После активного внедрения в практику общест-венного здравоохранения вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) и вспомогательной медикаментозной репродукции проблему бесплодия как фактора ограничения рождаемости можно считать принципиально решенной. Стало возможным забеременеть от мужчины с плохим качеством спермы, взять яйцеклетки у одной женщины, оплодотворить и перенести эмбрионы в матку другой, родить без полового партнера, создать ребенка уже после смерти одного или обоих родителей. Однако невозможно получить генетически родное потомство у женщин без яйцеклеток и у мужчин без сперматозоидов [1, 2].
Поэтому одним из наиболее важных и актуальных аспектов репродуктивной медицины остается вопрос о жизнеспособности и полноценности половой клетки.
Выяснение механизмов, которые лежат в основе возникновения дисфункции и снижения жизнеспособности мужских половых клеток, имеет несомненное теоретическое и практическое значение для андрологии и репродуктивной медицины.
Эякуляторные сперматозоиды в норме должны обладать длительной жизнеспособностью для выполнения ими функции оплодотворения и создания нового организма. Тем не менее у зрелых сперматозоидов можно выявить признаки и маркеры апоптоза — экспрессию Fas-антигена, экстернализацию фосфатидилсерина (ФС), фрагментацию ДНК в сперматозоидах и т.д. [3—5].
По результатам применения метода определения экстернализации ФС на поверхность сперматозоидов («аннексиновый» метод) и метода определения фрагментации ДНК (TUNEL-метод), у мужчин с различными параметрами спермограммы около 20% сперматозоидов в эякуляте имеют признаки апоптоза [6, 7]. Возможно, в большинстве случаев причиной неудачных исходов ВРТ является активация в сперматозоиде этой суицидной программы [8].
Выявлено, что количество гамет с признаками апоптоза зависит от способа выделения сперматозоидов из эякулята (метод отмывания от семенной плазмы, метод всплытия swim-up или метод центрифугирования эякулята в градиенте плотности) [9].
Цель исследования — установить, способны ли сперматозоиды мужчин с разной фертильностью запускать процесс спонтанного и активированного апоптоза после эякуляции, находясь в условиях in vitro.
Материал и методы
Дизайн исследования. Проведенное исследование было экспериментальным, контролируемым, открытым, проспективным и одноцентровым (рис. 1).
Рис. 1. Дизайн исследования.
Критерии соответствия. Все мужчины, участвовавшие в исследовании, не имели заболеваний репродуктивных органов, были сопоставимы по продолжительности проживания в Астраханском регионе.
Условия проведения. Сбор образцов эякулятов осуществлялся в ГБУЗ АО «Центр охраны здоровья семьи и репродукции». Перед сдачей спермы мужчины предупреждены о необходимости сексуального воздержания в течение 72 ч, отказа от тепловых процедур, приема антибиотиков и алкоголя.
Продолжительность исследования. Продолжительность периода включения пациентов в исследование и проведения исследования составила 2018—2019 гг.
Описание медицинского вмешательства. Для оценки мужской фертильности выполнен традиционный анализ спермы (спермограмма) согласно рекомендациям ВОЗ [10].
Сперматозоиды отмывали от семенной плазмы при pH=7,4 [9]. Одну часть клеточной взвеси отбирали и исследовали, вторую часть взвеси инкубировали в среде Menezo B-2 (BioMerieux, Франция) с 5% CO2 при 37 °C в течение 4 и 24 ч [11]. Гаметы из третьей части взвеси инкубировали в течение 2 и 4 ч с 200 мкМ перекиси водорода (H2O2).
Основной исход исследования. Проводили подсчет неподвижных гамет во всех образцах, оценивали жизнеспособность и апоптоз свежевыделенных гамет (без инкубации), спонтанный апоптоз сперматозоидов после инкубации в течение 4 и 24 ч, проводили оценку активированного апоптоза после воздействия H2O2.
Анализ в группах. В зависимости от основных показателей спермограммы (концентрации, подвижности, жизнеспособности и морфологии сперматозоидов) мужчин разделили на: фертильных (n=40), эякуляты которых соответствовали нормативным показателям, возраст мужчин составил от 22 до 38 лет, они состояли в браке и имели детей не старше 3 лет; бесплодных (n=78), в возрасте от 25 до 48 лет, эякуляты которых в разной степени имели отклонения от показателей нормы, они состояли в бесплодном браке от 0,5 до 15 лет.
Методы регистрации исходов. Оценку жизнеспособности гамет проводили при помощи световой микроскопии после окрашивания гамет эозином (ЭО) по Bloom [10, 12]. Количество (%) неокрашенных сперматозоидов считали как жизнеспособные клетки.
