Введение

Бесплодие определяется как заболевание репродуктивной системы, характеризующееся невозможностью забеременеть после одного года регулярных незащищенных половых контактов. Во всем мире распространенность бесплодия у пар составляет примерно 15%. Почти в 50% случаев причиной бесплодия являются мужские факторы, в частности аномальные параметры спермы [1, 2].

Мужское бесплодие может быть вызвано рядом факторов, включая нездоровый образ жизни, инфекционные патогены, генетические особенности, эндокринные расстройства и сексуальные дисфункции. Распространенные отклонения в параметрах эякулята включают олигозооспермию (низкое количество сперматозоидов), астенозооспермию (сниженную подвижность сперматозоидов), тератозооспермию (аномальную форму сперматозоидов), олигоастенотератозооспермию (ОАТ-синдром, сочетание предыдущих трех состояний), криптозооспермию (единичные сперматозоиды в эякуляте) и азооспермию (отсутствие сператозоидов). Эти состояния представляют собой наиболее частые проблемы мужского бесплодия [1, 3, 4].

Объем и состав семенной плазмы (СП) имеют немаловажное значение в процессе оплодотворения. Наличие инфильтрированных лейкоцитов в семенной плазме может указывать на воспаление или скрытую инфекцию [5, 6]. Кроме того, наличие в эякуляте эритроцитов, отсутствующих в нормальных условиях, может указывать на серьезные патологические процессы в половом тракте мужчины [7]. Превышение порога концентрации иммуноглобулинов IgA и IgG может привести к снижению подвижности сперматозоидов и является иммунным фактором бесплодия [8].

Следует отметить, что многие из основных причин мужского бесплодия можно предотвратить и вылечить. Использование вспомогательных репродуктивных технологий значительно улучшило перспективы бесплодных пар зачать детей. Однако распространенность и понимание бесплодия различаются во всем мире. Обширные исследования бесплодия проводились в различных регионах, включая США [9], несколько стран Европы [10, 11], Азию [12—14], Австралию [15] и другие регионы, что подчеркивает разнообразный характер исследований бесплодия во всем мире. Центрально-Азиатский регион, включая Республику Казахстан, Киргизскую Республику, Республику Узбекистан, Туркменистан и Республику Таджикистан [16], меньше представлен в глобальных исследованиях фертильности. Каждая страна ведет официальную статистику по демографическим параметрам, включая диагностику и лечение бесплодия, но эти данные часто не включаются в научные базы данных. В Республике Казахстан и Республике Узбекистан средняя доля бесплодных пар составляет 15—17%, причем мужской фактор обнаруживается в 40—50% этих случаев [17, 18]. Надежная информация об общей статистике бесплодия в Республике Таджикистан, Киргизской Республике и Туркменистане ограниченна, недоступна или отсутствует. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), Азиатский регион представлен только данными из КНР (выборка из 1200 пациентов) и Ирана (выборка из 168 пациентов) [19].

Понимание состояния мужского бесплодия в разных регионах имеет решающее значение для сохранения репродуктивного здоровья народонаселения, поскольку многие заболевания и состояния имеют региональные эпидемиологические различия [20]. Поэтому сбор данных о состоянии эякулята из разных географических районов имеет большое значение.

Цель исследования — выполнить анализ показателей изолированного мужского фактора бесплодия в странах Центральной Азии на примере Казахстана и Узбекистана.

Материал и методы

Исследование популяции

Нами проанализирован эякулят 957 пациентов, собранный в Городском центре репродукции человека (г. Алматы, Республика Казахстан) и в коммерческой клинике репродукции человека «Miracle IVF» (г. Ташкент, Республика Узбекистан) в период с 01.01.2019 по 27.04.2022. Все пациенты были в возрасте от 18 до 64 лет и планировали иметь детей. В выборку вошли мужчины, партнерши которых прекратили использовать контрацепцию и не беременели в течение как минимум 12 мес.

Исследование выполнено в соответствии со стандартами надлежащей клинической практики и принципами Хельсинкской декларации, а также в соответствии с местными и международными этическими стандартами биомедицинских исследований. Перед сдачей эякулята пациенты подписывали информированное добровольное согласие на сбор и обработку персональных данных.

Макроскопическая оценка

Анализ спермы начинался через 30—60 мин после сбора путем изучения ее разжижения в контролируемой среде. Участникам было поручено воздержаться от половой активности в течение 3—7 дней. Объем измеряли с помощью калиброванной пипетки, вязкость — путем наблюдения за длиной нити спермы, а pH — с помощью бумажных индикаторов. Все лабораторные процедуры выполняли в соответствии с 5-м изданием ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека и стандартами надлежащей лабораторной практики (GLP) [19].

