Тератозооспермия и кариопатологические изменения клеток крови при гранулоцитарном анаплазмозе человека в связи с полиморфизмом гена GSTM1 глутатион-S-трансферазы

Внимание исследователей [1], изучающих клещевые инфекции, все больше привлекает гранулоцитарный анаплазмоз человека (ГАЧ). До недавнего времени считалось, что анаплазмы способны инфицировать только домашних и сельскохозяйственных животных. Установлено, что у крупного рогатого скота, инфицированного анаплазмами, в клетках крови обнаружены повышенный уровень цитогенетических нарушений в виде появления в крови клеток с микроядрами, которые образуются в результате отставания в митозе целых хромосом и их фрагментов [2]. Кроме того, у больных животных наблюдаются существенные патологические изменения органов репродукции, сопровождающиеся выраженной тератозооспермией и бесплодием [3].

Ранее нами показано, что у больных такими клещевыми инфекциями, как клещевой энцефалит и иксодовый клещевой боррелиоз, в случае носительства делеции гена GSTM1(0/0) фермента глутатион-S-трансферазы наблюдаются тератозооспермия и повышенная частота встречаемости цитогенетических аберраций в соматических клетках [4—6]. Однако в литературе мы не нашли исследований, посвященных изучению способности инфекции, вызывающей ГАЧ, индуцировать тератозооспермию или/и цитогенетические нарушения у больных людей.

Цель исследования — оценить роль гранулоцитарного анаплазмоза человека (ГАЧ), вызванного Anaplasma phagocytophilum, в формировании кариопатологических изменений клеток крови и развитии тератозооспермии в зависимости от полиморфизма гена GSTM1 глутатион-S-трансферазы.

Обследованы 39 лиц мужского пола с ГАЧ, находившихся на лечении в инфекционных отделениях больниц Тюмени и Томска в период 2008—2016 гг. Пациентов для исследования отбирали методом сплошной выборки среди больных ГАЧ. Контрольную группу составили 30 мужчин, являющихся донорами станций переливания крови. Возраст больных составил 34,3±3,8 года, доноров контрольной группы — 33,5±4,7 года. Материалом для кариопатологического анализа служили венозная кровь и семенная жидкость, полученные до начала лечения. У всех больных в анамнезе зарегистрированы присасывание клеща и симптоматика, характерная для ГАЧ. Большинство из обследованных больных жаловались на отсутствие либидо, резкую утрату полового влечения, что и послужило одним из мотивов для изучения у них патологических изменений сперматозоидов в семенной жидкости. Предварительно у каждого обследованного получено информированное согласие на проведение настоящего исследования. Исследование одобрено Этическим комитетом ФГБОУ ВО «Сибирский государственный медицинский университет» Минздрава России (протокол № 560 от 15.11.09) и проведено в соответствии с требованиям Хельсинкской декларации Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2000 г., а также правилами «О порядке проведения биомедицинских исследований у человека» (2002) и «Правилами клинической практики» (Приказ Минздрава России № 266 от 19.06.03).

Диагноз ГАЧ установлен на основании клинико-эпидемиологических данных и подтвержден лабораторно с использованием метода темнопольной микроскопии мазков крови с выявлением интрацитоплазматических морул анаплазм в инфицированных нейтрофилах, иммуноферментного анализа с выявлением в сыворотке крови специфических иммуноглобулинов IgМ и IgG к возбудителю ГАЧ (тест-системы ЗАО «Омникс», Россия), а также с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) (тест-системы ЗАО «Синтол», Россия) в соответствии с рекомендациями производителей. Критериями включения в исследование были: подтверждение диагноза ГАЧ, возраст от 20 до 60 лет. Критериями исключения были: наличие микстинфекций, вызванных другими возбудителями, передающимися иксодовыми клещами (клещевой энцефалит, иксодовый клещевой боррелиоз и др.), тяжелая соматическая патология, рентгенологическое обследование в течение 2 мес до исследования.