Оценку апоптоза свежевыделенных гамет, спонтанного и активированного апоптоза проводили «аннексиновым» методом, выявляя экстернализацию ФС на поверхность мембраны сперматозоида: гаметы окрашивали Аннексином-V, меченым флуоресцеином (AnV-FITC) и пропидия иодидом (PI) (Boehringer Mannheim, Германия) с последующим применением флуоресцентной микроскопии [5, 13]. Неокрашенные (AnV–/PI–)-сперматозоиды считали жизнеспособными. (AnV+/PI–)-клетки, окрашенные только AnV-FITC, считали как вступившие в ранний апоптоз. (AnV+/PI+)-клетки, окрашенные AnV-FITC и PI, а также (AnV–/PI+)-клетки, окрашенные только PI, рассматривали как нежизнеспособные сперматозоиды [11].
Этическая экспертиза. Исследование выполнено в соответствии со стандартами «Надлежащей клинической практики» (Good Clinical Practice) и принципами Хельсинкской декларации. Протокол исследования одобрен Этическим комитетом ГБУЗ АО «Центр охраны здоровья семьи и репродукции» (№22 от 21.02.20). До включения в исследование от всех мужчин, сдавших сперму, получено письменное информированное согласие на проведение исследований.
Статистический анализ. Различия в процентном отношении между окрашенными ЭО, PI и AnV-FITC сперматозоидами оценивали с помощью t-критерия Стьюдента при значении p<0,05, используя статистическую обработку данных с применением программ Statistica 6.1 for Windows (Stat Soft Inc.) и Exсel-2007. Для каждой серии данных вычисляли среднее арифметическое (M) и ошибку среднего (m), представляя данные в виде M±m. Проверку взаимосвязи между исследуемыми параметрами осуществляли путем расчета коэффициента корреляции (r) Пирсона.
Результаты
Процентное содержание неподвижных гамет статистически значимо увеличилось только после инкубации отмытых от семенной плазмы сперматозоидов фертильных мужчин в течение 24 ч при 37 °C в условиях in vitro (табл. 1).
Таблица 1. Содержание неподвижных, нежизнеспособных и (AnV+/PI–)-апоптотических сперматозоидов в эякулятах фертильных мужчин после разной продолжительности инкубации in vitro
| Продолжительность инкубации, ч | Содержание сперматозоидов, % | ||||
| неподвижных | нежизнеспособных | апоптотических | |||
| ЭО-положительных | PI- положительных AnV+/PI+ и AnV–/PI+ | AnV+/PI+ | AnV+/PI– | ||
| 0 | 37,0±2,6 | 35,0±3,0 | 21,0±3,0* (p<0,01) | 5,9±0,7 | 10,3±0,5 |
| 4 | 41,0±3,6 | 36,8±3,1 | 28,1±2,6* (p<0,05) | 6,3±1,4 | 9,0±0,6 |
| 24 | 52,3±4,0# (p<0,01) | 44,4±2,0# (p<0,05) | 34,5±2,4* # (p<0,05) | 7,4±2,6 | 8,8±0,9 |
Примечание. * — статистически значимо по сравнению с ЭО-положительными; # — статистически значимо по сравнению со свежевыделенными сперматозоидами (0 ч инкубации).
Доля нежизнеспособных (мертвых) сперматозоидов, окрашенных как ЭО, так и PI, также статистически значимо увеличивалась после инкубации в течение 24 ч. Сравнение результатов окрашивания ЭО и PI свежевыделенных гамет и гамет после инкубации в течение 24 часов показало, что количество сперматозоидов фертильных мужчин, окрашенных ЭО, было выше количества сперматозоидов, окрашенных PI. Определение жизнеспособности гамет методами световой микроскопии с окраской клеток ЭО и флуоресцентной микроскопии с окраской PI представлены на рис. 2.
Рис. 2. Окраска сперматозоидов человека на определение жизнеспособности.
а — окраска по Bloom эозином (ЭО). Мертвые гаметы окрасились в красно-оранжевый цвет, живые гаметы не окрасились (живой сперматозоид указан стрелкой), иммерсия, ×100; б — окраска йодидом пропидия (PI). Гаметы оценены в свете люминесценции (темная область) и в проходящем свете (светлая область). Головки мертвых гамет окрасились PI (красная флуоресценция), иммерсия, ×100.
