Стремительное развитие ВРТ дает возможность иметь детей при формах бесплодия, которые ранее считались абсолютно бесперспективными для лечения [1], что прежде всего обусловлено достижениями молекулярной генетики и эмбриологии. Распространяются в клинической практике методики ИКСИ (Intra Cytoplasmic Sperm Injection, ICSI — интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида), криоконсервация ооцитов и преимплантационная генетическая диагностика эмбрионов. Обычно созревание ооцита до состояния, когда он способен к оплодотворению методом ИКСИ, происходит в процессе стимуляции суперовуляции, проводимой врачом акушером-гинекологом. В настоящее время основным критерием для отбора компетентных ооцитов для последующих манипуляций служит морфологическая характеристика клеток, при том что зависимость между морфологией клеток и последующей здоровой беременностью имеет слабую корреляцию. Кроме того, в большинстве исследований степень зрелости определяется только по выделению 1-го полярного тельца, что отражает ядерное созревание яйцеклеток, но не цитоплазматическое. Не все ооциты в процессе стимуляции достигают зрелости. Способны оплодотворяться только ооциты, находящиеся в метафазе 2 мейоза, которые обозначают как М2. Незрелый ооцит может находиться в метафазе 1 мейоза (М1) и на стадии зародышевого пузырька GV (germinal vesicle — герминальный везикул) [2].

Дозревание яйцеклеток in vitro — хорошая альтернатива обычной контролируемой стимуляции яичников для пациентов с высоким риском развития синдрома гиперстимуляции яичников или синдромом поликистозных яичников (СПКЯ) [3]. В настоящее время данный метод предлагается для терапии пациенток со слабым ответом яичников на стимуляцию. Процедура созревания ооцитов in vitro (In Vitro Maturation — IVM) проводится на ооцитах, окруженных клетками кумулюса в условиях наличия в среде различных гормональных добавок и факторов роста. Тем не менее, если пациентка прошла контролируемую гиперстимуляцию функции яичников для проведения процедуры ИКСИ, и в момент денудации большая часть ее ооцитов, если не все, оказались на стадии GV, адекватной терапии не предлагается. Недавние исследования показали, что на ооцитах и на ранних преимплантационных эмбрионах находится рецептор гормона роста (Growth Hormone — GH), который может стимулировать созревание in vitro ооцитов без клеток кумулюса [4, 5]. Общие источники для макромолекул протеинов культурных сред — человеческий альбумин сыворотки крови или синтетическая сыворотка. Оба добавляют в концентрации от 5 до 20% [6]. Вещества, находящиеся в сыворотке, используемой для культивирования эмбрионов (G-Protein, США), обладают стимулирующим действием на рецепторы GH и запускают процесс дозревания ооцитов in vitro. GH in vitro обладает положительным эффектом за счет увеличения потенциала цитоплазмы, что приводит к увеличению потенциала развития эмбриона [7]. Основываясь на изложенном, мы провели процедуру созревания ооцитов in vitro в качестве «спасительного» протокола для пациентки, у которой запланирована процедура ИКСИ, однако ооциты в момент их получения все оказались на стадии GV.

Пациентка Г., 32 лет, европеоидной расы, обратилась в ООО МЦ «МирА» в июне 2017 г. для лечения первичного бесплодия. Анамнез болезни: в 2014 г. лапароскопическая двусторонняя резекция правого и левого яичников по поводу эндометриоидных кист; миома матки малых размеров; многочисленные неудачные попытки экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Ниже приведены в хронологическом порядке описания ранее проводимых протоколов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ).

В феврале 2016 г. выполнен длинный протокол ВРТ с использованием диферелина 0,1 мг, фоллитропина альфа 187,5 МЕ (Гонал Ф, «Merck Serono Europe Limited», Великобритания) + менопаузальный гонадотропин 75 МЕ (Менопур 75 МЕ, «Ферринг ГмбХ», Германия) — пунктированы 3 фолликула, получен 1 ооцит МII. Показатели спермы: концентрация сперматозоидов 130 млн/мл, объем эякулята 4 мл, 9% морфологически нормальных сперматозоидов, 2+55% а+b прогрессивно подвижных. Выполнено оплодотворение методом ИКСИ, на 2-е сутки 3аb, культивирование эмбриона до 5-х суток, эмбриотрансфер в свежем протоколе при толщине эндометрия 14 мм — беременность не наступила.

