В настоящее время доказана роль воспаления в микроокружении в генезе развития эктопического эндометрия при перитонеальной форме эндометриоза. К числу неинфекционных трансмиттеров, индуцирующих воспаление при эндометриозе, относится вазоактивный интестинальный пептид (VIP) [1]. Процессы, сопутствующие или индуцированные VIP в тканях эутопического и эктопического эндометрия, не нашли своего отражения в научной литературе. В то же время ассоциация воспаления в микроокружении с функцией газотрансмиттера оксида азота (NO) в регуляции пролиферации и апоптоза соответствует современным представлениям.

Несмотря на то что физиологическая регуляторная функция двухатомного свободного радикала NO обнаружена чуть более 10 лет тому назад, он все еще находится в первых рядах исследований в области биомедицины. NO участвует в широком диапазоне паракринных и молекулярных сетей межклеточной сигнализации: регуляции тонуса сосудов, межклеточной коммуникации, модуляции нейротрансмиссии, иммунной цитотоксичности, секреции медиаторов и гормонов, а также является важной сигнальной молекулой в регуляции процессов воспаления [2]. Фармакологическая модуляция уровней NO в различных тканях имеет значительную терапевтическую ценность. NO генерируется синтазами в большинстве типов клеток путем ферментативных, а также неферментативных реакций. Измерение NO технически затруднено из-за его быстрых химических реакций с широким спектром молекул, таких как свободные радикалы, металлы, тиолы и др. [3]. Кроме того, показано, что одновременное торможение синтазы-2 оксида азота NOS₂ (индуцибельной синтазы оксида азота, iNOS) и циклооксигеназы (COX₂) недорогими фармацевтическими препаратами значительно снижает рост опухоли, что предполагает использование NOS₂ и COX₂ в качестве потенциала для терапевтической мишени при лечении агрессивного рака молочной железы [4]. NO является активным участником процессов пролиферации и апоптоза, обладая уникальной способностью инициировать или блокировать апоптоз. Апоптоз играет одну из главных ролей в патофизиологии эндометриоза, и это заключение основано на результатах экспериментальных и клинических исследований [5]. Имеются доказательства, что у женщин с эндометриозом снижена активность апоптоза в эутопическом эндометрии [6].

Дальнейшим этапом исследований является данная работа, выполненная для получения объективных результатов в определении роли iNOS и эндотелиальной (eNOS) синтазы оксида азота в сосудах эктопического эндометрия. Это необходимо для оценки значения процессов пролиферации и апоптоза в эпителии желез эктопического эндометрия в генезе активной и неактивной перитонеальной формы эндометриоза.

Цель исследования — сравнительное изучение уровня пролиферативной активности и экспрессии активаторов и ингибиторов апоптоза в железистом эпителии эктопического эндометрия при перитонеальной форме эндометриоза, а также содержания iNOS и eNOS в эндотелии сосудов для оценки их патогенетической роли в развитии активной и неактивной перитонеальной формы эндометриоза.

Выполнено ретроспективное одномоментное исследование, одобренное этическим комитетом ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России. Информированное согласие на участие в исследовании и использование крови и ткани эндометрия получено у всех пациенток.

Основная группа. Под наблюдением находились 29 женщин в возрасте 27—37 лет с перитонеальной формой эндометриоза, установленного во время проведения лапароскопии, как это описано нами ранее [7—9]. Больные распределены на две группы на основании уровней пролиферативного индекса (ПИ) в клетках железистого эпителия эктопического эндометрия. Очаги с уровнем ПИ <1 обозначены как имеющие низкую пролиферативную активность (неактивная перитонеальная форма эндометриоза, n=10), а очаги с уровнем ПИ <1 — высокую (активная перитонеальная форма эндометриоза, n=19).

Контрольная группа — 20 пациенток, которым произведена стерилизация с использованием лапароскопического доступа. Эндометриоз у пациенток этой группы исключали после исследования висцеральной и париетальной брюшины на наличие гетеротопических эндометриоидных очагов. Данные ультразвукового и гистероскопического исследования матки позволили исключить у пациенток этой группы наличие аденомиоза.