Оценка апоптоза среди свежевыделенных сперматозоидов фертильных мужчин показала, что общее количество сперматозоидов с признаками экстернализации ФС, визуализированное по связыванию с Аннексином-V, составило в среднем 16%, из которых около 10% гамет оказались (AnV+/PI–)-сперматозоидами (рис. 3).
Рис. 3. Окраска сперматозоидов человека на определение апоптоза.
Окрашивание Аннексином V-FITC проявляется в виде зеленой флуоресценции и указывает на экспрессию фосфатидилсерина. Иммерсия, ×100.
После инкубации в течение 24 ч in vitro (спонтанный апоптоз) количество сперматозоидов фертильных мужчин с признаками экстернализации ФС статистически значимо не изменялось. Анализ результатов инкубации сперматозоидов бесплодных мужчин в стандартной среде культивирования при 37 °C в течение 24 ч показал, что подвижность и жизнеспособность клеток начинала снижаться уже после 4 ч инкубации (табл. 2).
Таблица 2. Содержание неподвижных, нежизнеспособных и (AnV+/PI–)-апоптотических сперматозоидов в эякулятах бесплодных мужчин после разной продолжительности инкубации in vitro
| Продолжительность инкубации, ч | Количество сперматозоидов, % | ||||
| неподвижных | нежизнеспособных | апоптотических | |||
| ЭО-положительных | PI- положительных AnV+/PI+ и AnV–/PI+ | AnV+/PI+ | AnV+/PI– | ||
| 0 | 62,8±1,7 | 36,4±3,4 | 41,0±1,1 | 21,5±0,7 | 17,6±1,2 |
| 4 | 72,6±3,7# (p<0,05) | 44,8±1,5# (p<0,05) | 47,9±2,6# (p<0,05) | 23,4±1,1 — | 18,7±1,3 — |
| 24 | 92,4±2,5# (p<0,001) | 52,4±2,5# (p<0,001) | 53,8±2,5# (p<0,01) | 28,8±1,0# (p<0,001) | 11,8±1,0# (p<0,001) |
Примечание. # — различия статистически значимы по сравнению со свежевыделенными сперматозоидами (0 ч инкубации).
Оценка апоптоза среди свежевыделенных сперматозоидов бесплодных мужчин выявила, что общее количество сперматозоидов с признаками экстернализации ФС достигло в среднем почти 40%, из которых около 17,6% составили (AnV+/PI–)-сперматозоиды.
Определение спонтанного апоптоза гамет показало, что общее количество (AnV+/PI–)- и (AnV+/PI+)-сперматозоидов бесплодных мужчин с признаками экстернализации ФС после инкубации гамет in vitro в течение 24 ч статистически значимо не изменялось и составило 40,6%. При этом количество вступивших в ранний апоптоз (AnV+/PI–)-сперматозоидов уменьшалось до 67% от количества свежевыделенных (AnV+/PI–)-сперматозоидов, а количество мертвых (AnV+/PI+)-клеток увеличилось почти на 34% от количества свежевыделенных (AnV+/PI+)-сперматозоидов.
Корреляционный анализ выявил, что количество (AnV+/PI–)-сперматозоидов в эякулятах бесплодных мужчин коррелировало с содержанием (AnV+/PI+)-сперматозоидов (r=0,7; p<0,001).
Чтобы оценить способность гамет фертильных и бесплодных мужчин к активированному апоптозу в условиях in vitro их инкубировали в течение 2 и 4 ч с H2O2 200 мкМ, известным индуктором окислительного стресса (рис. 4). Контролем служили клетки, инкубированные в течение того же времени в стандартной среде без добавления перекиси.
Рис. 4. Локализация AnV-FITC в гаметах после инкубации in vitro с перекисью водорода.
а — локализация только в головке сперматозоида; б — локализация во всей головке и средней части; в — локализация в постакросомальной области и средней части.
Гаметы фертильных пациентов оказались полностью обездвиженными по истечении 5 мин инкубации с H2O2, а увеличение количества AnV-положительных гамет отмечалось уже через 60 мин после добавления индуктора окислительного стресса. По истечении 2 ч инкубации с H2O2 концентрация (AnV+/PI–)-гамет была в 5 раз больше по сравнению с контролем (p<0,001). Однако после 4 ч до 71% возрастало количество мертвых сперматозоидов, окрашенных PI, а концентрация (AnV+/PI–)-гамет снижалась в 2 раза по сравнению с аналогичным показателем после 2-часовой инкубации, но в 2,7 раз выше, чем в контроле (p<0,001) (рис. 5).
Рис. 5. Изменение количества (AnV+/PI–)-сперматозоидов фертильных мужчин после активации апоптоза перекисью водорода (H2O2).
p<0,001; * — статистически значимо по сравнению с контролем; # — статистически значимо по сравнению с 2-часовой инкубацией.