В апреле 2016 г. в той же клинике выполнен протокол с антагонистами гонадотропин-рилизинг-гормона, стартовая доза ФСГ 187,5 МЕ + менопур 75 МЕ; получен 1 ооцит низкого качества. Показатели спермы: концентрация сперматозоидов 200 млн/мл, объем эякулята 1,7 мл, 6% морфологически нормальных форм, 10% прогрессивно подвижных. Выполнено оплодотворение методом ЭКО, остановка в развитии эмбриона на 2-е сутки культивирования.

Смена клиники ВРТ. В октябре 2016 г. выполнен протокол с антагонистами гонадотропин-рилизинг-гормона; стартовая доза менопаузального гонадотропина 150 МЕ (Менопур), ганиреликс. Пунктированы 2 фолликула — ооциты не получены.

Декабрь 2016 г. Выполнен протокол с антагонистами гонадотропин-рилизинг-гормона; стартовая доза менопаузального гонадотропина 150 МЕ, ганиреликс, триггер — рекомбинантный лютеинизирующий гормон (рЛГ) 6500 М.Е. Пунктированы 2 фолликула, получен 1 ооцит MII, оплодотворение методом ЭКО, культивирование до 5-х суток развития, криоконсервация бластоцисты 3ВВ.

Апрель 2017 г. Выполнен криопротокол в естественном цикле, эмбриотрансфер бластоцисты 4ВВ — беременность на наступила.

Май 2017 г. Выполнен протокол с антагонистами гонадотропин-рилизинг-гормона — рекомбинантный фолликулостимулирующий гормонон (рФСГ) 150 МЕ (Перговерис + менопаузальный гонадотропин 75 МЕ). Рост 3 фолликулов, получен 1 ооцит, оплодотворение методом ЭКО — аномальное оплодотворение 3PN.

В июне 2017 г. пациентка обратилась в ООО МЦ «МирА». На момент осмотра у пациентки сохранялся нормальный регулярный овуляторный менструальный цикл (28—32 дня). Уровень ФСГ на 2—3-й дни цикла — до 12 мМЕ/мл, уровень антимюллерова гормона (АМГ) — 0,02 нг/мл. Обращали на себя внимание сохранение овуляторных циклов и неоднородность эндометрия при динамическом наблюдении. Муж обследован, нормозооспермия.

Предпринята 7-я попытка для данной пациентки (1-я попытка в ООО МЦ «МирА»). Назначен эстрадиола валерат 4 мг/сут с 22-го дня цикла (эстрогеновый прайминг), со 2-го дня цикла корифоллитропин альфа 150 МЕ (Элонва, «Веттер Фарма-Фертигунг ГмбХ», Нидерланды). При контроле с применением ультразвукового исследования (УЗИ) на 4-е сутки стимуляции обнаружено следующее: в левом яичнике фолликулы 7 и 10 мм, эндометрий до 4 мм. Уровень эстрадиола — 190 нмоль/л. Назначен антагонист гонадотропин-рилизинг-гормона цетрореликс 0,25 мг с 6-го дня, далее стимуляция овуляции продолжена менопаузальным гонадотропином в дозе 225 МЕ.

Длительность стимуляции суперовуляции составила 8 дней, получен рост 1 фолликула, триггер овуляции хорионический гонадотропин (ХГЧ) 5000 МЕ назначен при размере фолликула 17 мм. Пункция выполнена через 36 ч под местной анестезией, получен 1 ооцит МII SFgran. Показатели спермы: концентрация сперматозоидов 54 млн/мл, объем эякулята 3 мл, 3% морфологически нормальных форм, 19% прогрессивно подвижных, согласно критериям ВОЗ. Выполнено оплодотворение методом ПИКСИ (physiologic intra cytoplasmic sperm injection) — оплодотворение не произошло. С супружеской парой проведено обсуждение использования донорских ооцитов, пара приняла решение продолжить попытки с использованием собственных ооцитов. Принимая во внимание плохой ответ на стандартную стимуляцию в протоколе ВРТ и низкое качество ооцитов, решено в дальнейшем использовать естественный/модифицированный протокол ВРТ.