Характеристика образцов ткани и сыворотки крови. Образцы эутопического и эктопического эндометрия получены во время лапароскопии у пациенток контрольной группы и больных с эндометриозом в секреторную фазу LH+7 (±2) менструального цикла с учетом ежемесячной индивидуальной оценки и дня менструального цикла, а также согласно стандартным патоморфологическим критериям. Гетеротопии удаляли из мест, подозрительных в отношении роста эктопического эндометрия. Все образцы разделены на две части: одна предназначена для гистопатологического, а другая — для иммуногистохимического исследования. Верификацию гистологических диагнозов эутопического и эктопического эндометрия осуществляли в Академической больнице Уппсала, Швеция. По данным гистопатологического исследования, все образцы эктопического эндометрия содержали эндометриальный железистый эпителий, окруженный стромальной тканью и сосудами. Кровь для исследования получали из кубитальной вены в стандартных условиях у всех пациенток утром перед операцией.

Иммуногистохимический анализ. Окрашивание эутопического и эктопического эндометрия проводили в условиях стандартного протокола, как это описано нами ранее [9]. Неспецифического окрашивания не было. Серия образцов изучена как минимум 2 раза.

Пролиферативная активность. В качестве первичных антител использованы моноклональные мышиные антитела к белку Ki-67 — MIB-1, 1:300 («Immunotech S. A», Франция), в качестве вторичных — биотинилированные лошадиные антимышиные антитела («Vector Laboratories», США). Иммуногистохимическое окрашивание криообразцов аденокарциномы яичника человека использовано в качестве позитивного контроля. Экспрессия Ki-67 оценивалась двумя независимыми исследователями в 10 областях при 400-кратном увеличении микроскопа. ПИ рассчитывали как процент Ki-67-позитивных клеток.

Регуляторы апоптоза. В качестве первичных антител использованы мышиные антитела к ингибитору апоптоза Bcl-2 — anti-Bcl-2 (Clone 124, No M0887, 1:200) («Dako», Дания), кроличьи антитела к активатору апоптоза Bax — anti-Bax (δ21,sc-6236, 1:200), кроличьи антитела к активатору апоптоза Bak — anti-Bak (G-23: sc-832, 1:200) и кроличьи антитела к ингибитору апоптоза Bcl-x — anti-Bcl-х (S-18: sc-634, 1:200) («Santa Cruz Biotechnology», США). Позитивным контролем при окрашивании для оценки Bcl-2, Bcl-x, Bax и Bak служили криообразцы аденокарциномы яичника. В образцах группы позитивного контроля получено ожидаемое окрашивание.

Экспрессия NOS в эутопическом и эктопическом эндометрии. В качестве первичных антител использованы для iNOS: NOS2 (C-11): sc-7271 («Santa Cruz Biotechnology», США), для eNOS: NOS3 (A-9): sc-376751 («Santa Cruz Biotechnology», США). Позитивным контролем при окрашивании для оценки NOS₃ и NOS2 служили криообразцы миометрия. В образцах группы позитивного контроля получено ожидаемое окрашивание.

Интенсивность окрашивания. Интенсивность иммуногистохимического окрашивания в баллах (SCORE) оценивали в 5 предлежащих областях при 400-кратном увеличении: 0 — сравнима с негативным контролем, 1 — при слабом окрашивании (едва видно, но не более), 2 — между слабым и сильным окрашиванием, 3 — сильное окрашивание. Уровень SCORE не зависел от экспериментальных данных.

Определение содержания NOS. Содержание синтазы оксида азота в сыворотке крови и перитонеальной жидкости (нг/мл) определяли с использованием калориметрического метода (code K205−100, colorimetry abs 540 nm, 155 S) в соответствии с рекомендациями производителя («BioVision Inc.», США).

