Влияние перорального введения субстанции наночастиц железа на функциональное состояние органов репродуктивной сиcтемы самок мышей с экспериментальной железодефицитной анемией

Несмотря на современные достижения медицины и фармации в эффективном лечении заболеваний различного генеза, железодефицитная анемия (ЖДА) все еще остается одной из нерешенных проблем, а наиболее уязвимой группой по развитию железодефицитных состояний и ЖДА являются женщины репродуктивного возраста и беременные женщины [1]. Развитие ЖДА у женщин обусловлено не только дефицитом попадания железа в организм, но и потерями крови различной этиологии вследствие различных гинекологических заболеваний.

Современный рынок лекарственных препаратов предлагает внушительный арсенал противоанемических препаратов, которые по форме железа в них делятся на две группы: препараты солей железа и препараты железосодержащих комплексов. Однако недостаточная эффективность и безопасность препаратов для лечения ЖДА, связанные со сниженной биодоступностью элементарного железа и, как следствие, необходимостью назначения препаратов железа в сравнительно высоких дозах, обусловливают поиск потенциальных субстанций для создания лекарственных средств с применением нанотехнологий. Ключевым свойством вещества в наноразмерном диапазоне является повышенная биологическая и фармакологическая активность. Значительными перспективами в этом направлении характеризуются наночастицы ноль-валентного железа (Fe⁰) (НЧЖ), обладающие высокой активностью в окислительно-восстановительных процессах [2] и являются потенциальной фармацевтической субстанцией для разработки нового эффективного противоанемического лекарственного средства. Однако на сегодняшний день биологическое воздействие наночастиц Fe⁰ в условиях invitro и invivo изучено недостаточно [3, 4] и требует дальнейшего исследования.

При оценке потенциальных противоанемических свойств субстанции наночастиц железа актуальной становится оценка их влияния на функциональное состояние органов женской репродуктивной системы с использованием животных в условиях экспериментального моделирования состояния ЖДА.

Цель настоящей работы — исследовать функциональное состояние женской репродуктивной системы на моделях животных с экспериментальной ЖДА в условиях перорального введения НЧЖ.

Экспериментальную субстанцию сферических наночастиц ноль-валентного железа (НЧЖ) синтезировали в Институте биоколлоидной химии им. Ф.Д. Овчаренко НАН Украины по оригинальному протоколу химической конденсации в водной среде путем восстановления хлорида железа (ІІІ). Среди различных методов, используемых для синтеза наночастиц металлов медицинского назначения, метод химической конденсации в водной среде является одним из наиболее приемлемых. Основным его преимуществом является возможность получать стерильные, биосовместимые, монодисперсные и стабильные во времени субстанции.

На рис. 1 приведена физико-химическая характеристика (размер, форма и химический состав) синтезированной субстанции НЧЖ: данные трансмиссионной электронной микроскопии (см. рис. 1, а) и рентгеноструктурного микроанализа химического состава частицы (см. рис. 1, б).

Использованные в работе НЧЖ сферической формы, средний размер 40 нм, содержание железа (Fe) 100%. Отсутствие в структуре частицы кислорода свидетельствует о том, что такие наночастицы являются частицами ноль-валентного железа.

Субстанция НЧЖ была охарактеризована как биобезопасное и биосовместимое по показателям цитотоксичности, генотоксичности, мутагенности, физиологического маркера «состояние микрофлоры желудочно-кишечного тракта человека» и биохимических параметров (ATФaза и лактатдегидрогеназная активность) в соответствии с критериями и протоколами Методических рекомендаций «Оценка безопасности лекарственных нанопрепаратов», утвержденных Научно-экспертным советом Государственного экспертного центра Минздрава Украины (протокол № 8 от 26.09.13).

Субстанция относится к V классу токсичности (практически нетоксичные вещества) — LD50 при внутрижелудочном введении самкам мышей линии BALB/c превышает 5000 мг/кг. Расчет условно-терапевтической дозы НЧЖ для подопытных животных осуществляли путем пересчета рекомендованной средней суточной терапевтической дозы железа для человека (2,85 мг/кг) с учетом коэффициента видовой устойчивости (5,89). Суточная условно-терапевтическая доза субстанции НЧЖ для мыши составила 16,8 мг/кг. Раствор экспериментальной субстанции НЧЖ подопытным животным вводили перорально с помощью зонда однократно ежедневно в течение 10 сут.

Исследования проводились с соблюдением основных положений Конвенции Совета Европы об охране позвоночных животных, используемых в экспериментах и в других научных целях, от 18.03.86, директивы ЕС № 609 от 24.11.86, приказа Минздрава Украины № 66 от 13.02.06 и закона Украины № 3447-IV «О защите животных от жестокого обращения» от 21.02.06.