Для анализа аллелей гена GSTM1 выполняли полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в режиме реального времени с использованием амплификатора Терцик (Россия). ДНК для ПЦР выделяли из проб венозной крови [4, 6]. Продукты амплификации и рестрикции ампликонов разделяли в горизонтальном 3% агарозном геле с применением камеры для горизонтального электрофореза ЕС 12−13 («Биоком», Москва, Россия). Знак «+» означает присутствие ПЦР-продуктов, и данный донор может быть либо гетерозиготен, GSTM1(+/0), либо гомозиготен, GSTM1 (+/+) по нормальному активному аллелю. Мутантный генотип GSTM1(0/0) означает отсутствие на электрофореграмме фрагмента, и данный индивидуум гомозиготен по делеции, что приводит к резкому снижению активности фермента [5, 7].

Проведены следующие цитологические исследования с изучением частоты различных типов интерфазных клеток с кариопатологическими нарушениями: моноцитов крови с микроядрами и протрузиями ядра, двуядерностью, хроматинолизом, фрагментозом, кариорексисом, кариопикнозом и вакуолизацией ядра, нейтрофилов крови с гиперсегментированностью, хроматинолизом и фрагментозом ядра, эритроцитов крови с микроядрами, сперматозоидов в мазках семенной жидкости с патологическими изменениями головки (размера, формы, акросомальной области и числа головок), шейки и хвоста. Кроме того, семенная жидкость изучена на предмет лейкоцитоспермии. Особое внимание при этом обращали на присутствие в сперме инфицированных нейтрофилов, содержащих интрацитоплазматические морулы анаплазм. Известно, что для морфологически нормального сперматозоида характерна овальная форма головки, длина ее составляет 5—6 мкм, ширина — 2,5—3,5 мкм, акросомальный участок занимает от 40 до 70% площади головки, при этом отсутствуют аномалии шейки и хвоста [7]. Для изучения размеров головки использовали окуляр-микрометр. Микроскопически анализировали не менее 1000 моноцитов, нейтрофилов и эритроцитов крови, а также сперматозоидов. Методики приготовления цитологических мазков и их анализ изложены нами ранее [8].

Статистическую обработку осуществляли с использованием пакета статистических программ Statistica v.10.0 («StatSoft Inc.», США). Частоты гаплотипов сцепленных локусов для гена GSTM1 рассчитывали в программе The EH software program («Rockefeller University», США). Все количественные показатели исследования обрабатывали с применением корреляционного анализа по Спирмену и t-критерия Стьюдента для независимых выборок, поскольку тестирование закона распределения при помощи критерия Колмогорова—Смирнова не выявило отличий от нормального. Анализ статистических различий качественных признаков проводили с использованием теста χ² с поправкой Йейтса на непрерывность [9]. Различия сравниваемых результатов (X±m, где X — выборочное среднее арифметическое, m — ошибка среднего арифметического) считали достоверными при p<0,05.

Установлено, что у больных ГАЧ в первые дни болезни наблюдался статистически значимо повышенный уровень практически всех регистрируемых типов кариопатологий клеток крови и тератозооспермии в семенной жидкости по сравнению с участниками контрольной группы (табл. 1).

Анализ морфологических изменений сперматозоидов показал значительное увеличение в семенной жидкости больных ГАЧ частоты сперматозоидов с дефектами головки в виде изменений ее размеров, формы, аномалий акросомальной области или появления сперматозоидов с двойной головкой, а также повышения частоты патологии шейки (p<0,01 во всех случаях). Сперматозоидов с дефектами в области хвоста не выявлено. Значительно повышен уровень патологически измененных сперматозоидов у больных — носителей гомозиготного нулевого генотипа GSTM1 (0/0). Например, частота встречаемости сперматозоидов с увеличенным или уменьшенным размером головки у больных с нулевым гомозиготным генотипом GSTM1 (0/0) составила 162,5±10,5‰, а с нормальным аллелем GSTM1(+) — 67,2±4,9‰ (p<0,01). Такая же закономерность прослеживается и относительно других аномалий сперматозоидов. В целом число аномальных сперматозоидов у носителей нулевого гомозиготного генотипа превышает таковой у больных ГАЧ с нормальным аллелем GSTM1(+) в 1,8 раза (555,1±19,3‰ против 308,5±16,8‰; p<0,01).