Статистический анализ. Для анализа результатов использовали статистические компьютерные программы PASW Statistics 18. Результаты исследования представлены как среднее и стандартное отклонение (М±SD). В зависимости от конкретных условий применяли парный или непарный t-тест Стьюдента, парный критерий Вилкоксона, U-критерий Манна—Уитни для независимых групп и попарного сравнения. Различия между группами считались статистически значимыми при p<0,05.

Описание обследованных больных. Проведенный сравнительный анализ клинических данных больных с неактивной перитонеальной формой эндометриоза (n=10) и активной перитонеальной формой эндометриоза (n=19), диагноз которого установлен во время проведения лапароскопии, показал отсутствие статистически значимых различий между группами, как описано нами ранее [9]. В основную группу включены женщины в соответствии со следующими критериями: репродуктивный возраст (от 27 до 37 лет), перитонеальная форма эндометриоза I—III стадии (согласно классификации Американского Общества Репродуктивной медицины) с клиническими проявлениями в виде нарушения менструальной функции (мено- и метроррагии), болей в нижних отделах живота и поясничной области различной интенсивности, диспареунии, бесплодия; верифицированный диагноз по данным лапароскопического исследования, отсутствие приема гормональных препаратов для лечения наружного генитального эндометриоза на протяжении 3 мес перед началом исследования. Критерии исключения: возраст больных старше 37 лет, наружный генитальный эндометриоз IV стадии, беременность, лактация, экстрагенитальная патология средней и тяжелой степени тяжести.

Оценка ПИ в железистом эпителии и сосудах эутопического и эктопического эндометрия в секреторную фазу у пациенток контрольной группы и больных с неактивной и активной перитонеальной формой эндометриоза. Результаты оценки ПИ в железистом эпителии (ПИ/ЭЖ) эутопического эндометрия у пациенток контрольной группы и эутопическом и эктопическом эндометрии у больных с перитонеальной формой эндометриоза представлены в табл. 1.

Оценка содержания NOS в сыворотке крови и перитонеальной жидкости у пациенток контрольной группы и больных с неактивной и активной перитонеальной формой эндометриоза. Результаты содержания NOS в сыворотке крови и перитонеальной жидкости у пациенток контрольной группы и больных с неактивной и активной перитонеальной формой эндометриоза представлены в табл. 2.

Уровень NOS в перитонеальной жидкости у пациенток контрольной группы и больных неактивной перитонеальной формой эндометриоза был в 1,74 и 1,93 раза ниже, чем в крови (соответственно), однако данные статистически незначимы. В то же время при активной форме заболевания это соотношение составило 0,9±0,2 за счет одновременного и статистически значимого увеличения уровня NOS. Следовательно, при неактивной перитонеальной форме эндометриоза содержание NOS в крови и перитонеальной жидкости соответствует норме, а при активной перитонеальной форме эндометриоза повышено в 4,2 раза в крови и 8,03 раза в перитонеальной жидкости по сравнению с контрольной группой.

Оценка экспрессии протеинов iNOS и eNOS в эндотелии сосудов эутопического и эктопического эндометрия в секреторную фазу у пациенток контрольной группы и больных с неактивной и активной перитонеальной формой эндометриоза. Результаты изучения экспрессии представлены в табл. 3.

Оценка экспрессии протеинов группы Bcl-2 в железистом эпителии эутопического эндометрия в секреторную фазу у пациенток контрольной группы и больных с неактивной и активной перитонеальной формой эндометриоза. У пациенток контрольной группы и больных с неактивной и активной перитонеальной формой эндометриоза изучена экспрессия протеинов группы Bcl-2 в железистом эпителии эутопического и эктопического эндометрия. Результаты исследования представлены в табл. 4.

