 17 (17q21.33), в первом интроне правее SP1 связывающего сайта на +1245 пар нуклеотидов. Ген кодирует про-α1-цепь коллагена 1-го типа. Полиморфизм с.104-441G>T (rs1800012) вносит вклад в изменение нормального соотношения α1- и α2-цепей коллагена 1-го типа посредством увеличения транскрипционной активности. В результате синтез α1-цепи увеличивается, что в свою очередь вызывает изменения в конечной структуре коллагеновых волокон и приводит к нарушению формирования нормальной костной ткани [2, 3, 11, 19, 20].

Цель работы - определить частоту встречаемости аллелей и генотипов во всех 4 группах (см. «Материал и методы»), выявить отличительные особенности распределения аллелей и генотипов в группах, определить относительный риск развития АФП и ОП во взаимосвязи с носительством полиморфных аллелей с.1340С>Т гена CALCR, с.104-441G>T гена COLIA1 и с.48-360 AAAG гена PTHR1. Проанализировать предрасположенность к АФП или ОП на основании выявленного относительного риска.

Забор крови производился с информированного согласия участников исследования. Общее количество участников исследования 203 человека. 1-ю группу составили 47 человек (24 женщины, 23 мужчины) в возрасте от 18 до 47 лет (средний возраст 37,1±1,1 года). Критерием включения являлось наличие АФП, критерием невключения - наличие в анамнезе заболеваний, которые могли бы повлиять на состояние минерального обмена (заболевания щитовидной железы и желудочно-кишечного тракта, патология почек), ОП. Диагноз основывался на результатах опроса, осмотра пациента, данных ортопантомографии, двухэнергетической рентгеновской денситометрии (DЕХА), данных лабораторного исследования (кальций общий, кальций ионизированный, паратиреоидный гормон, кальцитонин). 2-ю группу составили 40 человек (32 женщины, 8 мужчин) в возрасте от 52 до 72 лет (средний возраст 67,2±1,8 года). Возраст начала менопаузы составил 52,3±2,51 года (в менопаузе 5,6±0,82 года). Критерием включения пациентов являлось наличие системного ОП, критерием невключения - наличие АФП. Диагноз «остеопороз» основывался на данных, полученных в результате исследования минеральной плотности кости (МПК) с помощью DEXA в соответствии с рекомендациями ВОЗ [4], а также данных лабораторного исследования (кальций общий, кальций ионизированный, паратиреоидный гормон, кальцитонин). Контрольную группу составили 64 человека (30 женщин, 34 мужчины) в возрасте от 28 до 45 лет (средний возраст 40,8±2,34 года), без АФП и ОП. Случайную популяционную выборку (СПВ) составили образцы ДНК 52 пациентов, из базы ДНК-лаборатории ДНК-диагностики ГУ МГНЦ РАМН.

Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови выполняли с помощью набора DLAtom^ТМ DNA Prep100 по протоколу производителя, затем проводилась полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Для ДНК-диагностики точковых мутаций и полиморфизмов использовался метод аллельспецифичного лигирования с последующей амплификацией (мультиплексная лигазная реакция - MLPA). Далее для визуализации результатов анализа электрофоретической подвижности амплификационных фрагментов проводился электрофорез в полиакриламидном 7% геле с соотношением АА: БА - 29:1). В качестве катализаторов полимеризации геля использовали персульфат аммония и ТЕМЕD. Для визуального контроля образцы перед нанесением на гель смешивали с красителем (0,5% бромфеноловый синий и 0,5% ксилолцианол) в соотношениях 4:1, 5:1. Системы идентификации полиморфизма промотерной области гена PTHR, идентификации полиморфных вариантов генов COLIA1, CALCR представлены в табл. 1 и 2.

Статистическая обработка данных осуществлялась с использованием двустороннего критерия Фишера, данные группы здорового контроля попарно сравнивались с результатами других групп. Для выявления риска развития АФП и ОП использовали формулу относительного риска (RR). В случае отсутствия данного генотипа в группе применялась модифицированная формула.

Частота с.1340Т в группах АФП и ОП составила 71%, в группе контроля - 86%, в СПВ - 77%, частота с.1340С - 29, 14 и 23%. Результат визуализации гена представлен на рис. 1.