Цитологический анализ клеток крови обследованных нами больных ГАЧ показал статистически значимое увеличение частоты морфологической патологии ядра по сравнению со здоровыми донорами (p<0,05 или p<0,01). Вакуолизация ядра, которая свидетельствовала о его деструктивных апоптотических изменениях, часто сочеталась с другими кариопатологическими изменениями в моноцитах крови. Ранняя деструкция ядра цитологически начиналась как перинуклеарная вакуоль [8]. У больных ГАЧ носителей мутантного GSTM1(0/0) этот показатель в моноцитах крови равен 5,2±0,7‰, а у здоровых доноров группы контроля — лишь 1,32±0,38‰ (p<0,01). В то же время у больных ГАЧ с функционирующим аллелем GSTM1(+) частота клеток с перинуклеарной вакуолью составила 3,9±0,5‰ против 0,7±0,2‰ у участников контрольной группы (p<0,01). Апоптотические процессы в ядре клетки могут выглядеть как хроматинолиз, при этом хроматин теряет свою нормальную структуру и растворяется. Ядро окрашивается в светлый цвет, но контуры его сохраняются. У больных — носителей мутантного аллеля GSTM1(0/0) частота таких клеток превышала уровень у участников контрольной группы в 1,9 раза (p<0,01). Такое же соотношение отмечено и в отношении носителей нормального аллеля GSTM1(+). Фрагментоз — это расщепление ядра на отдельные фрагменты, которые часто связаны с ядром тонкими нитями базихроматина. Частота таких клеток выше у больных — носителей с делецией GSTM1(0/0) гена по сравнению с больными, имеющими нормальный аллель GSTM1(+) (p<0,01). То же самое можно сказать и о таком типе цитопатологии, как двуядерные моноциты (p<0,01). Анализ последних показал идентичность размеров, структуры хроматина и интенсивности окраски ядер в бинуклеарах. Это может свидетельствовать в пользу вывода о том, что такие клетки формируются в результате блокады цитокинеза и не являются следствием слияния или аномального деления клеток. Кариорексис — это распад ядра на отдельные резко пикнотичные, темные, округлые фрагменты, которые не связаны между собой; он наблюдается на заключительном этапе гибели клетки путем апоптоза и часто происходит при формировании многогруппового аномального митоза [8]. Частота таких патологических изменений значимо выше в обеих подгруппах больных с мутантным и нормальным геном GSTM1 по сравнению со здоровыми донорами (p<0,01). Однако статистически значимых различий у обследуемых обеих групп не установлено (р>0,05).

Анализ уровня клеток крови с микроядрами и протрузиями (см. табл. 1) позволяет сделать вывод о том, что анаплазмы способны вызывать поражения хромосомного аппарата клеток крови. Причем значимое повышение по сравнению со здоровыми донорами такого рода цитогенетических нарушений наблюдается не только в моноцитах, но и в эритроцитах (p<0,01). Совершенно очевидно, что в этом случае изменения должны возникать на ранних этапах эритропоэза и моноцитопоэза на стадии делящихся бластных клеток. Поскольку большинство наблюдаемых микроядер в клетках имеют мелкие размеры (менее 3 мкм), то можно предположить, что это результат образования ацентрических фрагментов хромосом, которые отстают при делении клетки и в телофазе митоза формируют микроядра. Высказано мнение, что в основе патогенного действия Anaplasma phagocytophilum лежит повышение активности катепсина L в нейтрофилах крови [10], который способствует возникновению одноцепочечных разрывов ДНК и образованию микроядер [8]. Как известно, ГАЧ сопровождается существенными изменениями гуморального и клеточного звеньев иммунного ответа [1]. Значительную роль в устранении цитогенетически измененных клеток играют Т-клетки и натуральные киллеры. Т-клеточный иммунодефицит, как правило, сопровождается существенным увеличением числа цитогенетически измененных клеток [11]. Известно, что анаплазмы в виде морул локализуются в сегментоядерных нейтрофилах крови. Проведенное нами исследование показало наличие в крови больных ГАЧ статистически значимо повышенного числа клеток с гиперсегментированным ядром, а также прогрессирующий процесс хроматинолиза и фрагментоза ядра клетки. Наличие нейтрофилов с морулами анаплазм в сперме позволяет предположить, что окислительный стресс, связанный с эффектами этих клеток может вызвать некоторые морфологические изменения сперматозоидов [10]. По мнению S. Sinclair и соавт. [12], на сегодняшний день единственными прокариотическими нуклеомодулинами, которые непосредственно связываются с ДНК млекопитающих и влияют на окружающий хроматин клеток хозяина, являются нуклеомодулины бактерии семейства Anaplasmataceae. Поскольку при темнопольной микроскопии нами зарегистрировано присутствие инфицированных нейтрофилов в эякуляте больных ГАЧ, то вполне возможно, что именно с этим эффектом действия анаплазм на ДНК связаны наблюдаемые нами кариопатологические нарушения в клетках крови и аномалии морфологии сперматозоидов семенной жидкости.

