Введение

Частота выявления самопроизвольного выкидыша, привычного невынашивания беременности, а также более низкая частота оплодотворения гамет и меньшее количество эмбрионов оптимального качества чаще определяются у женщин с тиреоидитом Хашимото (ТХ), чем у женщин в состоянии эутиреоза [1—6]. Считается, что ТХ является наиболее часто встречающимся аутоиммунным недугом женщин в репродуктивном возрасте [7]. Антителами, непосредственно отражающими процесс аутоиммунной деструкции щитовидной железы и ассоциированными с клиническим гипотиреозом, являются антитела к микросомальной тиреоидной пероксидазе (АТ-ТПО) и к тиреоглобулину (АТ-ТГ) [8]. Тем не менее заместительная терапия гормонами щитовидной железы, по-видимому, не оказывает протективного эффекта в отношении женской фертильности. Женщины с хорошо контролируемыми уровнями гормонов щитовидной железы в сыворотке крови по-прежнему характеризуются низкой фертильностью [9]. Таким образом, взаимосвязь ТХ с субфертильностью или бесплодием может быть обусловлена не только гипотиреозом.

По всей видимости, фолликулярная жидкость (ФЖ) и аутоантитела играют ведующую роль во взаимосвязи между ТХ и женским бесплодием. В самом раннем исследовании с предложением данной теории продемонстрировано наличие антитиреоидных антител в ФЖ, причем более высокие уровни антител определялись у женщин с ТХ [1]. Впоследствии проводились и другие работы по изучению взаимосвязи женской фертильности и наличия антитиреоидных антител в ФЖ [4, 10]. В указанных работах у женщин с ТХ помимо повышенного уровня аутоантител в ФЖ определялись более низкие показатели оплодотворения ооцитов, меньшее количество эмбрионов категории A, более низкие показатели клинической беременности и повышенный риск самопроизвольного прерывания беременности в раннем сроке по сравнению с общей популяцией [1, 4].

Известно, что ФЖ образуется путем смешивания продуктов, выделяемых гранулезными клетками и тека-клетками, с экссудатом, полученным из крови [11], и имеет отличающийся от сыворотки крови состав [12]. В ФЖ содержатся метаболиты, способствующие созреванию ооцита во время роста фолликула. В ее составе определяются аминокислоты, липиды, нуклеотиды и другие эссенциальные для компетенции ооцита кофакторы, такие как гормоны, цитокины, факторы роста, белки [13, 14]. Несмотря на известный факт наличия высоких концентраций антитиреоидных аутоантител в ФЖ у женщин с ТХ, до сих пор неизвестно, насколько эти факторы могут влиять на фертильность. Обнаружено также изменение экспрессии 49 белковых молекул в ФЖ женщин с ТХ относительно пациенток контрольной группы [15]. Данный факт может свидетельствовать об изменении состава ФЖ женщин с ТХ.

Цель исследования — определить содержание антитиреоидных антител в фолликулярной жидкости женщин с тиреоидитом Хашимото, получающих лечение методами вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), и разработать модель прогнозирования клинической беременности, позволяющую повысить клиническую эффективность программ по лечению бесплодия у пациенток данной когорты.

Материал и методы

Проспективное когортное сравнительное исследование проведено в период с 2018 по 2020 г. и включает данные о 90 циклах ВРТ.

Критерии включения в исследование: женщины в возрасте 20—40 лет с сохранным овариальным резервом в состоянии клинического эутиреоза; подтвержденный диагноз бесплодия с показаниями к лечению методами экстракорпорального оплодотворения (ЭКО)/ЭКО-интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ) [16].

Пациентки с индексом массы тела (ИМТ) >35 кг/м², с эндокринными заболеваниями, отличными от ТХ, а также с наличием противопоказаний к проведению ЭКО в исследование не включались [16]. Основную группу составили 45 женщин с бесплодием, подтвержденным диагнозом тиреоидита Хашимото и определяемыми значениями АТ-ТПО и АТ-ТГ в сыворотке крови более 30 МЕ/мл, группу сравнения — 45 женщин с бесплодием без аутоиммунного поражения щитовидной железы.

