Мельник А.М.

ФГБВОУ ВО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации, Санкт-Петербург, Россия

Дворянчиков В.В.

Кафедра отоларингологии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова МО РФ, Санкт-Петербург

Воронов А.В.

Кафедра хирургических болезней, эндоскопической и детской хирургии Института повышения квалификации специалистов здравоохранения, Хабаровск

Исаченко В.С.

Кафедра отоларингологии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова МО РФ, Санкт-Петербург

Изучение микрофлоры полости носа пациентов с хроническим полипозным риносинуситом методом масс-спектрометрии микробных маркеров

Авторы:

Мельник А.М., Дворянчиков В.В., Воронов А.В., Исаченко В.С.

Подробнее об авторах

Журнал: Российская ринология. 2016;24(4): 16‑23

Прочитано: 1282 раза


Как цитировать:

Мельник А.М., Дворянчиков В.В., Воронов А.В., Исаченко В.С. Изучение микрофлоры полости носа пациентов с хроническим полипозным риносинуситом методом масс-спектрометрии микробных маркеров. Российская ринология. 2016;24(4):16‑23.
Melnik AM, Dvorianchikov VV, Voronov AV, Isachenko VS. Investigation of the nasal cavity microflora in patients with chronic polypous rhinosinusitis by mass spectrometry of microbial markers. Russian Rhinology. 2016;24(4):16‑23. (In Russ.)
https://doi.org/10.17116/rosrino201624416-23

Рекомендуем статьи по данной теме:
Ме­ха­низ­мы по­вы­ше­ния те­ра­пев­ти­чес­ко­го по­тен­ци­ала в ус­ло­ви­ях ком­плексно­го при­ме­не­ния ле­чеб­ных фи­зи­чес­ких фак­то­ров у па­ци­ен­тов с хро­ни­чес­ким по­ли­поз­ным ри­но­си­ну­си­том. Вос­ста­но­ви­тель­ные би­отех­но­ло­гии, про­фи­лак­ти­чес­кая, циф­ро­вая и пре­дик­тив­ная ме­ди­ци­на. 2024;(3):24-32
Про­ти­вог­риб­ко­вый им­му­ни­тет у па­ци­ен­тов с по­ли­поз­ным ри­но­си­ну­си­том. Вес­тник ото­ри­но­ла­рин­го­ло­гии. 2024;(6):40-45
Слу­чай дли­тель­ной ре­мис­сии пос­ле от­ме­ны би­оло­ги­чес­кой те­ра­пии у па­ци­ен­та с тя­же­лым не­кон­тро­ли­ру­емым по­ли­поз­ным ри­но­си­ну­си­том. Вес­тник ото­ри­но­ла­рин­го­ло­гии. 2024;(6):99-106
Си­нер­ге­ти­чес­кая эф­фек­тив­ность ис­поль­зо­ва­ния пре­фор­ми­ро­ван­ных фи­зи­чес­ких фак­то­ров и ду­пи­лу­ма­ба в те­ра­пии по­ли­поз­но­го ри­но­си­ну­си­та. Вос­ста­но­ви­тель­ные би­отех­но­ло­гии, про­фи­лак­ти­чес­кая, циф­ро­вая и пре­дик­тив­ная ме­ди­ци­на. 2025;(2):16-23
К воп­ро­су о вза­имос­вя­зи пат­тер­нов ок­си­да­тив­но­го стрес­са и про­вос­па­ли­тель­ных ци­то­ки­нов у па­ци­ен­тов с по­ли­поз­ным ри­но­си­ну­си­том в ус­ло­ви­ях кур­со­во­го при­ме­не­ния ле­чеб­ных фи­зи­чес­ких фак­то­ров. Вос­ста­но­ви­тель­ные би­отех­но­ло­гии, про­фи­лак­ти­чес­кая, циф­ро­вая и пре­дик­тив­ная ме­ди­ци­на. 2025;(2):42-49

Несмотря на возрастающее количество фундаментальных исследований и результаты клинических наблюдений, патогенез полипозного риносинусита (ПРС) до настоящего времени окончательно не выяснен.

Начиная с 60—70-х годов прошлого столетия, внимание исследователей привлечено к изучению значения бактериальной, вирусной и микотической сенсибилизации в развитии хронических риносинуситов и полипов носа [1, 2].

В силу ряда причин исследование микробиоты полости носа классическими методами в условиях клинической бактериологической лаборатории сильно затруднено или полностью невозможно. Для реализации этих задач необходимы возможности специализированных лабораторий, обладающих арсеналом культуральных и некультуральных методов, позволяющих обеспечить количественный анализ полимикробной инфекции одного больного. Как правило, это требует значительных материальных и временны́х затрат, несовместимых со стоимостью и временем пребывания больного в стационаре. В связи с этим возникает необходимость внедрения новых экспресс-методов диагностики инфекционного статуса пациента. Таковым можно считать метод масс-спектрометрии микробных маркеров (МСММ), позволяющий в ускоренном режиме, минуя стадию культивирования и тестовых ферментаций, определить спектр доминирующих микроорганизмов (более 104 клеток в пробе) по молекулярным маркерам — клеточным высшим жирным кислотам, альдегидам и стеринам (табл. 1) [3—5].