Следует отметить, что после инкубации с H2O2 окраска гамет PI выявила существенно более высокое процентное содержание поврежденных нежизнеспособных клеток, чем окраска ЭО (71,0±3,3 и 51,6±5,4% соответственно, p<0,01).
Индекс апоптоза (ИА) сперматозоидов фертильных мужчин рассчитывали как отношение величины (AnV+/PI–)-гамет после воздействия на них H2O2 к величине (AnV+/PI–)-гамет в контроле (без добавлений H2O2): ИА = Апоптоз в опыте/Апоптоз в контроле. ИА после 2-часовой инкубации гамет с H2O2 составил 5, а после 4-х часовой инкубации — 2,8.
У бесплодных мужчин при инкубации гамет с H2O2 200 мкМ изменение процентного содержания (AnV+/PI–)-сперматозоидов оказалось стастистически незначимым по сравнению с контролем (p>0,05).
Обсуждение
Определение жизнеспособности мужских гамет основано на оценке целостности наружной мембраны гаметы. У жизнеспособных гамет мембрана непроницаема для таких красителей, как ЭО и PI. Таким образом, процентное содержание мертвых клеток можно оценить, используя два метода — световую микроскопию с окраской гамет ЭО и флуоресцентную микроскопию с окраской клеток PI [5, 14, 15].
Сравнив результаты оценки жизнеспособности сперматозоидов фертильных мужчин по окраске ЭО и PI, выявили, что первая окраска позволяет обнаружить большую долю нежизнеспособных гамет. Результат вполне ожидаемый, так как ЭО — цитоплазматический краситель, и суправитальное прокрашивание цитоплазмы требует лишь проникновения красителя через плазматическую мембрану клетки. PI — ядерный краситель и должен проникнуть через ядерную оболочку, что требует большего времени. Однако у бесплодных мужчин статистически значимых различий между количеством клеток, окрашенных ЭО и PI, не выявлено (p>0,05).
При сравнении жизнеспособности отмытых от семенной плазмы сперматозоидов фертильных и бесплодных мужчин выявлено, что количество ЭО-положительных гамет статистически значимо не отличалось друг от друга в сравниваемых группах и составляло примерно 35% в каждой группе. Напротив, результаты флуоресцентной микроскопии показали, что у бесплодных мужчин количество отмытых PI-положительных гамет примерно в 2 раза превышало это количество у фертильных. Это объясняется дополнительным количеством (AnV+/PI+)-гамет в поздних стадиях апоптоза (вторичный некроз), которые сопровождаются не только формированием мембранной асимметрии, но и резким возрастанием проницаемости мембраны для PI [5].
Литературный обзор показал, что данные авторов, использовавших для определения жизнеспособности мужских гамет разные красители, отличаются друг от друга. В одних работах PI признан более эффективным красителем для выявления нежизнеспособных гамет как среди свежевыделенных клеток, так и после криоконсервации по сравнению с ЭО [16]. В других работах, оценивая жизнеспособность свежеполученных сперматазоидов от здоровых мужчин, от мужчин с варикоцеле и с хроническим простатитом, авторы выявили, что оба красителя взаимозаменяемы, однако для визуализации окраски PI использовали метод проточной цитометрии [14, 17]. Авторы также пришли к выводу, что после определенных воздействий на гаметы (длительного хранения клеток при 22 °С, криоконсервации, воздействия некоторых химических веществ) краситель PI выявляет большую долю нежизнеспособных гамет.
Наши данные также подтверждают, что при оценке способности сперматозоидов фертильных мужчин к активированному апоптозу ЭО оказался пригоден для выявления жизнеспособности гамет менее, чем PI. Видимо, после воздействия индуктора апоптоза нежизнеспособными оказываются не только некротические гаметы, но и (AnV+/PI+)-сперматозоиды на поздней стадии апоптоза.
Оценка спонтанного апоптоза гамет фертильных и бесплодных мужчин показала, что уменьшение подвижности и жизнеспособности спермиев после инкубации in vitro в течение суток при 37 °C не сопровождалось статистически значимым увеличением количества гамет, вступающих в ранний апоптоз. Инициации апоптоза не наблюдалось, а большинство гамет теряли свою жизнеспособность при данных условиях хранения путем некроза. Экстернализация ФС и присутствие (AnV+/PI–)-гамет есть следствие «абортивного» апоптоза, начавшегося на последней стадии сперматогенеза [3, 5].