Предпринята 8-я попытка (2-я попытка в ООО МЦ «МирА»). В следующем менструальном цикле при контроле с применением УЗИ на 10-й день цикла обнаружено следующее: фолликул 15 мм, эндометрий 11 мм. Уровень Л.Г. — 11,92 МЕ/л, эстрадиола — 790 пмоль/л. Назначен триггер овуляции рЛГ 6500 МЕ (Овитрель, «Merck Serono S.p.A.», Италия), пункция выполнена через 36 ч на 12-й день цикла под местной анестезией, получен 1 ооцит MII ZF. Показатели спермы: концентрация сперматозоидов 8 млн/мл, объем эякулята 3 мл, 7% морфологически нормальных форм, 31% прогрессивно подвижных, согласно критериям ВОЗ. Оплодотворение методом ИКСИ — оплодотворение произошло; культивирование: 2-е сутки— 3а ZF, 3-и сутки — 7а ZF, 4-е сутки — 14а ZF, 5-е сутки — 3 ВВ ZF. Выполнен эбриотрансфер бластоцисты в полость матки — беременность не наступила.

С участием супружеской пары, лечащего врача акушера-гинеколога и эмбриологов проведен консилиум на предмет использования донорских ооцитов. Супружеская пара приняла решение о начале подбора донора и продолжении попыток с использованием собственных ооцитов. Выполнены гистероскопия, биопсия эндометрия в октябре 2017 г. При гистологическом исследовании — эндометрий средней стадии секреции.

Предпринята 9-я попытка (3-я попытка в ООО МЦ «МирА»). В ноябре 2017 г. на 6-й день естественного цикла при контроле с применением УЗИ обнаружены фолликулы 10 и 16 мм, толщина эндометрия составила 6 мм. Уровень эстрадиола 302 пмоль/л. Принято решение изменить стандартную схему стимуляции в сторону получения незрелых ооцитов, что могло помочь при синхронизации ооплазматической и генетической компонент развития ооцитов. Назначен менопаузальный гонадотропин (менопур 75 МЕ, «Ферринг ГмбХ», Германия) в дозе 75 МЕ подкожно совместно с антагонистом гонадотропин-рилизинг-гормона препаратом цетрореликс 0,25 мг («Merck Serono Europe Limited», Великобритания) в течение 3 дней. Результаты контроля с помощью УЗИ на 9-й день цикла — фолликулы 14 и 17 мм, эндометрий 6,5 мм. Уровень эстрадиола — 442 пмоль/л. Назначен триггер овуляции ХГЧ 5000 М.Е. Через 35 ч на 11-й день цикла проведена пункция 2 фолликулов под местной анестезией. Получено 2 ооцита, денудацию производили гиалуронидазой (Synvitro Hyadase, «Global», США) через 2 ч после получения ооцитов в среде для оплодотворения G-IVF, global c добавлением 10%, повышенного количества протеина). Все ооциты находились на стадии GV. Обычно в нашем отделении получают не более 5—10% незрелых ооцитов. Ооциты на стадии GV инкубировали в среде G-Total (США) c добавлением 10%, повышенного количества протеина, ожидая, когда выделится первое полярное тельце (на следующий день планировали процедуру ПИКСИ). Ооциты инкубировали в полученной среде до утра при 37 °C и 5% CO₂. Показатели спермы были: концентрация сперматозоидов — 30 млн/мл, объем эякулята — 2 мл, 3% морфологически нормальных форм, 24% прогрессивно подвижных, согласно критериям ВОЗ. Проведение программы ИКСИ—ПИКСИ оправдано, поскольку необходимо исключить мужской фактор бесплодия, диагностическим путем выбрав зрелые сперматозоиды. Незрелые ооциты, дозревшие в условиях in vitro, рецепторно обеднены [7], поэтому стандартное оплодотворение провести не представляется возможным. Через 20 ч 2 ооцита имели 2 пронуклеуса. На 3-и сутки культивирования 2 эмбриона находились на стадии 8 клеток, 4 — на стадии 15 клеток, на 5-е сутки культивирования — оба эмбриона были на стадии 4AA и витрифицированы по одному на носителе для витрификации «Kitazato Corporation», Япония.

Предпринята 10-я попытка. В январе 2018 г. выполнен криопротокол в заместительном цикле (17β-эстрадиол 2 мг, эстрадиола валерат 2 мг, ацетилсалициловая кислота 50 мг в течение 10 дней; толщина эндометрия до 8,5 мм). На 5-е сутки от момента назначения прогестерона перенесен размороженный эмбрион на стадии бластоцисты 4AA, пациентка получала микронизированный прогестерон 800 мг вагинально в течение 15 дней для поддержания лютеиновой фазы.