Оценка экспрессии протеинов группы Bcl-2 в железистом эпителии эктопического эндометрия в секреторную фазу у пациенток контрольной группы и больных с неактивной и активной перитонеальной формой эндометриоза. Показатели экспрессии протеинов группы Bcl-2 в железистом эпителии эктопического эндометрия у пациенток контрольной группы и больных с неактивной и активной перитонеальной формой эндометриоза представлены в табл. 4. Экспрессия активаторов апоптоза (Bak, Bax) и ингибиторов апоптоза (Bcl-2, Bcl-x) статистически значимо повышена в эктопическом эндометрии при активной форме заболевания. Отношение Bak к Bcl-2 при активной форме эндометриоза статистически значимо снижалось (0,59±0,1) в отличие от неактивной формы заболевания (1,5±0,2). Следовательно, при активной перитонеальной форме эндометриоза в эктопическом эндометрии наблюдается превалирование ингибиторов апоптоза над активаторами, а при неактивной — активаторов над ингибиторами. Данное несоответствие наиболее выражено в эктопическом эндометрии при активной форме эндометриоза за счет минимального соотношения Bak и Bcl-2 (0,59±0,1).

Описание экспрессии iNOS, eNOS в сосудах и протеинов апоптоза группы Bcl-2 в эпителии желез эктопического и эутопического эндометрия у больных с неактивной и активной перитонеальной формой эндометриоза (блок-схема). Суммируя результаты проведенного исследования, мы сочли целесообразным объединить полученные данные в блок-схеме (см. рисунок).

Как следует из блок-схемы, воспаление в микроокружении в эктопическом эндометрии у больных с перитонеальной формой эндометриоза сочетается с нитрозативным стрессом и сопровождается разнонаправленными реакциями: «высокая экспрессия iNOS — нормальная экспрессия eNOS» и «нормальная экспрессия iNOS — нормальная экспрессия eNOS». При варианте «высокая экспрессия iNOS — нормальная экспрессия eNOS» в сосудах одновременно происходит низкая экспрессия Bak, Bax и высокая — Bcl-2, Bcl-x в эпителии желез эутопического и эктопического эндометрия. Эти реакции приводят к ингибированию апоптоза, что находит свое отражение в усилении пролиферации клеток и развитии активной формы эндометриоза. Риск увеличения степени распространенности и склонности к рецидивам является высоким. При варианте «нормальная экспрессия iNOS — нормальная экспрессия eNOS» в сосудах одновременно происходят высокая экспрессия Bak, Bax и низкая экспрессия Bcl-2, Bcl-x в эпителии желез эутопического и эктопического эндометрия. Это приводит к активации апоптоза, подавлению пролиферации и переходу процесса в неактивную фазу. Риск увеличения степени распространенности и склонности к рецидивам является низким.

Известно, что от уровня нитрозативного стресса зависят развитие, прогрессирование, а также тактика лечения опухолей. Он проявляет себя как отрицательный или положительный регулятор апоптоза. При нормальных показателях уровня NO происходит ингибирование многочисленных сигнальных путей в здоровых и опухолевых клетках. Высокие концентрации NO (моль—миллимоль) обычно способствуют апоптозу, т. е. проявляют цитотоксичность. Кроме того, микроокружение опухоли, в котором преобладают низкие уровни кислорода и глюкозы, может быть более чувствительным к высоким уровням NO, чем нормальные ткани [10].

NO в макрососудах подавляет воспаление и адгезию, что приводит к уменьшению тромбоза и тем самым способствует поддержанию кровотока. В микрососудах и особенно в капиллярах NO, наряду с ангиогенными факторами роста сосудов, играет важную роль в процессах ремоделирования и формирования новых сосудов [11].

Известно, что iNOS индуцируется цитокинами [12], а еNOS приводит к вазодилатации [13]. Эти данные литературы явились базовыми для проведения настоящего исследования. При этом мы предполагали, что в случае увеличения экспрессии iNOS в сосудах эутопического и эктопического эндометрия эти изменения следует объяснять влиянием цитокинов; в случае увеличения экспрессии eNOS — суммарным эффектом вазодилатации сосудов. В то же время сопоставление воспаления в микроокружении со степенью участия в этих процессах газотрансмиттера NO, например за счет индукции интерлейкинов, могло расширить наше представление о роли NO в регуляции пролиферации и апоптоза.