Цитологический анализ

Количество сперматозоидов и лейкоцитов, а также подвижность в образцах спермы оценивали с помощью камеры Маклера. После разжижения при комнатной температуре в течение 30—60 мин и тщательного перемешивания образец спермы объемом 5—10 мкл исследовали под увеличением 200 крат. Концентрацию сперматозоидов определяли путем подсчета в 10 или 100 квадратах счетной сетки, что соответствует концентрациям 1 млн/мл и 0,1 млн/мл соответственно. Подвижность сперматозоидов классифицировали на 3 категории: прогрессивные, непрогрессивные и неподвижные сперматозоиды. Анализировали минимум 200 сперматозоидов на пациента с дублированием или утроением процедуры для точности в тех случаях, когда концентрация сперматозоидов позволяла это сделать.

Для оценки морфологии сперму окрашивали на предварительно окрашенных предметных стеклах метиленовым синим и крезиловым фиолетовым, затем исследовали под микроскопом при различных увеличениях. Агглютинацию, агрегацию и морфологию оценивали согласно строгим критериям Крюгера [19, 20].

Смешанная антиглобулиновая реакция (MAR-тест)

Эта процедура, рекомендованная ВОЗ, включает использование латексных частиц, покрытых человеческим иммуноглобулином G (IgG), для оценки связывания сперматозоидов. Сначала образцы спермы центрифугировали и разжижали. Затем в камере Маклера готовили смесь из 5 мкл спермы, латексных частиц и антисыворотки IgG, накрывали покровным стеклом. Смесь инкубировали в течение 3 мин и исследовали под световым микроскопом при 200-кратном увеличении. Количество подвижных сперматозоидов, прикрепленных к латексным частицам, подсчитывали как через 3 мин, так и через 10 мин после начала реакции. Положительный результат MAR(+) фиксировали, если не менее 50% сперматозоидов реагировали с антителами [19, 21, 22].

Электронная микроскопия

Для проведения трансмиссионной электронной микроскопии нативную сперму разбавляли изотоническим раствором NaCl в соотношении 1:10 и смешивали с 0,1 мл 2,5% раствора глутаральдегида в 0,1 М какодилатном буфере (pH 7,2). Смесь центрифугировали при 1500 об/мин в течение 15 мин. После удаления супернатанта осадок фиксировали тем же фиксатором, далее фиксировали 1% раствором осмиевой кислоты и заливали в эпоксидную смолу. Ультратонкие срезы готовили с помощью микротома UltraCut III, окрашивали водными растворами уранилацетата и цитрата свинца и исследовали под электронным микроскопом JEM-1011, оснащенным камерой Orius SC1000 W [23]. Общую структуру сперматозоидов изучали при увеличении 4000 крат, фокусируясь на акросомах, ядерном хроматине и митохондриях при увеличении 25 000 крат, а аномалии аксонем в поперечных сечениях жгутиков — при том же увеличении. В каждом образце анализировали не менее 150 сперматозоидов.

Статистический анализ

Полученные данные собраны в электронных таблицах Microsoft Excel, а результаты представлены в таблицах, рисунках и диаграммах. Статистический анализ проведен с помощью программы R.

Результаты и обсуждение

В Республике Казахстан пациенты были из Актау, Алматы, Атырау, Караганды, Тараза, Талдыкоргана, Уральска, Семея и Шымкента, в Республике Узбекистан — из Ташкента, Чирчика, Намангана, Бухары, Джизака, Андижана, Самарканда и Ферганы. Репрезентативны территориальный, возрастной и этнический составы обследуемых. Большинство обращений пришлось на мужчин в возрасте от 26 до 38 лет. Примечательно, что наблюдалось постепенное увеличение количества исследуемых, достигающего пика у пациентов в возрасте до 29 лет. После 39 лет отмечено постепенное снижение количества исследуемых. Следует отметить, что 6 человек в исследовании не предоставили данные о своем возрасте.

На рис. 1 на цв. влейке представлены доли лиц с нормальными и аномальными параметрами спермы. Наименее распространенными отклонениями были агглютинация (3,66%), наличие эритроцитов в семенной жидкости (2,72%) и положительные результаты теста MAR (2,93% всех обследованных пациентов). Напротив, наиболее распространенная аномалия обнаружена в категории прогрессивно подвижных сперматозоидов, затрагивая 38,56% пациентов. Кроме того, следует отметить, что тест MAR не рекомендован андрологами для 69,07% обследованных лиц.

Рис. 1. Распределение пациентов в соответствии с параметрами спермограмм.

В табл. 1 представлены средние значения параметров спермограммы для всех пациентов, как с патологическими, так и с нормальными параметрами.

