Несомненно, что среди известных и идентифицированных белков эндометрия для оценки уровня эндометриальной рецептивности будут иметь значение только те, которые реагируют или отвечают изменением уровня экспрессии в ответ на повышение уровня прогестерона.

В 1997 г. в работе M. Gruidl и соавт. [10] было показано, что белок alphaB-crystallin был прогрессивно выражен во время секреторной фазы, хотя его роль в эндометрии все еще неизвестна. Кодирование alphaB-crystallin белка мРНК было также идентифицировано в эндометрии на LH+7 по сравнению с LH+2 [18].

Малые белки теплового шока (БТШ), к которым относится alphaB-crystallin, действуют как ограниченные молекулярные чапероны, предотвращая необратимое скопление и осаждение денатурированных белков [16].

AlphaB-crystallin оказывает цитопротективное действие через аутопротеолиз путем ингибирования caspase-3, и тем самым непосредственно взаимодействует с апоптозом [11]. Так, аlphaB-crystallin передает раковым клеткам устойчивость к апоптозу, вызванному TNF-зависимым апоптозиндуцированным лигандом (TRAIL) [12].

Известно, что alphaB-crystallin обладает свойствами ангиогенного модулятора, регулируя трубчатый морфогенез и выживание эндотелиальных клеток во время васкуляризации опухоли [9]. Кроме того, alphaB-crystallin, взаимодействуя с HSP27 в миометрии человека, модулирует актин цитоскелета [13].

Исследований, связанных с изучением роли alphaB-crystallin в наступлении беременности у человека или других млекопитающих, в доступной нам литературе не удалось установить.

Цель исследования — изучить интенсивность экспрессии alphaB-crystallin, сосудисто-эндотелиального фактора роста (СЭФР-А) и его рецептора (СЭФР Р-1), плотности микрососудов в структурах эутопического и эктопического эндометрия в норме и у больных с перитонеальной формой эндометриоза в период окна имплантации и провести анализ этих данных в зависимости от наступления беременности в спонтанном цикле в течение 6 мес после хирургического и гормонального лечения.

Под наблюдением находились 38 женщин в возрасте 27—37 лет с перитонеальной формой эндометриоза, диагностированного во время проведения лапароскопии, и бесплодием. Рандомизация и подбор больных осуществлялись совместно с д.м.н. Т.Е. Самойловой и к.м.н. М.А. Шороховой. Клиническая характеристика больных была представлена нами ранее [4]. Исследование одобрено этическим комитетом ФГБУ «НЦАГиП им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России. Информированное согласие на участие больных в исследовании было получено у всех пациенток.

Критерии включения в исследование: женщины репродуктивного возраста (от 27 до 37 лет); перитонеальная форма эндометриоза I—III стадии, согласно классификации Американского общества репродуктивной медицины [17], бесплодие, отсутствие приема других гормональных препаратов для лечения наружного генитального эндометриоза на протяжении 3 мес перед началом исследования. Клинические проявления наружного генитального эндометриоза: нарушение менструальной функции (мено- и метроррагии), боли в нижних отделах живота и поясничной области различной интенсивности, диспареуния, бесплодие.

Критерии исключения: возраст пациентки старше 37 лет, наружный генитальный эндометриоз IV стадии, аллергические реакции на гозерелин ацетат, беременность, лактация, средняя и тяжелая экстрагенитальная патология.

Всем пациенткам были выполнены оперативные вмешательства путем лапароскопии с использованием оборудования фирмы «Karl Stors» (Германия): иссечение и/или коагуляция очагов наружного генитального эндометриоза, разделение спаек в области малого таза, сальпингоовариолизис. В процессе операции с целью исключения внутриматочной патологии производилась жидкостная гистероскопия с помощью жесткого гистероскопа с микрогистероскопической насадкой и наружным диаметром 88 мм («Karl Stors», Германия), а также диагностическое выскабливание слизистой матки.

Согласно дизайну исследования, для проведения консервативной терапии после лапароскопии больные получали в послеоперационном периоде курс терапии аналогом ГнРГ (гозерелина ацетат) по 3,6 мг ежемесячно, подкожно в течение 3 мес, интервал между введением препарата составлял 28—30 дней. По окончании консервативного лечения больные наблюдались в течение 6 мес. В течение этого срока у 17 женщин наступила беременность — ЭБ (+), а у 21 не наступила беременность — ЭБ (–). Наступление беременности наблюдалось в нормальных овуляторных циклах, без индукции овуляции или применения методов ВРТ.