Контролируемая овариальная стимуляция проводилась со 2-го или 3-го дня менструального цикла в «гибком» протоколе с использованием антагонистов гонадотропин-рилизинг-гормона. На старте определяли количество антральных фолликулов в каждом яичнике с помощью трансвагинального ультразвукового исследования. При достижении тремя фолликулами диаметра >17 мм вводили триггер финального созревания ооцитов с последующей пункцией фолликулов через 36 ч. Оценку качества эмбрионов проводили по классификации Гарднера [17].

После переноса эмбриона в полость матки у женщин с положительным тестом на хорионический гонадотропин человека наступление клинической беременности подтверждалось на основании результата ультразвуковой диагностики по факту наличия плодного яйца в полости матки и сердцебиения плода [16].

Получение ФЖ осуществляли при аспирации в день трансвагинальной пункции фолликулов. Для анализа использовали только образцы, не содержащие примеси крови. После выделения ооцита ФЖ центрифугировали при 1000 g (g — единица относительного центробежного ускорения, гравитационная постоянная, равная 980 м/с²) при комнатной температуре в течение 15 мин. Аликвотированные образцы ФЖ отбирали в стерильные промаркированные пробирки Eppendorf в объеме 0,5—0,6 мл и хранили при температуре –80°C до проведения измерений. В день проведения анализа ФЖ все образцы размораживали при комнатной температуре [6, 16].

Для количественного определения содержания аутоантител к ТПО и ТГ класса IgG в ФЖ применяли метод иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием коммерческих иммуноферментных наборов (E01T0531, E01T0767; BlueGene Biotech, КНР). В состав каждого набора входит 96-луночных полистироловых планшетов. Процедура количественного измерения аутоантител проводилась в соответствии с прилагаемыми инструкциями производителей наборов [16].

Проверку данных на нормальность распределения проводили с помощью критерия Шапиро—Уилка. Однородность дисперсий оценивали с помощью критерия Левена. Переменные с ненормальным распределением представлены как медиана (Me), нижний и верхний квартили — LQ и UQ. Для расчета межгрупповых различий использовали критерий Манна—Уитни. С целью сравнения качественных результатов применяли критерий χ², при малых выборках критерий рассчитывали с поправкой Йейтса или с точечным критерием Фишера. С помощью многофакторного анализа полученных данных разработана математическая модель прогноза беременности в «свежих» циклах ЭКО у пациенток с ТХ [16].

Результаты

Полученные нами данные подробно освещены в ранней публикации [18]. Согласно результатам, женщины обеих групп не различались по таким показателям, как возраст, ИМТ, возраст менархе, регулярность менструального цикла, его количественные характеристики, длительность и причины бесплодия. Гормональный статус женщин, включенных в исследование, также не различался, включая показатели функции щитовидной железы. У женщин основной группы средние уровни АТ-ТПО в сыворотке крови составили 481,8 (269,0; 723,2) МЕ/мл, к АТ-ТГ — 44,0 (15,7; 62,5) МЕ/мл. У женщин группы сравнения значения АТ-ТПО в сыворотке крови были равны 2,7 (1,0; 8,6) МЕ/мл, уровни АТ-ТГ не определялись [16]. При количественном определении исследуемых антител в ФЖ средние значения АТ-ТПО у женщин основной группы составили 199,8 (85,9; 298) МЕ/мл, АТ-ТГ — 10,0 (8,6; 15,5) МЕ/мл [18].

У женщин основной группы относительно женщин группы сравнения отмечены более низкие значения антимюллерова гормона (соответственно 1,7 (1,4; 3,5) и 3,6 (2,2; 6,3), p=0,0007) и меньшее количество антральных фолликулов (соответственно 8 (6; 10) и 11 (9; 17), p=0,00007).

При оценке эмбриологического этапа программ ВРТ нами отмечено статистически значимое снижение количества зрелых ооцитов, двупронуклеарных зигот и эмбрионов оптимального качества на 5-е сутки культивирования у женщин основной группы относительно женщин группы сравнения [16]. Анализ результативности программ ВРТ у пациенток обеих групп показал более низкую частоту наступления клинической беременности на начатый цикл в основной группе женщин относительно группы сравнения (соответственно 24,4% и 51,1%, p=0,009) [16].