Таблица 1. Показатели спермограммы

Данные показывают, что у пациентов с отклонениями от референсных значений среднее количество сперматозоидов было почти в 1,5 раза ниже нормы. Концентрация сперматозоидов была в 2 раза ниже, а общее количество сперматозоидов в эякуляте в 3 раза ниже нормы. Общая подвижность снизилась в 2,7 раза, а количество прогрессивно подвижных сперматозоидов было в 1,8 раза меньше. Количество морфологически нормальных форм было в 2,4 раза ниже нормы, вязкость — в 2,5 раза выше нормы, а количество лейкоцитов — в 3,1 раза выше нормы.

Это сравнение выявляет существенные различия в параметрах спермы у пациентов с нормальными и патологическими результатами, подчеркивая влияние этих нарушений на мужскую фертильность.

Корреляции между возрастом мужчины и различными параметрами спермы можно увидеть на рис. 2 на цв. влейке. Сравнительные диаграммы «ящик с усами» иллюстрируют основные параметры спермы (как нормальные, так и патологические) в зависимости от возраста пациентов. Усы на этих графиках представляют собой минимальные и максимальные значения, наблюдаемые в каждом ящике, в то время как медиана обозначена горизонтальной линией внутри ящиков. Выбросы — это значения, которые выходят за пределы типичного диапазона. Значимость этих результатов обозначена p-значением <0,05.

Рис. 2. Возрастные тенденции средних параметров спермограмм участников исследования.

В ходе исследования выявлено 36 различных типов патологии в параметрах спермограммы, и выводы сделаны в соответствии с референсными значениями ВОЗ.

Нормозооспермия обнаружена у 451 мужчины, что составляет 47,1% от всех обследованных, астенозооспермия — у 153 (16%) мужчин, лейкоцитоспермия (4,4 млн лейкоцитов на 1 мл спермы) — у 44 (4,6%) пациентов. Олигозооспермия, характеризующаяся снижением концентрации подвижных сперматозоидов (9,2·10⁶ клеток/мл), обнаружена у 37 (3,87%) человек. Олигоастенотератозооспермия наблюдалась у 33 (3,45%) человек. Кроме того, олигоспермия и олигоастенозооспермия обнаружены у 31 (3,24%)и 30 (3,13%) человек соответственно, азооспермия — у 29 (3,03%), а криптозооспермия — у 24 (2,51%). Астенотератозооспермия выявлена у 23 (2,4%) человек, в то время как астенозооспермия в сочетании с лейкоцитоспермией — у 17 (1,78%). Другие виды патологии в совокупности составили 9% случаев, причем каждое конкретное состояние — менее 1%. Подробная статистика распространенности различных аномалий эякулята у лиц в бесплодном браке проливает свет на проблему мужского бесплодия в регионе и может служить источником информации как для урологов-андрологов, так и для репродуктологов, врачей смежных специальностей и исследователей.

В табл. 2 приведены показатели нарушений вязкости, агрегации, агглютинации и иммунологических тестов в зависимости от типа экспертного мнения.

Таблица 2. Зависимость показателей вязкости, агглютинации, агрегации и MAR-теста от типа диагноза

Значения показателей неравномерно распределены между группами, что указывает на отсутствие корреляции с типом заключения.

Мы также использовали классические гистологические методы и электронную трансмиссионную микроскопию для визуализации сперматозоидов (рис. 3 на цв. влейке). Во многих странах, в том числе входящих в Евразийский экономический союз (ЕАЭС), панели для выявления генетически обусловленных нарушений морфологии и подвижности сперматозоидов не являются коммерчески доступными. В результате может быть оправданным использование электронно-микроскопического исследования спермы, в том числе при выявлении генетически детерминированных отклонений морфологии сперматозоидов. Этот подход может обеспечить более полное понимание типов аномалий. На рис. 3 на цв. влейке проиллюстрированы различия между нормальными и аномальными сперматозоидами.

Рис. 3. Микроскопия сперматозоидов.

I — поперечное сечение жгутика сперматозоида у пациента с астенозооспермией. Аномальное расположение аксонемных микротрубочек. Девятая пара микротрубочек смещена к центру аксонемы, определяются два дополнительных дуплета и дополнительная одиночная микротрубочка (белая стрелка), фиброзная оболочка жгутика (красная стрелка), аксонемные дуплеты (желтая стрелка); II — нормальный сперматозоид; III — A — нормальный сперматозоид, B — аномальный хвост, C — аномальная головка.

Выводы

Описанные параметры фертильности 957 мужчин из Республики Казахстан и Республики Узбекистан могут пролить свет на текущее состояние проблемы в регионе Центральной Азии. Большинство людей вступают в брак и планируют детей в возрасте 30—39 лет, соответственно, большинство отклонений (всего 55,2%) выявляются именно в этот период жизни. Около 20% пациентов были в возрасте 40—49 лет, что может быть связано с повторными неудачными попытками зачатия. Интересно, что даже у молодых мужчин в возрасте 20—29 лет (18,1% от общего числа) также наблюдаются проблемы с фертильностью. Вероятно, это может быть связано с генетическими особенностями, инфекционными заболеваниями, травмами, заболеваниями, передающимися половым путем, и вредными привычками.