Генотип Т/Т выявлен у 26 (55%) пациентов с АФП, у 19 (46%) - с ОП, у 46 (72%) в группе контроля и у 29 (56%) в СПВ; генотип С/Т - соответственно у 15 (32%), 20 (49%), 16 (25%) и 22 (42%); генотип С/С - у 6 (13%), 2 (5%), 1 (3%) и у 1 (2%) соответственно.

При попарном сравнении частот аллелей контрольной группы с группами АФП, ОП и СПВ достоверные различия были получены во всех комбинациях, кроме пары сравнения контроль - СПВ (табл. 3).

Частота аллеля Т была самой высокой в группе контроля, и этот факт не соответствует данным F. Tsai и соавт. [21], согласно которым аллель Т ассоциировался со снижением плотности костной ткани, однако в группу контроля в нашем исследовании были включены пациенты без ОП и, следовательно, можно было ожидать более низкую частоту встречаемости аллеля Т в этой группе. Встречаемость аллеля Т была высокой и одинаковой в группах АФП и ОП, но достоверно ниже, чем в контроле.

Частота генотипов в контроле достоверно отличалась от таковой в основных группах и СПВ (см. табл. 3). Наибольшее количество гомозигот по с.1340Т зафиксировано в контрольной группе. В группе с ОП процент гомо- и гетерозигот по аллелю Т был практически равным, поэтому затруднительно предположить, какой генотип может быть связан с ОП в исследованной нами когорте, а также согласиться с предположением авторов [14, 21, 24] о том, что, пациенты гомозиготные по аллелю с.1340Т, более предрасположены к ОП. Сравнение результатов V. Braga и соавт. [5], которыми была установлена связь генотипа С/C со снижением костного формирования у мужчин, с данными групп ОП и АФП не представлялось возможным, так как в группе ОП были 2 пациента с данным генотипом, а в группе АФП количество мужчин и женщин, обладающих этим генотипом, было равным.

Расчет относительного риска (RR для АФП (табл. 4) показал, что при наличии гомозиготного генотипа по замене c.1340С гена CALCR риск АФП увеличивается в 4,1 раза, генотипа С/Т - в 1,3 раза, а при обладании генотипом Т/Т риск не выявлен.

В связи с достоверно частым выявлением в группе АФП генотипа С/С и риска развития заболевания при наличии данного генотипа мы высказываем осторожное предположение, что генотип С/C, может являться одним из полиморфных вариантов, предрасполагающих к АФП. Относительный риск развития ОП увеличивается в 2 раза при наличии генотипа С/Т, по остальным генотипам риск не выявлен. Таким образом, возможно, что для пациентов группы ОП генотип С/Т может являться предрасполагающим к болезни, поскольку его встречаемость в группе была значительной и отмечено увеличение риска развития заболевания при обладании данным генотипом.

Аллель с.104-441T (см. рис. 1) в группе АФП отмечен у 47%, в группе пациентов ОП - у 9%, в группе контроля - у 28%, в СПВ - у 24%, аллель с.104-441G - соответственно у 53, 91, 72 и 76% случаев.

Генотип Т/Т выявлен у 12 (25%) пациентов с АФП, не выявлен у пациентов с ОП (0%), в контроле - у 3 (5%), в СПВ - у 2 (4%); генотип G/Т - соответственно у 20 (43%), 8 (20%), 30 (47%) и 20 (38%); генотип G/G - у 15 (32%), 32 (80%), 31 (48%) и 30 (58%) соответственно.

Достоверные различия частот аллелей выявлены при сравнении: контрольной группы с группой АФП и контрольной группы с группой ОП (см. табл. 3). Результаты в группах ОП и АФП представляются нам интересными, поскольку распространенность аллеля G была самой высокой в группе с ОП, а наибольшая встречаемость аллеля Т - в группе с АФП. В результате наши данные по замене с.104-441G>Т расходятся с данными авторов [15, 24], которые выявили ассоциацию остеопоротических изменений осевого скелета с аллелем +1245T при сочетании с другими полиморфными вариантами –1997G и –1663del, расположенными рядом с SрI сайтом. Также наши данные расходятся с работой российских ученых L. Selezneva и соавт. [19], в которой также было установлено, что –1997G/G/–1663ins/del/+1245T гаплотип влияет на увеличение риска переломов.

Сравнение частоты генотипов показало достоверные различия между контрольной группой и группой АФП, контрольной группой и группой ОП (см. табл. 3).

