Несмотря на большое количество исследований, посвященных проблеме эндометриоза, вопросы его этиологии и патогенеза до сих пор не нашли своего полного решения и остаются предметом дискуссий. Именно недостаточное понимание основных механизмов развития этого заболевания не позволяет проводить его раннюю диагностику и добиться высокой эффективности лечения [1-3].

В настоящее время многими авторами [4, 5] показана важная роль перитонеальной жидкости (ПЖ) в формировании и поддержании роста гетеротопического эндометрия. ПЖ - специфическая микросреда, содержащая различные биоактивные соединения, которые секретируются перитонеальными макрофагами, клетками эндометриоидных гетеротопий и клетками эндотелия [6, 7]. Основными биологическими модуляторами, локализованными внутри этой микросреды и способными влиять на течение метаболических процессов в вышеуказанных клетках, являются белки. В данном аспекте весьма информативными могут быть исследования с использованием последних достижений медицинской протеомики, позволяющих оценить динамическую совокупность белков исследуемого объекта (протеом) [8]. Изучение протеомной динамики, очевидно, является необходимым условием для понимания молекулярных механизмов, приводящих к формированию и развитию эндометриоза [9].

Цель настоящей работы - изучение протеомного спектра ПЖ при эндометриозе.

В проспективное исследование включены 20 пациенток репродуктивного возраста (средний возраст 29,3±0,3 года). Основная группа включала 10 женщин с гистологически верифицированным после проведения оперативного лечения диагнозом наружного генитального эндометриоза 3-4-й стадии, согласно классификации Американского общества фертильности (r-AFS,1985). Контрольную группу составили 10 пациенток без эндометриоза, проходивших обследование по поводу бесплодия. Все пациентки имели нормальную массу тела. Из исследования были исключены пациентки с миомой матки и аденомиозом. Материалом исследования служила ПЖ, полученная из позадиматочного пространства при выполнении лапароскопии.

Протеомные карты ПЖ получали с помощью двухмерного электрофореза в полиакриламидном геле, который включал в первом направлении изо­электрическое фокусирование (IPG-стрипы pH 3,0-10,0, прибор Protean IEF Cell, «Bio-Rad», США), во втором - вертикальный электрофорез (8-16,5% гель, прибор Protean II xi Multi-Cell, «Bio-Rad», США). Для получения аналитических гелей использовали загрузку белка - 180 мкг/гель. Окрашивание белковых пятен осуществляли азотнокислым серебром, затем фореграммы сканировали и анализировали с использованием пакета программ PDQuest («Bio-Rad», США). После вырезания белкового пятна из геля и процедуры трипсинолиза идентификацию белков проводили методом времяпролетной матрично-ассоциированной лазерной десорбции/ионизации (matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry - MALDI-TOF) масс-спектрометрии [10]. Масс-спектры триптических пептидов получали на масс-спектрометре Autoflex II («Bruker», Германия) и анализировали с использованием опции Peptide Fingerprint программы Mascot MS Search («Matrix Science», США) и баз данных NCBI и Swiss-Prot. Результаты идентификации белков принимались как достоверные при уровне значимости не менее 95% и показателе сиквенс-покрытия не менее 60%.

Достоверность различий в протеомном спектре ПЖ женщин контрольной и основной групп определяли с помощью &khgr;²-критерия и четырехпольных таблиц сопряженности, используемых при анализе качественных признаков (программа Statistica версия 6.0. фирма «StatSoft Inc.»). Достоверными считались различия при p<0,05.

Протеомный профиль ПЖ характеризуется значительной гетерогенностью (до 260 электрофоретических фракций с диапазонами молекулярных масс от 10 до 130 кД и границами изоэлектрических точек от 5,0 до 8,5). Большинство белков обнаруживается у пациенток обеих групп. В то же время выявлен ряд белков отличия, присутствие или отсутствие которых имеет место только при эндометриозе (см. таблицу, рисунок).