Таблица 1. Высшие жирные кислоты, входящие в состав клеточной стенки микроорганизмов, у которых они наиболее часто встречаются* Примечание. * — вещества приведены в порядке возрастания числа атомов углерода в цепи молекулы, что соответствует хроматографическому времени удерживания; ** — обозначения веществ: 17:1, где 17 — число атомов углерода, цифра после двоеточия — число двойных связей; а, i — разветвление.

Суть исследования состоит в прямом извлечении с помощью химической реакции высших жирных кислот из подлежащего исследованию образца, их разделении на газовом хроматографе в капиллярной колонке высокого разрешения и анализе состава в динамическом режиме на масс-спектрометре. Хроматограф соединен с масс-спектрометром и снабжен компьютером с соответствующими программами автоматического анализа и обработки данных. При этом сам процесс анализа занимает 30 мин, а с учетом времени подготовки проб и расчета данных — не более 2,5 ч.

Внедрение МСММ позволяет сократить время и стоимость исследования, минуя стадии повторных пересевов первичных колоний и тестовых ферментаций, которые особенно сложны, трудоемки и длительны для анаэробов. В этом методе применен математический аппарат количественного реконструирования состава микроорганизмов в очаге воспаления по составу их маркеров в биопробе, что позволяет контролировать инфекцию в динамике заболевания, а также эффективность лечения [6, 7].

Цель исследования—изучить состав микрофлоры полости носа у пациентов с ПРС методом газохроматографического масс-спектрометрического (ГХ-МС) детектирования молекулярных маркеров бактерий.

Материал и методы

Во время предоперационной подготовки у пациентов с хроническим ПРС проводили забор материала из полости носа бактериологическими тампонами, которые хранили в замороженном состоянии (при температуре –5 °С). Для ГХ-МС-анализа вату с тампона переносили в реакционный сосуд (виал) и подвергали кислому метанолизу в 0,4 мл 1 М HCl в метаноле в течение 45 мин при температуре 80 °C. Полученные в результате реакции метанолиза микробных липидов жирные кислоты в виде метиловых эфиров двукратно экстрагировали 200 мкл гексана, высушивали и обрабатывали в 20 мкл N, О-бис(триметилсилил)трифторацетамида в течение 15 мин при температуре 80 °C для получения триметилсилильных эфиров гидроксикислот и стеролов. В реакционный сосуд добавляли 40 мкл гексана, затем 2 мкл смеси вводили в инжектор ГХ-МС-системы 5850/5973 Agilent Technologies (США). Для управления и обработки данных использовали штатные программы прибора. Хроматографическое разделение пробы осуществляли на капиллярной колонке с метилсиликоновой привитой фазой HP-5ms Agilent.

Анализ и обоснование принадлежности маркеров конкретным микроорганизмам осуществляли по технологии «Оценка микроэкологического статуса человека методом хромато-масс-спектрометрии» (разрешение Росздравнадзора Ф.С. 2010/038 от 24.02.2010). Таким способом определяли эффективную (т.е. соответствующую измеренной в данный момент концентрации маркера) численность микроорганизмов разных таксонов, в том числе анаэробов, актинобактерий, дрожжей, грибов и вирусов — всего 170 таксонов, введенных в программу скриннига маркеров. В число определяемых по маркерам микроорганизмов входят не только те, что присутствуют в момент отбора пробы на поверхности очага воспаления, но и находящиеся внутри слоя ткани, из которого химические вещества отмирающих микроорганизмов могут поступать с экссудатом.

Нерациональное употребление антибиотиков, назначаемых по данным культурального теста на чувствительность, приводит к увеличению антибиотикорезистентных микробных штаммов, а также губительно действует на нормальную микробиоту организма. Более того, многочисленные данные показывают, что колонизация слизистых оболочек в норме является полимикробной [8, 9], а любая инфекция — полиэтиологичной [3]. В этой ситуации тактика антибиотикотерапии должна учитывать качественную и количественную приоритетность отдельных видов в совокупном инфекционном сообществе. Для реализации такого подхода необходимо применение некультуральных молекулярных методов, которые получили развитие в конце прошлого века.

Результаты и обсуждение

Используя метод МСММ, оказалось возможным установить по мазкам из полости носа наличие микроорганизмов, принадлежащих к 57 таксонам.

По результатам анализа микробного сообщества пациентов (n=26) по сравнению со здоровыми донорами (n=10) обнаружено систематическое клинически значимое (более чем в 10 раз по сравнению с нормой) увеличение численности бактерий преимущественно 2 таксонов, а именно анаэробных видов Eubacterium/Clostridium, Propionibacterium freundenreihii/Cl. Subterminale, вирусов герпеса и некоторых других микроорганизмов (рис. 1). Увеличение представительства условно-патогенных бактерий семейства Enterobacteriacea на слизистой оболочке носа при ПРС свидетельствует о дисбиотических изменениях в полости носа при данной патологии и их несомненной роли в развитии воспалительного процесса. Одновременно установлено устойчивое угнетение роста лактобактерий.