Тест на беременность на 10-е сутки после переноса эмбриона — положительный, рост ХГЧ адекватный. На 21-е сутки после переноса при УЗИ определяется плодное яйцо в полости матки, эмбрион 1,5 мм, сердцебиение четкое, ритмичное. Эстрогеновая и прогестероновая поддержка посттрансферного периода продолжена до 8 нед беременности и полностью отменена к 13-й неделе беременности.

Пренатальный скрининг I триместра выполнен в срок 12 нед и 3 дня: копчико-теменной размер 62,9 мм, уровень свободного бета-ХГЧ — 0,89 МоМ, уровень РАРР-А белка — 0,87 МоМ, носовые кости определяются, толщина воротникового пространства — 0,92 МоМ (1,47 мм). Расчетный риск анеуплоидий составил менее 1:12 000. Беременность протекала физиологически. В октябре 2018 г. произошли своевременные оперативные роды (тазовое предлежание, узкий таз, одномоментно выполнена миомэктомия) в срок 37 нед здоровым плодом мужского пола, масса тела 2860 г, длина — 50 см, оценка по шкале Апгар 8—9 баллов. В настоящее время мальчику 4 мес, развивается соответственно возрасту.

Иногда большая часть или все ооциты оказываются на стадии зародышевого пузырька ко времени проведения интрацитоплазматической инъекции сперматозоида; это всегда разочаровывает специалистов и вызывает ряд вопросов. У некоторых пациентов при использовании разных схем стимуляции также получают большое количество ооцитов на стадии зародышевого пузырька. Наши наблюдения подтверждают, что среду с повышенным содержанием сыворотки (10% вместо стандартных 5%) без добавления других гормонов можно успешно использовать для созревания ооцитов на стадии зародышевого пузырька. Созревание цитоплазмы и регуляция полиаденилирования мРНК связаны и влияют на потенциал развития эмбриона. Репарация ДНК важна во время оплодотворения и на ранних этапах эмбриогенеза, что может согласовываться с наблюдениями, сделанными in vitro у пациентов старшего репродуктивного возраста. Представляется, что наилучшее решение для успешного прогнозирования окна имплантации — заморозить полученный эмбрион, как мы поступили в представленном клиническом случае. Очень высок риск асинхронизации между эмбрионом и эндометрием, так как обычно эмбрионы переносят с задержкой на 24 ч. Предложенный нами протокол предусматривает новый простой способ «спасти» ооциты на стадии зародышевого пузырька. Протокол технологии «дозревания» в пробирке, возможно, позволит синхронизировать генетическую и цитоплазматическую компоненты ооцита и получить жизнеспособный эмбрион хорошего качества.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Ю.Л., А.К., В.Е.

Сбор и обработка материала — Ю.Л., Т.К.

Статистическая обработка — Т.К.

Написание текста — Ю.К., Т.К.

Редактирование — М.Ф., А.К.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.

Сведения об авторах

Киселева Ю.Ю. — эмбриолог ФГБУ «НМИЦ АГиП им. акад. В.И.Кулакова» Минздрава России, эмбриолог ООО МЦ «МирА», Москва, Россия; e-mail: 79164171311@yandex.ru;

Казначеева Т.В. — акушер-гинеколог ООО МЦ «МирА», доцент кафедры репродуктивной медицины и хирургии факультета дополнительного профессионального образования Московского государственного медико-стоматологического университета им. А.И. Евдокимова, Москва, Россия, e-mail: clinica-mira@mail.ru;

Фармаковская М.Д. — научный сотрудник ФГБУ «НМИЦ им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва, Россия; e-mail: a_kozyreva@oparina.ru;

Елагин В.В. — заведующий эмбриологической лабораторией ООО МЦ «МирА», Москва, Россия, e-mail: clinica-mira@mail.ru;

Кириллова А.О. — старший эмбриолог ФГБУ «НМИЦ АГиП им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва, Россия; e-mail: a_kozyreva@oparina.ru

КАК ЦИТИРОВАТЬ:

Киселева Ю.Ю., Казначеева Т.В., Фармаковская М.Ф., Елагин В.В., Кириллова А.О. Случай рождения здорового ребенка при дозревании ооцитов, полученных на стадии GV. Проблемы репродукции. 2019;25(4):-88. https://doi.org/10.17116repro201925041

Автор, ответственный за переписку: Киселева Ю.Ю. —
e-mail: 79164171311@yandex.ru