Средние значения основных показателей фертильности мужчин из стран Центральной Азии с нормозооспермией существенно (в несколько раз) отличаются от минимальных референсных значений, рекомендуемых Всемирной организацией здравоохранения. Это означает, что средневзвешенный репродуктивный потенциал мужчин из стран Центральной Азии с нормозооспермией высок и преобладающий вклад в бесплодный брак следует диагностировать в области женских факторов бесплодия. Нормозооспермия выявлена у 451 мужчины, что составляет 47,1% от всех обследованных мужчин, живущих в бесплодном браке. Это свидетельствует о том, что доля изолированного мужского фактора в бесплодном браке может достигать 52,9%.

Мы обращаем внимание на то, что отклонения в характеристике эякулята могут носить временный характер и при субфертильных показателях эякулята может наступать беременность у половых партнерш. Заключение о нормозооспермии не всегда отражает реальную оплодотворяющую способность эякулята. Так, например, высокая степень вязкости спермы никак не отражалась в заключении эксперта, вместе с тем от вязкости эякулята зависит то, насколько эффективно сперматозоиды мигрируют в половой тракт женщины.

Диагностированы как распространенные, так и сложные виды патологии, сочетающие 2 или 3 типа отклонений эякулята. Примечательно, что только у 9,46% мужчин, которым рекомендовано проведение MAR-теста, выявлена патология, связанная с превышением уровня MAR. Это свидетельствует о том, что в популяции бесплодных мужчин Центральной Азии проблема иммунного фактора не стоит слишком остро. Уровень MAR IgG в исследуемой популяции даже несколько ниже общеизвестного уровня 10%. В работе описаны данные однократно выполненных спермограмм без контроля их динамики после лечения. Являясь одномоментным срезом состояния фертильности эякулята, а не отчетом о стойкой норме или патологии эякулята, данная методология имеет свои преимущества и ограничения.

В связи с полученными результатами предлагаем следующие пути решения проблемы мужского бесплодия в регионе:

1. Скрининг молодых мужчин в добрачном возрасте 18—20 лет для выявления нарушений сперматогенеза (спермограмма, исследование морфологии сперматозоидов по Крюгеру, MAR-тест).

2. Регулярное (не реже одного раза в год) урологическое обследование детей и подростков с целью выявления крипторхизма, варикоцеле и других заболеваний органов малого таза.

3. Повышение доступности вспомогательных репродуктивных технологий на национальном уровне (только в Республике Казахстане медицинская страховка покрывает процедуры вспомогательных репродуктивных технологий).

4. Половое воспитание подростков для профилактики заболеваний, передающихся половым путем (носит несистемный характер в Центральной Азии).

5. Доступность бесплатной криоконсервации спермы перед химиотерапией и радиотерапией (в регионе Центральной Азии это не покрывается медицинским страхованием или государственным бюджетом).

Данные этого исследования могут быть использованы местными органами здравоохранения, Всемирной организацией здравоохранения и Европейским обществом репродукции человека и эмбриологии для начала решения проблем, связанных с мужским бесплодием в Центрально-Азиатском регионе.

Нет необходимости подчеркивать, что в дальнейшем нужны значительные усилия для освещения проблемы. Одним из способов продолжения исследования может быть изучение эякулята партнеров женщин, которые недавно поставлены на учет по беременности (срок приблизительно 10—12 нед). Это позволит с большей уверенностью принимать решение о том, какой эякулят можно считать фертильным, и определять более точные региональные особенности репродуктивного потенциала мужчин.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Задубенко Д.В., Айташева З.Г., Голиченков В.А., Локшин В.Н.

Сбор и обработка материала — Задубенко Д.В., Пак М.И., Султанова Д.Н.

Статистическая обработка — Задубенко Д.В., Туфуминова Я.С., Лебедева Л.П.

Написание текста — Задубенко Д.В., Туфуминова Я.С., Лебедева Л.П.

Редактирование — Задубенко Д.В., Туфуминова Я.С., Айташева З.Г., Голиченков В.А., Локшин В.Н., Лебедева Л.П.

Финансирование. Данное исследование финансировалось Комитетом по науке Министерства образования и науки Республики Казахстан в рамках подготовки доктора философии Д.В. Задубенко.

Благодарности. Мы благодарим И. Киселева (Университет Виннипега, Канада) за консультацию о применении программы R. Благодарим также профессора Е.Е. Брагину (ФГБНУ «Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова» Минобрнауки России, Москва, Россия) за помощь в проведении электронной микроскопии.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.