При многофакторном анализе полученных данных разработана математическая модель прогноза беременности в циклах ЭКО у пациенток с носительством антитиреоидных антител. Принимая в расчет полученные данные, вероятность беременности в программах ВРТ рассчитывали по формуле:

β=1,723×O+1,034×G+1,285×F+1,691×E–4,916,

где p — вероятность беременности в цикле; O=1 при концентрация АТ-ТПО в ФЖ ≤258 МЕ/мл; O=0 при концентрация АТ-ТПО в ФЖ >258 МЕ/мл; G=1 при концентрация АТ-ТГ в ФЖ ≤155 МЕ/мл; G=0 при концентрация АТ-ТГ в ФЖ >155 МЕ/мл; F=1 при количестве антральных фолликулов (КАФ) ≥9; F=0 при КАФ <9; E=1 при наличии эмбриона оптимального качества; E=0 при отсутствии эмбриона оптимального качества.

В дальнейшем нами разработан более простой и удобный способ прогнозирования беременности в программах ВРТ у пациенток — носительниц антитиреоидных антител. Использовав статистический пакет RStudio 1.3.1093 2009-2020 PBC с применением логистической регрессии, ROC-анализа и показателя отношения шансов, мы разработали шкалу прогноза клинической беременности в циклах ЭКО у пациенток данной когорты (таблица).

Предиктивные факторы в отношении наступления беременности в циклах вспомогательных репродуктивных технологий у пациенток с тиреоидитом Хашимото и носительством антитиреоидных антител

Примечание. АТ-ТПО — антитела к микросомальной тиреоидной пероксидазе; АТ-ТГ — антитела к тиреоглобулину; ФЖ — фолликулярная жидкость; КАФ — количество антральных фолликулов.

Указанный способ имеет следующее применение: при уровнях в ФЖ АТ-ТГ ≤155 МЕ/мл — 2 балла, АТ-ТПО ≤258 МЕ/мл — 3 балла, КАФ ≥9 — 2 балла и наличии эмбриона оптимального качества, характеризующегося стадией развития бластоцисты ≥3 (внутриклеточная масса типа AA, AB, BA, BB) и трофэктодермой типа AA, AB, BA, BB, — 3 балла можно рассчитать наступление беременности в циклах ВРТ у пациенток с бесплодием и носительством антитиреоидных антител: AUC=0,83; чувствительность 82% и специфичность 77% (рисунок).

ROC-кривая прогноза беременности в циклах вспомогательных репродуктивных технологий у пациенток с тиреоидитом Хашимото и носительством антитиреоидных антител.

Выбранный подход является доступным, относительно простым для выполнения и интерпретации результатов и, что немаловажно, обладает высокой чувствительностью и специфичностью, помогает избегать безрезультатного переноса эмбриона, способствует преодолению бесплодия в циклах ВРТ у пациенток с ТХ и носительством антител к ткани щитовидной железы.

Обсуждение

Данные, представленные в литературе, последовательно свидетельствуют о снижении частоты имплантации и увеличении частоты ранних потерь беременности у женщин с аутоиммунным ТХ относительно женщин групп контроля в программах ВРТ [18, 19]. Результаты нашего исследования согласуются с данными более ранних работ и демонстрируют меньшую вероятность наступления беременности у женщин с аутоиммунным тиреоидитом. Полученные нами результаты эмбриологического этапа свидетельствуют о статистически значимом снижении количества зрелых ооцитов, двупронуклеарных зигот и эмбрионов оптимального качества на 5-е сутки культивирования у женщин основной группы с ТХ. Однако основным ограничением нашего исследования является относительно небольшая выборка.

Ряд авторов рассматривают субклинический гипотиреоз как возможную причину снижения фертильности и неудач программ ЭКО у женщин с аутоиммунным поражением щитовидной железы [20—23]. Однако, согласно нашим результатам, данное предположение кажется маловероятным, так как на момент начала контролируемой овариальной стимуляции все включенные в исследование пациентки находились в состоянии клинического эутиреоза, что объясняется заместительной гормональной терапией левотироксином у женщин с ТХ. Исходя из этого, мы предполагаем, что причина неудач может быть в другом.