Контрольную группу составили 20 пациенток, которым производилась стерилизация с использованием лапароскопического доступа. Эндометриоз в этой группе исключался после тщательного исследования висцеральной и париетальной брюшины на наличие гетеротопических эндометриоидных очагов. Ультразвуковое и гистероскопическое исследования матки позволили исключить у пациенток этой группы наличие аденомиоза.

Ультразвуковое исследование органов малого таза у больных проводилось до оперативного лечения и после окончания курса терапии с помощью аппарата Aloka SSD-2000 с использованием трансвагинального датчика с частотой 7,5 МГц.

Кровь для исследования получали из кубитальной вены в стандартных условиях у всех пациенток утром до операции. Образцы сыворотки и перитонеальной жидкости хранились при –70 °С до момента исследования. Все образцы биопсии эндометрия были получены в LH+7 (±2), исходя из ежемесячной оценки фазы менструального цикла и дня менструального цикла образцов эндометрия, согласно стандартным критериям.

Иммуногистохимический (ИГХ) анализ. Образцы тканей эутопического эндометрия были разделены на две части, одну из которых направили на морфологическое исследование, другую — подвергали консервированию в растворе формалина для ИГХ-анализа. По данным патоморфологического исследования все полученные образцы представляли собой ткань эндометрия.

Оценка экспрессии alphaB-crystallin и соответствующее распределение по клеточным элементам выполнены при использовании полуколичественной системы гистологической шкалы (HSCORE) [30]: Σ Pi(i+1), где i — интенсивность окрашивания (от 0 — слабое окрашивание до 3 — самое интенсивное окрашивание), Pi — процент окрашивания эпителиальных клеток для каждой интенсивности от 0 до 100%. Доказано, что система HSCORE является надежным инструментом оценки экспрессии эндометриальных белков по отношению к количественному определению методом обратной транскриптазной полимеразной цепной реакции (RT-qPCR).

Анализ экспрессии СЭФР-А и его рецептора СЭФР Р1 в эутопическом и эктопическом эндометрии проводился с использованием метода ИГХ в условиях стандартного протокола, как это было описано нами ранее [1, 2, 8]. Результаты учитывали с помощью цифровой обработки данных и программы Image-Pro Plus (версия 4.0 for Windows) и выражали в условных единицах (усл. ед.): 0 усл. ед. — отсутствие реакции, 1 усл. ед. — от 0,1 до 33,3%, 2 усл. ед. — от 33,3 до 66,6%, 3 усл. ед. — от 66,6 до 99,9%. Процент реакции вычислялся от максимального значения экспрессии. Для визуализации использовали моноклональные антитела к alphaB-crystallin, СЭФР-А, СЭФР-Р1 («Dako» Denmark A/S). Учет результатов всех лабораторных исследований осуществлялся В.А. Бурлевым и Н.А. Ильясовой.

Определение плотности микрососудов (ПМС) проводили, как было описано ранее [7, 8], в стандартных условиях с использованием метода ИГХ и последующей цифровой обработкой данных с помощью программы Image-Pro Plus (версия 4.0 for Windows). Все результаты выражались в усл. ед. в мм². Для визуализации микрососудов использовали моноклональные антитела к CD31 (Dako, Denmark A/S).

Анализ сыворотки крови. Анализ содержания alphaB-crystallin, СЭФР-А, растворимого рецептора 1 к СЭФР (рСЭФР Р1) в сыворотке крови и в перитонеальной жидкости проводился с помощью ИФА с применением стандартных наборов (R&D systems, США). Проведение реакции и расчет результатов осуществляли в стандартных условиях, согласно рекомендациям производителя.

Статистический анализ. Для анализа результатов использовали статистические компьютерные программы IBM SPSS Statistics 20. Результаты исследования представлены как средние±стандартное отклонение (М±SD). В зависимости от конкретных условий применялись: ANOVA, критерий Вилкоксона, U-критерий Манна—Уитни, критерий Круаскала—Уоллиса. Различия между группами считались достоверными при p<0,05.

Характеристика больных. Клинические данные у обследованных больных с перитонеальной формой эндометриоза с наступившей ЭБ (+) и ненаступившей беременностью ЭБ (–) не имели статистически значимых различий.

