Эндометриоз — заболевание, которым во всем мире болеет примерно 10% женщин в основном репродуктивного возраста. Заболевание может протекать бессимптомно, в связи с этим истинную распространенность оценить затруднительно. Наиболее актуальным остается вопрос бесплодия у данной категории пациенток [1]. Эндометриоз является многофакторным заболеванием и, несмотря на длительное его изучение, этиология данного патологического процесса до сих пор не ясна [2]. Поэтому уточнение патогенетических механизмов заболевания и выявление новых путей их регуляции до сих пор сохраняет актуальность, а понимание аспектов патогенеза может способствовать развитию современных подходов к лечению эндометриоза.
В последнее время активно изучается роль малых некодирующих РНК (мРНК) в регуляции экспрессии генов как в норме, так и при патологии. По данным многочисленных исследований, только 2—3% человеческого генома транскрибируется в мРНК с последующей трансляцией и образованием функциональных белков [3]. В этой связи белок-некодирующие РНК (нкРНК), занимающие существенную часть синтезируемых транскриптов, стали объектом изучения для выявления их роли в клеточных функциях и патогенезе заболеваний. Так, в ряде работ продемонстрирована ключевая роль нкРНК в патогенентических механизмах формирования и прогрессирования пролиферативных заболеваний, в частности, эндометриоза [4]. Некодирующие РНК классифицируются в зависимости от длины нуклеотидной цепи на длинные и малые нкРНК. Длинные нкРНК включают РНК транскрипты с числом нуклеотидов более 200 [5]. Представители малых нкРНК достаточно гетерогенны и представлены несколькими разновидностями: это микроРНК, транспортные РНК, малые ядрышковые РНК, короткие интерферирующие РНК, рибосомальные РНК и РНК, взаимодействующие с PIWI-белками (пиРНК) [6]. Наиболее изученными на сегодняшний день являются различные представители семейств микроРНК и длинных нкРНК, установлена их потенциальная роль в регуляции экспрессии генов-мишеней, участвующих в развитии пролиферативных заболеваний. В меньшей степени исследованы пиРНК и их ассоциация с различными заболеваниями, в этой связи в настоящее время проводятся активные исследования биологической роли этих коротких транскриптов в генезе заболеваний человека.
Семейство пиРНК представлено одноцепочечными РНК, имеющими длину 23—36 нуклеотидов и взаимодействующими с белками семейства PIWI с образованием комплекса piRISC (piRNA-induced silencing complex). Долгое время считалось, что основной биологической функцией пиРНК является контроль экспрессии транспозонов в делящихся клетках при эмбриогенезе и гаметогенезе [7]. Поскольку перемещение транспозонов имеет высокий риск повреждения генома, регуляция их экспрессии пиРНК имеет большое значение для поддержания нормального гаметогенеза и размножения. Благодаря разнообразию исходных транспозонов, класс пиРНК является самым большим по численности классом среди нкРНК [8, 9]. Согласно имеющимся базам данных в геноме человека идентифицировано около 23439 пиРНК, что вполне сопоставимо с числом кодирующих белок мРНК (примерно 20 тыс.), но значительно превышает общее число таких нкРНК, как микроРНК (примерно 2 тыс.) [10, 11]. Это позволило предположить, что пиРНК могут выполнять более разнообразные биологические функции. Так, установлено, что помимо участия в процессах сперматогенеза и регуляции экспрессии транспозонов, пиРНК играют роль в эпигенетической регуляции и перестройках генома, регуляции синтеза белка и поддержании активности стволовых клеток зародыша [10]. Кроме того, недавно сообщалось об аберрантной экспрессии пиРНК и белков семейства PIWI в некоторых раковых опухолях человека, причем показано, что некоторые комплексы пиРНК с PIWI-белками участвуют в опухолевом процессе, и информация об их экспрессии может быть использована для прогнозирования исходов заболевания [12, 13]. Экспрессия пиРНК в эктопическом и эутопическом эндометрии при эндометриозе практически не изучалась. Изучение экспрессии пиРНК может дать ценную информацию для уточнения патогенетических механизмов данного заболевания, в этой связи нами проведено исследование экспрессии пиРНК в эутопическом и эктопическом эндометрии пациенток с эндометриоидными кистами яичников.