Проведенные ранее исследования показали, что в пролиферативный потенциал ткани эктопического эндометрия вносят свой вклад эпителий желез и эндотелий сосудов. При неактивной форме эндометриоза содержание NOS в крови и перитонеальной жидкости находится в пределах нормы, а при активной форме эндометриоза повышено в 4,2 раза в крови и в 8,03 раза в перитонеальной жидкости по сравнению с показателями у пациенток контрольной группы. К сожалению, полученные результаты касались только общей активности NOS на системном уровне и не отражали распределение по типам NOS. Тем не менее эти данные свидетельствуют о том, что наибольшее содержание NOS выявлено в перитонеальной жидкости при активной перитонеальной форме эндометриоза. Учитывая, что в перитонеальной жидкости наблюдается увеличение уровня интерлейкина IL-6 при перитонеальной форме эндометриоза, следует полагать, что данные процессы индуцированы повышенным содержанием IL-6 [1]. Это утверждение подтверждается данными иммуногистохимического исследования о том, что активная форма эндометриоза характеризуется повышением экспрессии индуцибельной iNOS в эндотелии сосудов эндометрия вне зависимости от локализации, а экспрессия эндотелиальной eNOS носит базовый характер и находится в пределах нормы.

Накопление NOS в перитонеальной жидкости и повышение экспрессии iNOS в сосудах эктопического эндометрия, несомненно, создают условия воздействия NO на предлежащие органы и ткани. К числу результатов такого воздействия следует отнести пролиферативную активность и апоптоз. В ходе выполнения работы показано, что при активной перитонеальной форме эндометриоза в эутопическом и эктопическом эндометрии наблюдается превалирование ингибиторов апоптоза над активаторами, при неактивной форме — превалирование активаторов над ингибиторами. Учитывая, что активная форма эндометриоза характеризуется повышением ПИ в эпителии желез и эндотелии сосудов, можно утверждать, что такое воздействие осуществляется не только на процесс апоптоза, но и на пролиферативный потенциал тканей. Остается неизученным вопрос, как все эти компоненты системы — газотрансмиттер NO, пролиферативный потенциал и апоптоз — активируются при воспалении в микроокружении очагов эндометриоза, которое сопровождает активную перитонеальную форму эндометриоза. К факторам, оказывающим такое воздействие, следует отнести неинфекционный трансмиттер, индуцирующий воспаление — VIP [1]. Участие VIP в качестве активатора воспаления позволяет объединить основные и разнонаправленные пути патогенеза развития эндометриоза.

В работе, опубликованной в 2012 г., мы высказали предположение о двух возможных механизмах изменения экспрессии активаторов и ингибиторов апоптоза в эктопическом эндометрии: 1) эндометриозные клетки являются генетически стойкими к апоптозным стимулам; 2) перитонеальная жидкость у больных с эндометриозом ингибирует апоптозные стимулы в эндометриальных тканях [14].

В проведенном настоящем исследовании считаем доказанным предположение о роли накопления газотрансмиттера NO в перитонеальной жидкости за счет воспаления в микроокружении и увеличения содержания в тканях IL-6 и VIP. В результате этих процессов усиливается пролиферативный потенциал и снижается апоптоз клеток эпителия желез эктопического эндометрия. Источником NO является повышенная экспрессия iNOS в эндотелии сосудов эктопического эндометрия.

Эти данные согласуются с исследованиями [15], которые показали, что перитонеальная форма эндометриоза связана с повторными воспалительными изменениями в брюшной полости. Цитокины и NOS действуют совместно и приводят к повышению уровня NOS в перитонеальной жидкости, тем самым способствуя поддержанию хронического воспаления.