Опыты проводили на самках мышей линии ВАLB/с. Экспериментальную ЖДА у подопытных животных с начальной массой 15—16 г моделировали путем их содержания на железодефицитной диете в течение 2 мес. Корм и дистиллированную воду животные получали adlibitum. Контрольных условно-здоровых животных содержали на диете с нормальным содержанием железа [5]. Средняя масса животных и ее стандартная ошибка в начале курса введения НЧЖ составляли 23,2±0,4 г.

Подопытные животные были разделены на три группы: 1-я группа — контрольные условно-здоровые животные (n=5); 2-я группа — животные с экспериментальной ЖДА без введения НЧЖ (контроль анемии, n=5); 3-я группа — животные с экспериментальной ЖДА, которым в течение 10 дней per os вводили раствор субстанции НЧЖ в условно-терапевтической дозе (16,8 мг/кг в сутки; n=12). Животным из контрольных групп (1-я и 2-я группы) в течение 10 сут вводили per os эквивалентные объемы растворителя субстанции — воду для инъекций.

Как маркерные показатели воздействия субстанции НЧЖ в условиях перорального введения в крови подопытных животных определяли концентрацию гемоглобина, величину гематокрита и количество эритроцитов.

Концентрацию гемоглобина (г/л) в крови подопытных животных определяли гемихромным методом с использованием набора стандартного диагностикома для клинико-диагностических и биохимических лабораторий производства ООО НПП «Филисит-Диагностика» (Днепропетровск, Украина), согласно протоколам производителя. Оптическую плотность проб измеряли с помощью фотоэлектроколориметра КФК-3 (Россия).

Подсчет эритроцитов и определение величины гематокрита в крови подопытных животных проводили по стандартным методикам.

Для анализа мейотического созревания ооцитов in vitro из яичников мышей выделяли ооциты и подсчитывали их количество (без кумулюсных клеток или в составе кумулюсно-ооцитарных клеточных комплексов). Морфологические исследования ооцитов проводили под микроскопом МБС-10 (Россия). Определяли состояние зародышевого пузырька; перивителлинового пространства и цитоплазмы, а именно: плотность, степень гранулированности, признаки фрагментации и дегенерации. Контрольные экспериментальные ооциты культивировали в одинаковых условиях (стерильный бокс, камеры по 0,4 мл культуральной среды DМЕ с 15 ммоль/л HEPES, концентрация кальция 1,71 ммоль/л, температура 37 °C, продолжительность 20 ч). После 2 ч культивирования подсчитывали ооциты (% к общему количеству), которые находились на стадии метафазы І — растворение зародышевого пузырька, а после 20 ч — на стадии метафазы II — формирование первого полярного тельца.

Исследование сократимости матки проводили с применением метода фазнографического анализа. Для регистрации силы изометрических сокращений изолированные полоски цервикального и овариального отделов матки переносили в камеру, фиксировали и соединяли в консоли механоэлектрического преобразователя силы в электрический сигнал. Камеру перфузировали раствором Кребса (37 °С, pH 7,29). Силу изометрических сокращений регистрировали с помощью быстродействующего самописца Н3021−3. Равномерность перфузии препарата омывающими растворами обеспечивалась перистальтическим насосом НП-1М. Во время эксперимента осуществляли термостатирование растворов и экспериментальной плексигласовой камеры в целом. Базовую активность регистрировали в течение 20 мин.

Для количественной характеристики спонтанных фазных сокращений использовали параметры сократимости: амплитуда сокращения (мН), частота сокращения (ЧС, количество в 1 с), продолжительность активного состояния (Т, с), скорость сокращения (CVmax, мН/с) и скорость расслабления (RVmax, мН/с). Индекс сократимости (ИС, мН) — произведение амплитуды сокращения и отношения скорости сокращения к скорости расслабления — рассчитывали по формуле: ИС = Fmax × CVmax/RVmax.

Проверку полученных данных на нормальность распределения проводили по тесту Колмогорова—Смирнова. При нормальном распределении статистическую обработку результатов при сравнении двух групп данных проводили с использованием критерия t Стьюдента с помощью программы GraphPad Prism version 5.00 for Windows (GraphPad Software, San Diego California, США). Изменения показателей считали статистически достоверными с уровнем значимости более 95% (р<0,05).

Данные о величинах маркерных показателей крови у самок мышей с экспериментальной ЖДА после 10-кратного введения экспериментальной субстанции НЧЖ приведены в таблице.