При анализе сперматозоидов у больных ГАЧ отмечен случай глобозооспермии, когда головка сперматозоида исключительно маленьких размеров и не имеет акросомы. Мы склонны считать, что одновременное отставание нескольких хромосом при делении клетки может приводить к появлению крупных микроядер и формированию сперматозоидов с маленькой головкой. Кластогенные процессы в клетках больных, сопровождающиеся аномальным расхождением нескольких хромосом при некоторых клещевых инфекциях, показаны нами ранее [5]. Образование двуядерных моноцитов статистически значимо (p<0,01) коррелировало с изменением формы головки, а также с появлением у больных ГАЧ, являющихся носителями делеции GSTM1 гена, сперматозоидов, имеющих 2 головки (табл. 2).

Непропорциональная генерация реактивных форм кислорода (ROS), включающих супероксид-анион радикал, пероксид водорода, гидроксильные радикалы, а также секреция реактивных форм оксида азота (RNS) иммуноцитами при инфекционных заболеваниях вызывают повреждение клеточных макромолекул, включая ДНК и ферменты [11, 13—15].

Это позволяет предположить, что цитогенетический эффект анаплазм может быть обусловлен окислительным стрессом, вызванным внедрением паразита в организм [13, 15]. Под влиянием ROS в клетках происходит разрушение тубулиновых волокон ахроматинового аппарата деления, что способствует аномальному расхождению хромосом в митозе, приводящему к формированию микроядер [8].

Наличие тесной связи между частотой цитогенетических аномалий в соматических клетках и патологией сперматозоидов продемонстрировано в многочисленных исследованиях; авторы указывают, что этот феномен цитогенетической нестабильности сопровождается мужским бесплодием [16, 17].

В результате исследования установлено, что у мужчин, больных гранулоцитарным анаплазмозом человека, существенно возрастает уровень тератозооспермии в эякуляте и кариопатологических изменений клеток крови по сравнению со здоровыми лицами. Существенное увеличение частоты моноцитов и эритроцитов с микроядрами в периферической крови у больных гранулоцитарным анаплазмозом человека позволяет сделать вывод об индукции повышенного уровня цитогенетических аберраций при этой инфекции. Нами впервые установлено, что у таких больных с делеционным полиморфизмом гена GSTM1 (0/0) обнаружены наиболее высокий уровень различных типов кариопатологических изменений клеток крови и тератозооспермии, а также имеется корреляционная зависимость между морфологической патологией головки сперматозоидов и некоторыми типами кариопатологических нарушений в клетках крови.

Благодарность: работа выполнена при поддержке гранта Российского фонда фундаментальных исследований (№ 06−44−700149).

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — И.Н.

Сбор и обработка материала — С.А., Н.В.

Статистическая обработка — С.А., Н.В.

Написание текста — И.Н., И.Е.

Редактирование — И.Е., Н.В.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.