В настоящем исследовании подтверждено наличие аутоантител к ткани щитовидной железы в ФЖ женщин с ТХ, получающих лечение методами ВРТ, и проведена оценка их влияния на достижение беременности. Насколько нам известно, это первое исследование, в котором предложена разработка математической модели прогнозирования беременности на основании исходных параметров овариальной стимуляции, эмбриологических показателей, а также уровней антитиреоидных антител в ФЖ в программах ЭКО. Уровни АТ-ТПО и АТ-ТГ в ФЖ, полученной в день трансвагинальной пункции фолликулов, были практически в 2 раза ниже определяемых в сыворотке крови. Более того, согласно нашим ранним данным, выявлена статистически значимая положительная корреляционная зависимость между уровнями антитиреоидных антител в сыворотке крови и в ФЖ.

Известно, что рост вторичного фолликула сопровождается развитием перифолликулярной сети кровеносных сосудов [24], способствующей доставке необходимых растущему фолликулу питательных веществ и факторов роста. Вероятно, именно в этот период происходит свободный пассаж АТ-ТГ и АТ-ТПО через гематофолликулярный барьер, что объясняет выраженную корреляцию уровней антител в сыворотке крови и в ФЖ. Считается, что антитиреоидные антитела обладают опосредованной цитотоксичностью в отношении созревающего ооцита и снижают его качество, а также потенциал к развитию [1]. Полученные нами результаты согласуются с данной теорией, что находит отражение в снижении частоты оплодотворения ооцитов и количества эмбрионов оптимального качества к 5-му дню культивирования. В экспериментальном исследовании наличие антитиреоидных антител на поверхности преимплантационного эмбриона описано еще в 2000-х годах [25]. Сообщается о распознавании тиреоидных антигенов человеческими антителами против блестящей оболочки ооцита. По-видимому, zona pellucida ооцита и ткань щитовидной железы имеют схожее антигенное строение, что позволяет предположительно считать zona pellucida мишенью для антитиреоидных антител. Внеклеточный матрикс ооцита имеет большое значение во взаимодействии самого ооцита со сперматозоидом, а также в преимплантационном эмбриогенезе [26]. Таким образом, при условии созревания ооцита в среде с антитиреоидными антителами может иметь место токсическое влияние последних на функциональную роль клетки.

Помимо эмбрионального фактора важнейшая роль в эффективности программ ВРТ принадлежит эндометриальному фактору. R. Rahnama и соавт. выявили экспрессию тиреоидной пероксидазы в женском эндометрии пролиферативной фазы непосредственно на поверхности клеток, выстилающих просвет желез [27].

Так, обследование пролиферативного эндометрия женщин с ТХ выявило лимфоцитарную инфильтрацию в строме и повышение количества лимфоцитов, экспрессирующих CD138⁺, CD56⁺, CD68⁺ клеток. Помимо этого, отмечено усиление апоптоза клеток (Apaf-1) в эпителии и строме эндометрия. Выявлено также трехкратное снижение экспрессии LIF — ключевого цитокина, активно экспрессируемого как бластоцистой, так и эндометрием в период имплантационного окна, что, возможно, объясняет повторные неудачи имплантации у пациенток с аутоиммунным тиреоидитом [28].

Заключение

В настоящем исследовании изучено влияние тиреоидита Хашимото на состав фолликулярной жидкости при женском бесплодии в циклах вспомогательных репродуктивных технологий и разработана математическая модель прогнозирования клинической беременности. Данная модель удобна и проста для использования в рутинной клинической практике, она позволяет применять персонифицированный подход при переносе эмбрионов в «свежих» циклах экстракорпорального оплодотворения с целью их оптимизации.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Сафарян Г.Х., Гзгзян А.М., Беспалова О.Н.

Сбор и обработка материала — Сафарян Г.Х., Комарова Е.М.

Статистический анализ данных — Объедкова К.В.

Написание текста — Сафарян Г.Х., Объедкова К.В.

Редактирование — Гзгзян А.М., Ниаури Д.А., Тапильская Н.И.

Финансирование. ФНИ № 1021062512052-5-3.2.2: Разработка диагностических критериев прогнозирования и преодоления репродуктивных потерь (Задача 18: изучить влияние репродуктивно значимых аутоантител на качество получаемых гамет и эмбрионов, а также на процесс их имплантации у пациентов, проходящих терапию методами BPT).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.