Цель исследования — выявить экспрессию PIWI ассоциированных РНК (пиРНК) в ткани эндометрия и эндометриоидных кист яичников и установить различия в экспрессии пиРНК между эутопическим и эктопическим эндометрием у пациенток с эндометриоидными кистами яичников для определения роли этих показателей в патогенезе эндометриоза.
Материал и методы
Сбор биоматериала
В исследование включены пациентки (n=21) репродуктивного возраста с эндометриоидными кистами яичников. Ткани эндометрия собирали в ходе хирургического вмешательства в отделении оперативной гинекологии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени В.И. Кулакова» Минздрава России (руководитель отделения акад. РАН, проф., д.м.н. Л.В. Адамян) в пролиферативную фазу менструального цикла (6—9-й день цикла). Для проведения исследований получено информированное согласие пациенток на сбор биоматериала. План и методика исследования утверждены этическим комитетом ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени В.И. Кулакова».
Проводилось гистологическое исследование тканей эндометрия. Для последующего секвенирования образцы тканей эндометрия мгновенно замораживали в жидком азоте и затем хранили в биобанке при –80 °С.
Средний возраст пациенток составил 30,27±3,78 года. Всем женщинам проводилось оперативное лечение лапароскопическим доступом. Показаниями к оперативному вмешательству были наличие эндометриоидных кист яичников, хроническая тазовая боль, бесплодие, дисменорея.
У всех пациенток диагностированы эндометриоидные кисты яичников диаметром от 2,5 до 5,5 см, в эндометрии патологии не выявлено, что подтверждено данными гистологического исследования. В ходе оперативного лечения проводили энуклеацию стенки эндометриоидной кисты и морфологическую верификацию диагноза.
Выделение РНК
Из образцов собранных тканей выделены фракции суммарной РНК, содержащие малые РНК, с использованием коммерческих наборов miRNeasy Micro Kit и RNeasy MinElute Cleanup Kit (Qiagen, США) по методике, рекомендуемой производителем. Качество выделенных фракций оценивали при помощи микроэлектрофореза на чипах на приборе Bioanalyser 2100 (Agilent Technologies, США).
Секвенирование малых РНК
Для секвенирования мРНК отобраны образцы тканей эутопического и эктопического эндометрия 5 пациенток с максимально схожими клиническими параметрами. Библиотеки кДНК из выделенных образцов РНК готовили с использованием наборов NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina (New England Biolab, Германия) по методикам, рекомендованным производителем. Секвенирование проводили на платформе Illumina NextSeq с использованием реагентов и расходных материалов фирмы Illumina, Inc. (США) (NextSeq 500/550 High Output v2 kit). Качественный и количественный анализ библиотек проводили при помощи микроэлектрофореза (Agilent Technologies, США) и флуорометрии (Qubit, Thermo Fisher Scientific, США). Качество секвенирования оценивали при помощи сервиса BaseSpace (Illumina, Inc., США) по следующим параметрам: плотность кластеров, интенсивность сигнала в каналах детекции, доля кластеров, прошедших фильтр по выходу выровненных прочтений. Все параметры не выходили за пределы допустимых значений.
Анализ данных
Полученные в результате секвенирования последовательности нуклеотидов обрабатывали c использованием онлайн сервиса Oasis (http://oasis.dzne.de), при помощи которого проводили процедуру удаления адаптеров, выравнивание на базу данных человеческого генома, а также анализ дифференциальной экспрессии (при помощи алгоритма DeSeq2). Поиск генов-мишеней пиРНК проводился при помощи базы piRNAdb (http://piRNAdb.org). Полученные списки генов использовали для обогащения по базе данных KEGG (http://www.genome.jp) с целью выявления путей внутриклеточной сигнализации и биологических процессов при помощи программы Cytoscape 3.4.09 и плагина JEPETTO10.