Наши данные по замене с.104-441G>Т отличаются от данных работы F. Tsai и соавт. [21], установивших ассоциацию генотипа Т/Т с ОП, поскольку в нашем исследовании в группе с ОП названный генотип вообще не был представлен. Группы контроля и СПВ принадлежали к одному распределению и были представлены в основном генотипами G/G и G/T, а частота генотипа Т/Т не превышала 5%. Гетерозиготный генотип во всех группах, кроме группы ОП, был равным. Таким образом, можно с осторожностью предположить, что для пациентов с ОП генотип G/G может являться одним из полиморфных вариантов, определяющих развитие заболевания, в то время как для пациентов с АФП, определяющую роль играют генотип Т/Т.

Относительный риск развития АФП (см. табл. 4) при наличии гомозиготного генотипа по замене c.104-441T гена COLIA1 увеличивается в 5,4 раза, по остальным генотипам риск не выявлен. Боóльшая частота встречаемости генотипа Т/Т в группе пациентов с АФП по сравнению с другими группами, а также выявление относительного риска развития АФП при обладании данным генотипом, дают возможность предположить, что указанный генотип может быть причастен к развитию АФП. При этом необходимо отметить, что полученные нами данные относительно снижения МПК при наличии аллеля Т или гомозиготного генотипа Т/Т не согласуются с данными других авторов, поскольку в группу с АФП отбирались пациенты без снижения МПК осевого скелета и, по результатам DEXA, у пациентов, обладающих указанным аллелем или генотипом, МПК была в пределах нормальных значений.

Относительный риск развития ОП при наличии генотипа G/G увеличивался в 2 раза, по другим генотипам значительного риска не выявлено. Таким образом, на основании высокой распространенности генотипа G/G, а также наличия риска развития ОП при обладании указанным генотипом мы предполагаем, что данный полиморфизм может вносить вклад в развитие болезни.

Частота встречаемости аллеля с.48-360АААG гена PTHR1 (рис. 2)

Генотип 5/5 выявлен у 26 (56%) пациентов с АФП, у 22 (55%) с ОП, у 48 (75%) - контрольной группы, у 21 (40%) СПВ, генотип 5/6 - соответственно у 19 (40%), 18 (45%), 15 (23%) и 27 (52%), генотип 6/6 - у 2 (4%), 0 (0%), 1 (2%) и у 4 (8%) пациентов.

Частота аллелей достоверно различалась при сравнении группы контроля и СПВ (см. табл. 3).

Частота аллелей 5 и 6 между группами ОП и АФП достоверно не различалась, следовательно, группы принадлежат к одному распределению. Поскольку отсутствуют значимые различия между частотой аллелей 5 и 6 в группах АФП и ОП, затруднительно предположить, какой аллель может быть связан со снижением МПК в области осевого и лицевого скелета. Редкое выявление аллеля 6 в группе здорового контроля, объяснить сложно, если основываться на данных работы M. Minagava и соавт. [16], которые выявили, что аллель 6 является протективным, а при наличии у пациентов пяти тетрануклеотидных повторов наблюдается снижение МПК вследствие большей активности промотора гена.

Частота встречаемости генотипов различалась при сравнении: группы контроля и группы ОП, группы контроля и СПВ (см. табл. 3). Влияние на костную ткань полиморфных вариантов гена PTHR1, вероятно, заслуживает дополнительного изучения, поскольку именно в группе здорового контроля выявлялся генотип 5/5 в самом большом проценте случаев, при этом исследования A. Scillitani и соавт. [18] показали, что пять тетрануклеотидных повторов в генотипе ассоциировалось со снижением прочностных характеристик кости, однако у пациентов контрольной группы МПК была в норме.

Относительный риск развития АФП (см. табл. 4)

Относительный риск развития ОП при наличии генотипа 5/6 увеличивался в 1,4 раза, при наличии генотипа 6/6 - в 4,7 раза. Таким образом, генотипы 5/6 и 6/6 могут быть причастны к снижению МПК при АФП и ОП.

Результаты настоящего исследования необходимо интерпретировать с большой осторожностью в связи с мультифакторным характером патогенеза пародонтита с агрессивным течением, сложным характером наследования и большим количеством полиморфизмов, определяющих фенотип этого заболевания. Необходимо продолжать поиск возможных генетических маркеров пародонтита с агрессивным течением, используя данные, полученные при изучении сходных по патогенезу заболеваний.