Важным фактором, активирующим процесс апоптоза у половых клеток и приводящим к развитию мужского бесплодия, является окислительный стресс [18—20]. Оценка способности гамет фертильных и бесплодных мужчин к перекись-индуцированному апоптозу выявила только у фертильных мужчин увеличение количества (AnV+/PI–)-клеток, которое изменялось в зависимости от периода инкубации гамет с H2O2. После инкубации в течение 2 ч с индуктором окислительного стресса часть жизнеспособных гамет начинала связывать AnV-FITC, что указывает на активацию раннего апоптотического процесса и экстернализацию ФС на поверхность мембран сперматозоидов. Далее, при продлении времени инкубации до 4 ч доля таких (AnV+/PI–)-гамет уменьшалась и возрастала концентрация мертвых гамет, окрашенных PI. Это является признаком повреждения мембраны, потери ее целостности и в дальнейшем — нежизнеспособности гаметы. Полученные результаты вполне сопоставимы с данными некоторых исследователей о том, что H2O2 в концентрации 200 мкМ может вызывать фрагментацию ДНК половых клеток до 50% [21, 22]. Видимо, H2O2 как эффективный активатор апоптоза позволяет выявить популяцию гамет с ослабленным антиоксидантным потенциалом и предрасположенностью к генетическим повреждениям [23].
ИА, равный 5, наглядно показал изменение количества (AnV+/PI–)-гамет после воздействия апоптогенного фактора по сравнению с контролем. Значение ИА более 1 свидетельствует об активации апоптоза у гамет здоровых доноров после воздействия на клетки in vitro высокой концентрации H2O2.
Активации апоптоза у сперматозоидов бесплодных мужчин в виде статистически значимого увеличения количества (AnV+/PI–)-гамет не наблюдалось, что говорит о снижении чувствительности половых клеток бесплодных мужчин к апоптогенному действию H2O2. Однако встречаются данные о том, что у мужчин при бесплодии ДНК сперматозоидов чувствительнее к воздействию H2O2 по сравнению с фертильными донорами [24].
Таким образом, активация апоптоза при действии H2O2 на гаметы зависит как от функционального состояния гамет, так и от продолжительности времени инкубации: H2O2 в концентрации 200 мкМ при 2-часовом воздействии активирует апоптоз сперматозоидов фертильных мужчин, вызывая необратимые биохимические изменения в клеточной мембране, вследствие чего возрастает количество (AnV+/PI–)-сперматозоидов.
У бесплодных мужчин из-за различных механизмов формирования бесплодия и вследствие этого различных функциональных и морфологических характеристик гамет не выявлена активация апоптоза в условиях инкубации в ответ на воздействие апоптогенного фактора. Однако тот факт, что при действии активатора апоптоза снижение подвижности гамет не сопровождалось активацией апоптоза в отличие от фертильных мужчин, говорит о нарушении или блокировании проведения сигналов митохондриального механизма апоптоза у бесплодных пациентов.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Полученные в этом исследовании результаты свидетельствуют о том, что после эякуляции в условиях 24-часовой инкубации при 37 °C сперматозоиды мужчин с разной фертильностью теряют свою жизнеспособность, не запуская процесс апоптоза. Основным способом гибели гамет при этом является некроз. Выявленные маркеры апоптоза у сперматозоидов могут быть следствием процессов, начатых до эякуляции на посттестикулярном уровне или в период сперматогенеза и не законченных по каким-либо причинам либо отложенным. Активацию апоптоза у здоровых гамет можно спровоцировать, например, окислительным стрессом, индуктором которого в условиях in vitro может выступать перекись водорода 200 мкМ. У бесплодных пациентов выявлено нарушение активации апоптоза у гамет в ответ на действие провоцирующего фактора.
Полученные результаты могут иметь клиническое значение и использоваться для прогнозирования дисфункций сперматозоидов и нарушений оплодотворяющей способности. Понимание механизмов снижения жизнеспособности половых клеток может помочь в поиске необходимых биомаркеров для сперматозоидов, проходящих отбор для процедур вспомогательных репродуктивных технологий, например, у пациентов с высоким уровнем активных форм кислорода, сперма которых продолжительное время находилась в эпидидимисе в случаях абстиненции или анэякуляции, а также при патологии семявыносящих путей.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Плосконос М.В.
Сбор и обработка материала — Зульбалаева Д.Ф., Курбангалиева Н.Р., Рипп С.В.
Статистическая обработка — Плосконос М.В.
Написание текста — Плосконос М.В.
Редактирование — Плосконос М.В., Зульбалаева Д.Ф.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.