Результаты и обсуждение
По данным, полученным в результате секвенирования малых РНК из образцов тканей эндометрия, установлено, что в эутопическом и эктопическом эндометрии идентифицируется 197 пиРНК. Список наиболее представленных по количеству прочтений (более 4 тыс.) пиРНК приведен в табл. 1.
Таблица 1. Экспрессия PIW ассоциированных РНК в тканях эутопического и эктопического эндометрия
| Идентификатор | Число ридов |
| hsa-piR-23626 | 22960 |
| hsa-piR-28763 | 22355 |
| hsa-piR-8871 | 9492 |
| hsa-piR-28765 | 9140 |
| hsa-piR-25624 | 8986 |
| hsa-piR-12655 | 8189 |
| hsa-piR-23019 | 7152 |
| hsa-piR-27435 | 7083 |
| hsa-piR-23127 | 6941 |
| hsa-piR-1119 | 5803 |
| hsa-piR-28340 | 5543 |
| hsa-piR-27080 | 4555 |
| hsa-piR-27306 | 4165 |
| hsa-piR-1028 | 4125 |
Далее проведен анализ дэ-пиРНК в эктопическом эндометрии по сравнению с эутопическим. Данные о дифференциальной экспрессии приведены на рисунке. В таблице на рисунке представлены списки дэ-пиРНК, а также направление и кратность изменения их экспрессии в тканях эндометриоидных кист по сравнению с эутопическим эндометрием. Обращает на себя внимание преобладание в эктопическом эндометрии дэ-пиРНК с пониженной экспрессией. Всего выявлено 30 дэ-пиРНК, среди них 4 с повышенной и 26 с пониженной экспрессией.
Дифференциальная экспрессия PIWI-ассоциированных РНК в тканях эктопического эндометрия по сравнению с эуто-пическим эндометрием.
На диаграмме представлено графическое распределение дифференциально экспрессированных PIWI-ассоциированных РНК, в табли-це приведены списки дифференциально экспрессированных PIWI-ассоциированных РНК в эндометриоидных кистах яичника с указа-нием кратности изменений и усредненного количества прочтений во всех исследуемых образцах.
Далее проведен функциональный анализ выявленных дэ-пиРНК. На первом этапе выполнен поиск потенциальных генов-мишеней дэ-пиРНК при помощи базы данных piRNAdb (www.piRNAdb.org). Полученные списки генов-мишеней использовали для обогащения по базе данных KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, www.genome.jp/kegg), включающей информацию об участии генов в путях внутриклеточной сигнализации. В результате выявлены пути и процессы, в которых принимают участие потенциальные мишени дэ-пиРНК. Репрезентативные данные анализа представлены в табл. 2. Показано участие генов-мишеней в сигнальных каскадах p53, Wnt, mTOR, JAK-STAT, которые вовлечены в регуляцию клеточного деления и метаболизма. С этими каскадами могут быть связаны выявленные пути, задействованные в метаболизме сахаров и азотистых оснований. Обращает также на себя внимание присутствие процессов, ассоциированных с различными новообразованиями. Роль пиРНК и взаимодействующих с ними белков активно изучается в последнее время в качестве возможного патогенетического звена при канцерогенезе. Так, показано, что увеличение экспрессии представителей семейства HIWI-белков (аналоги PIWI-белков у человека), взаимодействующих с пиРНК, коррелировало с развитием ряда опухолей [14—17], а ингибирование экспрессии HIWI-белков приводило к снижению пролиферации опухолевых клеток [18]. Некоторыми исследователями продемонстрировано изменение экспрессии ряда пиРНК в тканях рака желудка, толстой кишки, легких и молочной железы по сравнению с нормальными соседними тканями, что указывает на их потенциальную роль в регуляции пролиферации и опухолевого роста [7, 18—20]. Полученные данные находят свое подтверждение в результатах недавней работы, в которой описано изменение экспрессии пиРНК, специфичное для фазы клеточного цикла в клетках регенерирующей печени [20].