Содержание в крови и в перитонеальной жидкости alphaB-crystallin, СЭФР-А, рСЭФР Р1 в норме и у больных с перитонеальной формой эндометриоза в зависимости от наступления или ненаступления беременности после лечения. Как следует из данных табл. 1, максимальные и статистически значимые показатели содержания alphaB-crystallin установлены в сыворотке крови и в перитонеальной жидкости в группе больных с ненаступившей беременностью после лечения. Так, содержание alphaB-crystallin в крови было повышено в 12 раз по отношению к норме и в 8,7 раза по отношению к больным с наступившей беременностью. Достоверных различий между содержанием alphaB-crystallin в крови и в перитонеальной жидкости у пациенток обследованных групп не установлено. Анализ содержания СЭФР-А и рСЭФР Р1 в крови и в перитонеальной жидкости в зависимости от наступления беременности показал наличие статистически значимых различий между нормой и больными с эндометриозом, но в группах больных с наступившей или ненаступившей беременностью различий не установлено. Сравнение содержания СЭФР-А и рСЭФР Р1 в крови и в перитонеальной жидкости установило достоверно значимые различия в сторону увеличения в перитонеальной жидкости в норме и отсутствие значимых различий в группах больных с эндометриозом.

Экспрессия alphaB-crystallin и показателей ангиогенеза в середине секреторной фазы эутопического эндометрия в норме и у больных с перитонеальной формой эндометриоза в зависимости от наступления или ненаступления беременности после лечения. Из табл. 2 следует, что экспрессия alphaB-crystallin в эутопическом эндометрии выявляется только в цитозоле эпителия желез в норме, у больных ЭБ (+) и ЭБ (–). В поверхностном эпителии и в клетках стромы такой экспрессии не установлено. Отмечается статистически значимое снижение экспрессии alphaB-crystallin у больных с эндометриозом, у которых после лечения не наступила беременность. Различий в экспрессии alphaB-crystallin в норме и у больных с наступившей беременностью не выявлено. Отсутствовали различия в экспрессии СЭФР-А в изученных группах, экспрессия СЭФР Р-1 была достоверно снижена в группе с ненаступившей беременностью по отношению к контролю и группе с наступившей беременностью. В то же время плотность микрососудов в 1 мм² была достоверно выше у больных с ненаступившей беременностью по отношению к норме и к группе пациенток с наступившей беременностью.

Экспрессия alphaB-crystallin и показателей ангиогенеза в середине секреторной фазы эктопического эндометрия у больных с перитонеальной формой эндометриоза в зависимости от наступления или ненаступления беременности после лечения. Как следует из табл. 3, экспрессия alphaB-crystallin в эпителии желез эктопического эндометрия была статистически достоверно снижена в группе с ненаступившей беременностью по отношению к группе с наступившей беременностью. Экспрессия СЭФР-А и СЭФР Р-1 в эпителии желез не имела статистически значимых различий между обследованными группами. В то же время ПМС в 1 мм² была статистически значимо повышена у больных с ненаступившей беременностью.

Распределение больных в зависимости от интенсивности экспрессии alphaB-crystallin в эпителии желез эутопического эндометрия в норме и у больных с перитонеальной формой эндометриоза с наступившей ЭБ (+) и ненаступившей беременностью ЭБ (–). Учитывая вариабельность результатов экспрессии alphaB-crystallin в эпителии желез эутопического эндометрия было проведено распределение больных в зависимости от интенсивности этой экспрессии. Результаты представлены в табл. 4, из которой следует, что в норме 90% больных имеют среднюю интенсивность экспрессии (HSCORE 1,1—2,0) и только у 5 и 5% больных соответственно наблюдается сильная (HSCORE 2,1—3,0) и низкая экспрессия (HSCORE 0,1—1,0). В случае наступления беременности у больных с перитонеальной формой эндометриоза эти показатели статистически не значимо не отличались от группы контроля и были представлены соответственно 82,3, 5,9, 11,8%. У больных с ненаступившей беременностью наблюдались статистически значимые различия в распределении экспрессии alphaB-crystallin по отношению к контрольной группе и больных с наступившей беременностью. Средние значения экспрессии (HSCORE 1,1—2,0) наблюдались только у 9,5% больных (в норме у 90% больных), сильная экспрессия (HSCORE 2,1—3,0) — у 38,1% больных (в норме у 5%), низкая экспрессия (HSCORE 0,1—1,0) — у 52,4% больных (в норме у 5%). Следовательно, для нормы и больных с наступившей беременностью характерна средняя экспрессия alphaB-crystallin, а для больных с ненаступившей беременностью — сильная и низкая экспрессии.