Полученные данные показали, что у животных, которые в течение 2 мес содержались на железодефицитной диете, наблюдается развитие железодефицитного состояния с начальными проявлениями анемии. Это состояние сопровождается снижением концентрации гемоглобина в крови в среднем на 10%, количество эритроцитов на 13% и величина гематокрита на 8% в сравнении с аналогичными показателями для условно-здоровых животных (см. таблицу).

Десятикратное пероральное введение субстанции НЧЖ животным с экспериментальной ЖДА приводило к нормализации маркерных показателей до уровня соответствующих значений у контрольных условно-здоровых животных. Это дает основания утверждать, что вводимая субстанция НЧЖ обладает противоанемическими свойствами.

У животных с экспериментальной ЖДА обнаружено: уменьшение количества ооцитов, которые выделялись из одного яичника: значение этого показателя составило 8,0±1,0 при 15,0±1,0 шт/яч в контроле (1-я группа; p<0,01), а также уменьшение количества ооцитов на стадии метафазы I (с растворенным зародышевым пузырьком) до 49,01±5,44 при 74,08±1,98% в контроле и уменьшение количества ооцитов на стадии метафазы ІІ (формирование первого полярного тельца) до 15,03±2,48 при 55,88±3,85% в контроле (р<0,01 и р<0,001 соответственно).

Десятикратное пероральное введение животным с экспериментальной ЖДА субстанции НЧЖ (3-я группа) не вызывает достоверного увеличения количества ооцитов, которые выделялись из одного яичника мыши: 10,0±1,0 шт/яч по сравнению с 8,0±1,0 шт/яч животных 2-й группы. Вместе с тем наблюдается улучшение качества выделяемых ооцитов, а именно: увеличение количества ооцитов на стадии метафазы I до 69,17±3,63% (р<0,05; n=4); (3-я группа) при 49,01±5,44% (2-я группа), а также увеличение количества ооцитов на стадии метафазы ІІ до 27,95±3,29% (р<0,05; n=4) при 15,03±2,48% (2-я группа) (рис. 2).

Таким образом, у животных, которые содержались в течение 2 мес на железодефицитной диете, развитие железодефицитного состояния приводило к уменьшению количества ооцитов в яичнике и ухудшению их мейотического созревания in vitro. Десятикратное пероральное введение экспериментальной субстанции НЧЖ животным с экспериментальной ЖДА не вызывало достоверного увеличения количества ооцитов, которые выделялись из одного яичника, однако способствовало улучшению качества таких ооцитов.

В условиях экспериментальной ЖДА (2-я группа) в цервикальном отделе матки наблюдается уменьшение: амплитуды до 0,48±0,09 мН (р<0,001; n=4) при 1,50±0,09 мН в контроле; ИС до 0,82±0,08 мН (р<0,001; n=4) при 2,8±0,08 мН в контроле; CVmax до 0,11±0,02 мН/с (р<0,001; n=4) при 0,38±0,09 мН/с в контроле; RVmax до 0,07±0,02 мН/с (р<0,001; n=4) при 0,24±0,02 мН/с в контроле; Т до 4,75±0,52 с (р<0,001; n=4) при 7,63±1,71 с в контроле; величина ЧС не меняется.

В овариальном отделе матки выявлено уменьшение: амплитуды до 0,41±0,12 мН (р<0,001; n=4) при 0,91±0,21 мН в контроле; ИС до 0,65±0,1 мН (р<0,001; n=4) при 1,46±0,38 мН в контроле; CVmax до 0,11±0,03 мН/с (р<0,001; n=4) при 0,35±0,14 мН/с в контроле; RVmax до 0,07±0,02 мН/с (р<0,001; n=4) при 0,38±0,13 мН/с в контроле; Т до 4,25±0,56 с (р<0,001; n=4) при 11,68±1,25 с в контроле; величина ЧС не меняется.

Таким образом, в условиях десятикратного введения экспериментальной субстанции НЧЖ животным с экспериментальной ЖДА (3-я группа) и в цервикальном, и в овариальном отделах матки величины амплитуды, ИС, CVmax, RVmax, Т, ЧМ статистически не изменяются по сравнению с соответствующими средними значениями у животных с экспериментальной ЖДА (2-я группа).