Рис. 1.Реконструкция видового состава микрофлоры по результатам МСММ в мазке пациента с ПРС.

Выявлено увеличение общей численности условно-патогенных микроорганизмов. Этиологически значимыми при ПРС являются стафилококки, стрептококки (Streptococcus pneumoniae), энтеробактерии и нейссерии.

Есть данные о сенсибилизирующем эффекте стафилококков, стрептококков, кишечной палочки, протея, нейссерии, а также вирусных инфекций и грибов. При этом ведущее значение в развитии полипов носа придается Staphylococcus aureus и «суперантигену» золотистого стафилококка [1, 8].

Концентрация маркеров другой группы микроорганизмов не превышала в среднем уровень колонизации слизистой зева у доноров. К ним относятся представители родов Staphylococcus,Lactobacillus,Streptococcus, Pseudonocardia,Stenothrophomonas, а также Corynebacterium и др. Микроскопические грибы (не кандида) — плесневые, дерматофиты и др. оказываются в дефиците у пациентов.

Метод МСММ дает возможность определить концентрацию липополисахарида (эндотоксина грамотрицательных бактерий) путем пересчета суммы гидроксикислот из состава его липида А, по которым детектируются конкретные бактерии этого типа — Pseudomonas, Moraxella, Bacteroides и др. Его концентрация составляет 0,1—3 нмоль в тампоне и превышает норму в 30 раз у пациентов по сравнению с группой доноров.

Неэффективность антибиотиков объясняется, с одной стороны, отсутствием чувствительности основного возбудителя к терапии, с другой — присутствием грибковой флоры.

Применение метода МСММ объясняет этот кажущийся парадокс. Как известно, выбор антибиотика осуществляется исходя из результатов посева материала на питательные среды, с помощью которых определяются стрептококки, стафилококки и непатогенные нейссерии. Количественные данные метода МСММ показывают, что эти микробы действительно присутствуют в клиническом материале (рис. 2), однако их количество в основной и контрольной группах одинаково. Это указывает на нормальную составляющую микробиоты, а истинными инфекционными агентами являются те, которые обнаруживают наибольшую кратность увеличения численности у больных по сравнению с контролем. Как видно из табл. 2, наибольшая кратность увеличения концентрации маркеров микроорганизмов отмечена у анаэробов (примерно в 30 раз увеличивалась численность бактерий группы Eubacterium/Clostridium). Из этого следует, что эффект антибиотикотерапии будет положительным, если она будет направлена против истинных возбудителей.

Таблица 2. Усредненный состав и количество микроорганизмов в мазке из носа у здоровых доноров Примечание. Численность микроорганизмов в ячейках указана для удобства сопоставления (уменьшена на пять порядков). Таким образом, например, численность Streptococcus spp. в группе сравнения составляет 2304∙105.

Рис. 2. Реконструкция видового состава микрофлоры по результатам МСММ в мазке пациента с грибковым синуситом.

В колонке «проба» приведена расчетная численность микроорганизмов в клетках на 1 г мазка, ∙105.

Заключение

Применение метода МСММ у больных ПРС позволяет точно определить баланс микрофлоры с учетом разновидностей определяемых микроорганизмов из малого количества исследуемого материала, что значительно сокращает сроки их распознавания, расширяет возможности проведения адекватной терапии и контроля ее эффективности.

Учитывая данные МСММ, полученные в этом исследовании, можно предположить, что доминанты инфекции (Clostridium, Eubacterium, другие анаэробы) оказываются невосприимчивыми к назначаемым препаратам. Напротив, угнетение минорной составляющей инфекции ( Staphylococcus,Streptococcus, non-pathogenic Neisseria) стимулировало конкурентное развитие некультивируемой основной группы микробных агентов.

Проведенная оценка микрофлоры пациентов с ПРС показала широкий диапазон аэробных и анаэробных микроорганизмов, общее количество которых превышает норму, принятую для здоровых людей средней полосы России.

Полученные предварительные результаты исследования позволяют расширить наши представления об этиологии ПРС и свидетельствуют о необходимости дальнейших исследований в данном направлении.

Конфликт интересов отсутствует.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: В.Д.

Сбор и обработка материала: А.М., А.В.

Статистическая обработка данных: В.И.

Написание текста: А.М., В.И.

Редактирование: В.Д., А.В.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо со ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail

Мы используем файлы cооkies для улучшения работы сайта. Оставаясь на нашем сайте, вы соглашаетесь с условиями использования файлов cооkies. Чтобы ознакомиться с нашими Положениями о конфиденциальности и об использовании файлов cookie, нажмите здесь.