Сравнительная фенотипическая характеристика экспрессии alphaB-crystallin, ПМС, СЭФР-А, СЭФР Р1, PGP9.5, ЭР, ЭР-α, ЭР-β, ПР-А+В, ПР-В, IL-1RI, IL6-Rα, LIF, LIF-Rα, gp130, SOCS1, L-Sel, MEKA-79 в эндометрии у больных с эндометриозом и бесплодием в зависимости от наступления или ненаступления беременности. Исходя из того, что в течение 2010—2015 гг. нами проведены исследования по поиску молекулярных предикторов наступления или ненаступления беременности у больных с перитонеальной формой эндометриоза, считали возможным представить обобщающие данные с учетом полученных результатов [3—5, 14, 15]. В табл. 5 приведены диагностические данные о 18 эутопических эндометриальных ИГХ-предикторах наступления или ненаступления беременности у больных с перитонеальной формой эндометриоза. Показатель alphaB-crystallin характерен для стресса, показатели ПМС, СЭФР-A, СЭФР Р1 — для ангиогенеза, показатель PGP9.5 — для нервных микроволокон, показатели ЭР, ЭР-α, ЭР-β, ПР-А+В, ПР-В — для рецепторов к стероидам, показатели IL-1RI, IL6-Rα, LIF, LIF-Rα, gp130, SOCS1 — для интерлейкинов, показатели (L-Sel, MEKA-79) — для молекул адгезии. Приведенные показатели охватывают наиболее значимые процессы, которые могут участвовать в формировании бесплодия обусловленного недостаточной функциональной активностью эутопического эндометрия. Характерными нарушениями в эндометрии для ненаступления беременности являются:

— высокий или низкий уровень экспрессии белков стресса (alphaB-crystallin);

— высокая активность ангиогенеза (ПМС);

— высокий уровень нервных микроволокон (PGP9.5);

— высокая активность рецепторов эстрадиола (ЭР-α) и низкая активность рецепторов прогестерона (ПР-А+В, ПР-В);

— низкая активность интерлейкинов, приводящая к нарушению сигнального пути LIF;

— высокая активность L-Sel и низкая его лиганда (MEKA-79).

Регуляция функциональной активности эндометрия, нацеленной на подготовку ткани для нидации бластоцисты и наступления беременности, является сложным процессом с вовлечением различных молекулярных механизмов. Так, рецепторы эстрогена и прогестерона с момента их открытия были объектами для многочисленных исследований в эутопическом эндометрии у женщин с и без эндометриоза [4]. Наличие инфламоторного компонента в эндометрии у больных с эндометриозом также нашло отражение в публикациях о роли интерлейкинов в наступлении беременности [5].

Недостаточно изучена роль эктопического эндометрия и перитонеальной жидкости в оценке влияния на функциональную активность яичника, созревания яйцеклеток и активации сигнальных путей у эмбриона по мере прохождения его в маточной трубе и кратковременной инкубации в матке [3, 6].

Роль БТШ в разрешении конфликтных и стрессорных ситуаций в организме, несомненно, многообразна и не до конца изучена. Способность этих белков не допускать денатурацию и сохранять функциональную активность белковых субстратов выдвигает их на первое место среди многих систем, обеспечивающих полноценную жизнедеятельность клеточных организаций. У всех БТШ есть одна общая функция — защита клетки от неблагоприятных воздействий, хотя механизмы этой защиты различны, включая непосредственное участие всех БТШ в защите клеточных белков от разных видов денатурации, окисления, стресс-индуцированного апоптоза и стабилизации клеточных структур.

Известно, что БТШ синтезируются в ответ на стресс у всех видов организмов — от бактерии до человека. Их спектры видоспецифичны, однако у каждого вида можно выделить три группы белков, отличающихся по молекулярной массе и их функциям в клетке: БТШ90 — группа белков, которые у дрожжей имеют молекулярную массу 104 кД, у млекопитающих — 90 кД, а у Drosophila — 83 кД; БТШ70 — семейство белков с молекулярной массой 70 кД; БТШ — малые — с молекулярной массой от 15 до 30 кД, включая alpha-crystallin и betta-crystallin млекопитающих.