Таблица 2. Сигнальные пути и клеточные процессы, регулируемые потенциальными мишенями дифференциально экспрессированных PIWI-ассоциированных РНК
| KEGG pathways | Path. size Overlap | KEGG pathways | Path. size Overlap | ||
| Онкологические процессы: | Внутриклеточная сигнализация: | ||||
| Pathways in cancer | 322 | 5 | p53 signaling | 67 | 4 |
| Prostate cancer | 87 | 4 | VEGF signaling | 75 | 2 |
| Melanoma | 68 | 3 | T cell receptor signaling | 108 | 2 |
| Bladder cancer | 40 | 2 | Neurotrophin signaling | 124 | 2 |
| Endometrial cancer | 52 | 2 | Wnt signaling | 150 | 2 |
| Non-small cell lung cancer | 52 | 2 | Jak-STAT signaling | 154 | 2 |
| Colorectal cancer | 62 | 2 | mTOR signaling | 51 | 1 |
| Glioma | 63 | 2 | |||
| Pancreatic cancer | 70 | 2 | |||
| Внутриклеточные процессы: | Биосинтез и метаболизм: | ||||
| Apoptosis | 87 | 4 | Pyrimidine metabolism | 94 | 5 |
| Cell cycle | 122 | 3 | Purine metabolism | 158 | 5 |
| Endocytosis | 194 | 3 | Glyoxylate/dicarboxylate met. | 16 | 1 |
| Axon guidance | 128 | 2 | Nicotinate/nicotinamide met. | 24 | 1 |
| Ubiquitin mediated proteolysis | 133 | 2 | Pentose phosphate pathway | 26 | 1 |
| Phagosome | 144 | 2 | Pyruvate metabolism | 40 | 1 |
| Reg. of actin cytoskeleton | 208 | 2 | Primary bile acid biosynthesis | 16 | 1 |
| Regulation of autophagy | 33 | 1 | Steroid biosynthesis | 17 | 1 |
Экспрессия HIWI-белков выявлена также при раке эндометрия [21], однако экспрессия самих пиРНК в тканях эндометрия оставалась малоизученной. В недавней работе M. Ravo и соавт. методом секвенирования установлено статистически значимое изменение экспрессии десяти пиРНК в тканях рака эндометрия по сравнению с нормальными тканями [22]. Авторы предположили, что дэ-пиРНК могут оказывать модулирующее действие на несколько сигнальных путей, таких как ERK/MAPK, TGF-β и Wnt/β-Катенин, активация которых наблюдается уже при формировании гиперплазий, и становится наиболее выраженной при раковой трансформации. Поскольку роль пиРНК в патогенетических процессах до настоящего времени не изучалась, можно предположить, что идентифицированные в данной работе дэ-пиРНК также могут оказывать аналогичное действие при эндометриозе, поскольку, по данным биоинформатического анализа, выявленные пиРНК способны модулировать сходные пути внутриклеточной сигнализации, ответственные за пролиферацию и дифференцировку клеток.
Заключение
Анализ, проведенный с использованием метода секвенирования, позволил впервые верифицировать дифференциальную экспрессию PIWI-ассоциированных РНК в тканях эндометриоидных кист яичников и в эутопическом эндометрии. Полученные данные могут дополнить представление о молекулярных механизмах патогенеза эндометриоза, а также явиться основой для дальнейшего выявления диагностических и прогностических биомаркеров эндометриоза.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Н.М., А.Г., Ч.Э., И.М., Е.Ф., М.Б., Л.А.
Сбор и обработка материала — Н.М., А.Г., Ч.Э., И.М., Е.Ф., М.Б., Л.А.
Статистический анализ данных — Н.М., А.Г., Ч.Э., И.М., Е.Ф., М.Б., Л.А.
Написание текста — Н.М., А.Г., Ч.Э., И.М., Е.Ф., М.Б., Л.А.
Редактирование — Л.А.
Работа поддержана грантом Российского фонда фундаментальных исследований офи_м №16-29-07390.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.