ВОЗ относит железодефицитное состояние и ЖДА к 10 основным факторам риска, которые повышают заболеваемость и смертность населения [6]. В мире самая высокая заболеваемость анемией детей дошкольного возраста составляет 47,4%, самая низкая среди мужчин — 12,7%. Основными причинами анемии называют дефицит железа, а также полидефицитные состояния [7]. В наших опытах у животных, которых содержали в течение 2 мес на железодефицитной диете, происходит уменьшение количества ооцитов в яичнике и in vitro угнетение мейотического созревания таких ооцитов. Эти результаты расширяют и согласуются с данными о том, что даже умеренный дефицит железа (железодефицитное состояние), при котором ЖДА еще не диагностируется, приводит к комплексу трофических и функциональных нарушений всех органов и систем. Последствиями этого могут быть задержка и нарушения физического, нервно-психического, психомоторного, полового развития, патологические изменения иммунного статуса, дискоординация и ухудшение в функционировании эндокринной, сердечно-сосудистой, нервной систем и желудочно-кишечного тракта [6].

Известно, что наночастицы оксидов железа, в частности, магнетита (Fe3O4), стимулируют обмен железа в организме и усиливают эритропоэз. Это является основой изучения и клинического применения ферумокситола — первого инъекционного лекарственного средства, содержащего наночастицы оксида железа, предназначаемого для лечения ЖДА у взрослых пациентов с хронической болезнью почек [8]. Но несмотря на эффективность ферумокситола, продемонстрированную в клинических испытаниях, вопрос безопасности этого нанопрепарата окончательно не решен [9].

Мы применяли наночастицы ноль-валентного железа (Fe⁰) сферической формы, размером 40 нм, со 100% содержанием железа (Fe). В наших опытах десятикратное пероральное введение НЧЖ животным с экспериментальной ЖДА приводило к нормализации маркерных показателей до уровня соответствующих значений у контрольных условно-здоровых животных. Это дает основания утверждать, что введенная субстанция НЧЖ обладает противоанемическими свойствами, в связи с чем целесообразно сравнить эффективность их применения с таковой препарата ферумокситол (на основе наночастиц оксида железа с модифицированной поверхностью, размер частиц 17—31 нм) (ferumoxytol, «AMAG Pharmaceuticals Inc.», США) [10].

Недавно установлено, что после инъекции мышам наночастиц Fe2O3 в дозе 10 мг/кг происходит угнетение сократимости мезентериальных артерий [11]. Нами впервые показано, что десятикратное пероральное введение НЧЖ животным с экспериментальной ЖДА не влияло на параметры сократимости цервикального и овариального отделов матки и количество ооцитов, которые выделялись из одного яичника, однако способствовало улучшению качества таких ооцитов.

Механизмы действия наножелеза активно изучают. Так, в условиях invitroпоказано, что под влиянием наночастиц Fe⁰ и продуктов их окисления (Fe²⁺ и Fe³⁺) происходит образование реактивных соединений кислорода и окислительное повреждение эпителиальных клеток бронхов у человека [12]. В исследовании эффекта частичного окисления («старение») и модификации поверхности наночастиц Fe⁰ потенциальную нейротоксичность в условиях invitro на культурах клеток микроглии (BV2) и нейронов (N27) грызунов установлено, что частичное или полное окисление наночастиц Fe⁰ приводит к понижению их окислительно-восстановительной активности, вероятно снижает токсичность относительно клеточных культур млекопитающих [4]. Установлено, что наночастицы Fe3O4 размером 35 нм при семикратном внутрибрюшинном введении в дозе 40 мг/кг мышам вызывают нарушения антиоксидантно-прооксидантного равновесия в тканях печени и почек, в пользу чего свидетельствует увеличение уровня маркеров оксидативного стресса [13]. Таким образом, данные об образовании свободных радикалов путем окисления металлического железа (Fe⁰) ставят вопрос о возможности участия в механизмах действия НЧЖ такого радикала, как оксида азота.

1. Экспериментальная ЖДА угнетает сократимость матки, а также приводит к уменьшению количества ооцитов в яичнике и ухудшению мейотического созревания ооцитов in vitro у самок мышей линии ВАLB/с.

2. Десятикратное пероральное введение субстанции наночастиц железа самкам мышей с экспериментальной ЖДА способствует нормализации величин маркерных показателей крови до уровня у контрольных условно-здоровых животных, что является свидетельством проявления ее противоанемической активности, а также приводит к улучшению показателей мейотического созревания ооцитов in vitro.

Работа выполнена в рамках научной программы отдела иммунофизиологии Института физиологии им. А.А. Богомольца НАН Украины: «Исследование молекулярно-генетических и иммунопатологических механизмов функциональных нарушений женской репродуктивной системы и возможности их коррекции», государственный регистрационный номер темы 0112U008233 и целевой комплексной программы фундаментальных исследований НАН Украины «Фундаментальные проблемы наноструктурных систем, наноматериалов, нанотехнологий» по договору № 119-Н.