В протеомном спектре ПЖ при эндометриозе отсутствуют 11 белков, из которых идентифицировано пять: фактор дифференцировки пигментного эпителия, транстиретин, гаптоглобин, α1-антитрипсин и ингибитор апоптоза 6.

Фактор дифференцировки пигментного эпителия (pigment epithelium-derived factor - PEDF) является одним из наиболее мощных антиангиогенных и антипролиферативных факторов. Этот секретируемый гликопротеин относится к семейству ингибиторов сериновых протеиназ. По некоторым данным, основным механизмом антиапоптозного действия PEDF на клетки является активация транскрипционного фактора NF-­&xgr;B [11]. Свое антиангиогенное действие PEDF реализует, с одной стороны, индуцируя выработку Fas-­лигандов эндотелиальными клетками, что приводит к Fas­-опосредованному апоптозу клеток развивающихся сосудов. С другой стороны, PEDF противодействует эффекту ангиогенных факторов, прежде всего сосудисто-эндотелиального фактора роста (СЭФР) [12].

Установленное нами отсутствие PEDF можно объяснить выявленным ранее повышением содержания СЭФР в ПЖ при эндометриозе [13]. Увеличение синтеза последнего в условиях локальной гипоксии при вышеуказанной патологии индуцирует продукцию матриксных металлопротеиназ 2 и 9, которые расщепляют PEDF, связанный с компонентами внеклеточного матрикса [11]. Уменьшение уровня PEDF при эндометриозе может быть одной из причин, приводящих к снижению эндометриального апоптоза и усилению ангиогенеза, способствуя имплантации и росту гетеротопий.

Еще один белок, не обнаруженный в ПЖ женщин основной группы, - транстиретин (тироксин­связывающий преальбумин) осуществляет транспорт тиреоидных гормонов, выполняя функцию поддержания пула несвязанных Т3 и Т4 в ответ на потребности тканей-мишеней [14].

Отсутствие транстиретина в ПЖ, по-видимому, создает локальный избыток гормонов щитовидной железы, токсическое действие которых приводит к поражению репродуктивных органов. Тиреоидные гормоны, модулируя эффекты эстрогенов на клеточном уровне, могут способствовать развитию нарушений гисто- и органогенеза гормоночувствительных структур и ухудшению течения эндометриоза [15].

Среди белков, не выявленных в ПЖ, важные функции выполняет секретируемый макрофагами ингибитор апоптоза 6 (apoptosis inhibitor 6, Api6, также называемый Spα). Он играет важную роль в регуляции иммунного ответа: подавляет апоптоз Т-лимфоцитов и естественных киллеров (NK-клеток), а также блокирует продукцию иммуноглобулинов [16]. Результаты исследований [17] показали, что при эндометриозе на локальном уровне наблюдается уменьшение активности Т-лимфоцитов и NK-клеток. Дефицит активности Т-лимфоцитов может способствовать имплантации и развитию заносимых в брюшную полость эндометриоидных клеток. В свою очередь развитие очагов эндометриоза повышает выработку иммуносупрессивных агентов, которые определяют дальнейшее понижение активности NK-клеток, ослабление иммунного контроля и прогрессирование данного заболевания [18].

Возможно, именно нарушение экспрессии Api6 приводит к формированию вышеописанного дисбаланса иммунокомпетентных клеток в ПЖ.

Учитывая роль гаптоглобина как неферментативного антиоксиданта [19], можно полагать, что его отсутствие в ПЖ вносит вклад в усиление окислительного стресса, развивающегося при эндометриозе.

При указанной патологии в ПЖ также не обнаружен α1-антитрипсин - основной представитель семейства ингибиторов сериновых протеаз (таких как нейтрофильная эластаза, коллагеназа и др.), которые непосредственно вовлечены в процессы инвазии эндометриальных клеток. По данным литературы [20], при эндометриозе имеют место существенные сдвиги в показателях активности многих протео­литических ферментов. По-видимому, это может быть связано с нарушением баланса в системе протеаза-ингибитор в сторону недостатка последнего.