Установлено, что при акценте профилирования экспрессии молекулярных иммуногистохимических маркеров в эутопическом и эктопическом эндометрии на фоне патоморфологического контроля у больных эндометриозом не получено прямых данных о малигнизации [9]. Считаем возможным предположить, что повышенная экспрессия iNOS при активной форме эндометриоза приводит к повышению уровня NO и усилению цитотоксического воздействия последнего, что в свою очередь снижает вероятность малигнизации эндометриозных очагов. Следовательно, высокие концентрации оксида азота могут вызывать гибель клеток в эктопическом эндометрии при активной перитонеальной форме эндометриоза, несмотря на повышение пролиферативной активности и снижение показателей апоптоза. Эти данные согласуются с мнением D. Hirst и T. Robson [16] о влиянии NO на эффективность лечения рака.

Таким образом, в настоящее время накоплен большой объем знаний о роли синтаз оксида азота и их сопряженности с механизмами регуляции пролиферации и апоптоза клеток. Результаты собственных исследований показали, что в пролиферативный потенциал ткани эктопического эндометрия вносят свой вклад и эпителий желез, и эндотелий сосудов. При неактивной перитонеальной форме эндометриоза содержание синтаз оксида азота в крови и перитонеальной жидкости находится в пределах нормы, а при активной форме эндометриоза — повышено в 4,2 раза в крови и в 8,03 раза в перитонеальной жидкости. Активная перитонеальная форма эндометриоза характеризуется повышением экспрессии индуцибельной синтазы оксида азота в эндотелии сосудов эндометрия вне зависимости от места их локализации. Экспрессия эндотелиальной синтазы оксида азота носит базовый характер. При активной перитонеальной форме эндометриоза в эутопическом и эктопическом эндометрии наблюдается превалирование ингибиторов апоптоза над активаторами, а при неактивной — активаторов над ингибиторами. Результатами проведенного исследования доказано влияние индуцибельной и эндотелиальной синтаз оксида азота эндотелия сосудов на пролиферативную активность и апоптоз клеток в эпителии желез эктопического эндометрия при эндометриозе. Эти процессы могут являться одними из основных факторов, обусловливающих и поддерживающих воспаление в микроокружении очагов эндометриоза в местах локализации эктопического эндометрия. Полученные результаты могут быть использованы для оценки риска увеличения степени распространенности и склонности к рецидивам перитонеальной формы эндометриоза.

Благодарность. Выражаем благодарность professor Matts Olovsson (Department of Women’s and Children’s Health, Uppsala University, Uppsala, Sweden) за участие в обсуждениях и содействие. Работа выполнена по теме «Изучение ассоциации между эндометриальными маркерами эутопического и эктопического эндометрия и тазовой болью у женщин с эндометриозом», учетный номер Минобрнауки в НТИМИ 0431/01/15. Финансовая, научная, правовая и политическая поддержка осуществлялась Шведской Королевской Академией наук; Шведским медицинским Исследовательским Советом (грант № 8683); Фондом планирования семьи в Уппсале; Университетом Уппсалы, Швеция; ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва, Россия и Минздравом России.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Б.В.А., И.Н.А.

Сбор и обработка материала — Б.В.А., И.Н.А.

Статистическая обработка — Б.В.А., И.Н.А.

Написание текста — Б.В.А., И.Н.А.

Редактирование — Б.В.А., И.Н.А.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Сведения об авторах

Владимир Алексеевич Бурлев — врач, д.м.н., проф., ведущий научный сотрудник ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва, Россия; 117997, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4; e-mail: vladimir.burlev@kbh.uu.se, vbourlev@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-5271-2478

Наталья Александровна Ильясова — врач, научный сотрудник ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва, Россия; 117997, Москва, ул. Академика Опарина; д.4; е-mail: natalia.ilyasova @kbh.uu.se, natalia_ilyasova@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-0665-3515

КАК ЦИТИРОВАТЬ:

Бурлев В.А., Ильясова Н.А. Нитрозативный стресс при эндометриозе. Проблемы репродукции; 2019;25(3):-19. https://doi.org/10.17116/repro201925031

Автор, ответственный за переписку: В.А. Бурлев — д.м.н., проф., ведущий научный сотрудник ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова»; e-mail: bourlev@mail.ru