Впервые alphaB-crystallin был обнаружен в хрусталике и стекловидном теле глаза, и в настоящее время ведутся интенсивные исследования его роли в патологии зрительной системы. Несомненно, вызывает удивление, что профиль биохимических изменений alphaB-crystallin в глазе аналогичен или близок к событиям в эндометрии при эндометриозе, и его связь с наступлением беременности. Остается только восхищаться тем, что эволюционный процесс способен использовать аналогичные белки для различных целей, но для защиты от повреждений и сохранения целостности организма. Alpha-crystallin — это молекулы с массой около 700 кД, состоящие из 35—40 субъединиц с массой около 20 кД. Существуют два основных типа: alphaA-crystallin и alphaB-crystallin, возникшие в результате дупликации гена-предшественника около 500 млн лет назад. Точная трехмерная структура все еще остается предметом дискуссии, но все современные модели сходятся на группировке субъединиц 20 кД в большую глобулярную структуру диаметром до 16 нм. Такие большие молекулы, казалось бы, должны рассеивать свет; тот факт, что этого не происходит, и то, что хрусталик прозрачен как вода, означает, что alpha-crystallin имеет какую-то специфическую форму. Была определена аминокислотная последовательность alpha-crystallin многих видов животных, которая демонстрирует очень медленные изменения в геологических масштабах времени, а потому пригодна для установления их эволюционного взаимоотношения [9, 12, 16].

В настоящее время не существует единой точки зрения для объяснения интегративных процессов в эндометрии для оценки феномена наступления беременности при различных патологических состояниях, сопровождающихся бесплодием. Научные публикации [1, 2] о роли ангиогенеза при эндометриозе свидетельствуют о значительных изменениях в этой системе при эндометриозе. К сожалению, в этих работах отсутствуют сведения о причинах, приводящих к патологическим процессам за исключением гипоксии как универсального индуктора ангиогенеза [1]. Попытки поиска иных причин, приводящих к усилению ангиогенеза при эндометриозе, пока не установлены. Полученные данные в ходе выполнения работы свидетельствуют о роли alphaB-crystallin для прямой модуляции ангиогенеза в эутопическом и эктопическом эндометрии при перитонеальной форме эндометриоза и бесплодии. Аналогичные данные были получены A. Dimberg и соавт. [9] о роли alphaB-crystallin при опухолевом ангиогенезе. В дополнение к этому alphaB-crystallin в эутопическом эндометрии можно рассматривать и как универсальный модулятор для поддержки ядерных и мембранных рецепторов к прогестерону и эстрадиолу, полноценному проявлению функции антиинфламаторных белков и синхронизации процессов между эндометрием и эмбрионом. Недостаток и избыточная продукция alphaB-crystallin приводят к неоправданной денатурации белков, их повреждению и снижению функциональной активности эндометрия.

Таким образом, проведенные исследования по изучению содержания alphaB-crystallin в крови и в перитонеальной жидкости свидетельствуют о его 8—12-кратном увеличении у больных с перитонеальной формой эндометриоза и ненаступлением беременности после лечения. Оценка экспрессии alphaB-crystallin в эутопическом эндометрии показала, что она была снижена в эпителии желез эутопического эндометрия у больных с эндометриозом и ненаступлением беременности по отношению к больным с наступлением беременности или здоровым женщинам. Уровень экспрессии alphaB-crystallin у больных с эндометриозом и наступившей беременностью были подобные тем, что и у здоровых женщин. Высокий или низкий уровень экспрессии alphaB-crystallin соответствовал шансам ненаступления беременности. Данные в эутопическом эндометрии соответствовали результатам эктопического эндометрия. Проведенная оценка экспрессии alphaB-crystallin свидетельствует о том, что он может использоваться как биомаркер эндометриальной восприимчивости, а определение экспрессии alphaB-crystallin является прогностическим значимым для рецептивности эутопического эндометрия и наступления беременности у больных с эндометриозом.

Благодарности. Выражаем благодарность professor Matts Olovsson, Department of Women’s and Children’s Health, Uppsala University, Uppsala, Sweden за участие в обсуждениях и поддержку. Работа выполнена по теме: «Изучение ассоциации между эндометриальными маркерами и фертильностью у женщин с и без эндометриоза» (учетный номер в НТИМИ № 0465/03/10). Финансовая, научная, правовая и политическая поддержка осуществлялась Шведской Королевской Академией наук, Шведским медицинским Исследовательским советом (гранд № 8683), Фондом планирования семьи в Уппсале, Университетом Уппсалы, Швеция, ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинаталогии им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России и Минздравом России.

Конфликт интересов отсутствует.