Наряду с отсутствием вышеуказанных белков в ПЖ пациенток основной группы установлено появление следующих белков: аполипопротеина А-IV, глобулина, связывающего половые гормоны, компонентов системы комплемента С3 и С4b, не обнаруженных у женщин контрольной группы.

Главной функцией глобулина, связывающего половые гормоны (ГСПГ), является транспорт стероидных гормонов (эстрогенов и андрогенов) и регуляция их биодоступности для тканей-мишеней [21]. В последние годы накоплены также сведения о роли ГСПГ в качестве активатора аденилатциклазной системы через взаимодействие со своим специфическим, высокоаффинным рецептором на поверхности клеточных мембран [22].

Гиперэкспрессия межклеточного ГСПГ в эндометриоидной ткани является результатом формирования эстрогенпреобладающей среды, так как эстрогены усиливают его синтез. Связанный с ГСПГ эстроген защищен от катаболизма и доступен для эндометриальных клеток, что способствует развитию эндометриоза [23]. Таким образом, повышенное содержание при изучаемом заболевании ГСПГ, играющего роль своеобразного депо стероидных гормонов в ПЖ, создает условия для локальной гиперэстрогении [1]. В этих условиях становится возможным усиление пролиферативного потенциала клеток эндометриоидных гетеротопий.

Обнаруженный в ПЖ аполипопротеин A-IV - основной структурный компонент липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) и хиломикронов. Он является мощным активатором лецитинхолестерин­ацилтрансферазы и липопротеинлипазы - ферментов, имеющих большое значение в метаболизме липопротеинов [24]. Аполипопротеин A-IV также обладает антиоксидантной активностью, ингибируя перекисное окисление липидов [25]. Индукция экспрессии аполипопротеина A-IV может быть одним из механизмов, который лежит в основе повышения уровня ЛПВП, обладающих противовоспалительными свойствами. Так, Л.В. Колесникова и соавт. [26] показали, что содержание ЛПВП увеличено при эндометриозе.

Усиление продукции (и, как следствие, появление в ПЖ) аполипопротеина A-IV, принимая во внимание его функции, очевидно, имеет компенсаторное значение в условиях окислительного стресса и воспаления, сопровождающих развитие данной патологии.

Что касается появляющихся в ПЖ женщин основной группы компонентов системы комплемента С3 и С4b, то они играют важную роль в поддержании врожденного и адаптивного иммунного ответа, в том числе гуморального и клеточного иммунитета. Компоненты С3 и С4b секретируются в ПЖ активированными макрофагами, а также эктопическим эндометрием [27]. Выявленная нами динамика компонентов С3 и С4b согласуется с результатами ряда авторов [27, 28], которые также показали, что уровень этих белков значительно увеличивается в ПЖ при эндометриозе. Причиной повышенной активации системы комплемента при вышеуказанном заболевании может быть нарушение ее регуляции.

Усиление секреции компонентов комплемента, являющихся непосредственными участниками воспалительной реакции, обезвреживания апоптозных клеток и иммунных комплексов, вносит определенный вклад в механизмы развития эндометриоза и эндометриоз-ассоциированного бесплодия [28].

Приведенные данные [4, 6] подтверждают представление о том, что ПЖ не является пассивной микросредой, а играет активную роль в развитии этой патологии.

Выполненные исследования свидетельствуют о том, что развитие эндометриоза происходит на фоне изменения продукции ряда важных белков, участвующих в регуляции действия гормонов, редокс-процессов, апоптоза, ангиогенеза, воспаления и иммунного ответа. Полученные результаты протеомного анализа ПЖ расширяют наши представления о молекулярных механизмах, позволяющих функционировать эндометриальным клеткам вне зоны физиологического роста. Выявленные белки отличия могут быть использованы в качестве маркеров эндометриоза.