Посвящается светлой памяти

профессора Татьяны Яковлевны Пшеничниковой

Эндометриоз в настоящее время является одним из распространенных заболеваний женской половой системы и наиболее часто встречается у женщин с бесплодием или синдромом хронической тазовой боли [27]. Несмотря на большое количество теорий, посвященных изучению причин развития данного заболевания, механизмы его патогенеза до настоящего времени остаются до конца не изученными [39].

Апоптоз играет одну их главных ролей в патофизиологии эндометриоза. Это заключение основано на результатах экспериментальных и клинических исследований [28, 32]. В то же время представленный в 2011 г. N. Kaei и соавт. [31] обзор литературы, посвященный роли апоптоза в патогенезе эндометриоза, не смог подтвердить теорию Симпсона (Sampson) о том, что эндометриозные клетки происходят из эндометриальных при их проникновении в полость малого таза при ежемесячных менструациях.

В 2006 г. В.А. Бурлевым и соавт. [20, 25] доказана взаимосвязь пролиферативной и ангиогенной активности эктопического эндометрия. Авторами выделены два варианта перитонеальной формы эндометриоза: активная — с высокой пролиферативно-ангиогенной активностью и неактивная — с низкой пролиферативно-ангиогенной активностью эктопического эндометрия. В дальнейшем нами показано, что одновременное вовлечение сосудов не только эктопического эндометрия, но и тазовой брюшины отягощает патологический процесс. Общей составляющей при перитонеальном эндометриозе являются сосуды эутопического, эктопического эндометрия и брюшины, объединяющие различные ткани и являющиеся основой патологических преобразований [10]. Эти данные подтверждают результаты наших исследований относительно пролиферативной активности в сосудах и процессов ангиогенеза в спайках брюшины малого таза. Так, показано, что у больных с воспалением и без эндометриоза наблюдаются наиболее выраженные изменения как на системном, так и на локальном уровне по отношению к больным с эндометриозом и без воспаления. Существенное влияние на выраженность образования спаек оказывает перитонеальная жидкость, в которой обнаружены наиболее достоверно значимые ангиогенно-зависимые изменения у больных с воспалением по отношению к больным с эндометриозом [9].

В то же время уровень клеточной пролиферации является «отражением» тканевой активности. Пролиферирующие клетки могут быть идентифицированы путем изучения ядерной экспрессии Ki-67 — протеина, который вырабатывается в течение всех фаз менструального цикла. Большим количеством исследований [38] установлена корреляция между экспрессией Ki-67 и количеством митотических клеток.

Уменьшенная восприимчивость эндометриальных эпителиальных и стромальных клеток к апоптозу способствует развитию болезни [29, 30, 34, 37]. Доказано, что у женщин с эндометриозом снижена активность эндометриального эутопического апоптоза [26].

Дальнейшим этапом исследований является настоящая работа, выполненная для получения объективных результатов о роли пролиферации и апоптоза эктопического эндометрия в генезе активной и неактивной форм перитонеального эндометриоза.

Цель исследования — сравнительное изучение уровня пролиферативной активности, экспрессии активаторов и ингибиторов апоптоза в клетках желез и стромы эктопического эндометрия у больных с активной и неактивной формой генитального эндометриоза в пролиферативную и секреторную фазы менструального цикла.

Обследована 31 больная в возрасте от 22 до 39 лет (средний возраст 31,4 года) с перитонеальной формой эндометриоза. Перитонеальный эндометриоз был диагностирован при проведении лапароскопии и на основании данных гистологического исследования биоптатов, полученных из мест локализации эндометриоза.

У 21 (67,7%) больной в образцах эктопического эндометрия была выявлена митотическая активность в железистом эпителии более 3% и в окружающей строме более 1,5%, что позволило выделить их в группу с высокой пролиферативной активностью (1-я группа). У10 (32,3%) больных в образцах эктопического эндометрия митотическая активность была зарегистрирована менее 0,3% в железистом эпителии и в стромальном компоненте, и на основании этих результатов была сформирована группа больных с низкой пролиферативной активностью (2-я группа). Эти критерии выделения групп были аналогичны, описанным нами ранее [20, 25].

Степень распространенности эндометриоза была оценена с использованием пересмотренной классификации Американского общества фертильности [18] и соответствовала 2—3-й стадии во всех случаях. В исследование были включены пациентки с характерным черным цветом гетеротопий. У 16 больных была середина пролиферативной фазы менструального цикла, у 15 — середина секреторной. Эти данные соответствовали дню менструального цикла, данным гистологического исследования эндометрия [35], а также содержанию эстрадиола и прогестерона в сыворотке крови. Из исследования были исключены больные с другой гинекологической патологией, нерегулярным менструальным циклом и получавшие гормональную терапию в течение предшествующих 3 мес. Информированное согласие на использование образцов крови, перитонеальной жидкости, эутопического и эктопического эндометрия ткани и брюшины для проведения исследований было получено у всех пациенток. Дизайн исследования: стратифицированное одномоментное исследование.

Характеристика образцов ткани и сыворотки крови. Образцы эутопического и эктопического эндометрия были получены во время лапароскопии. Гетеротопии удаляли из мест, подозрительных в отношении роста эктопического эндометрия. Все образцы были разделены на две части: одна была предназначена для гистопатологического исследования, другая была заморожена в жидком азоте (–70 °C) до момента проведения исследования. В соответствии с результатами гистопатологического исследования все образцы эктопического эндометрия содержали эндометриальный железистый эпителий, окруженный стромальной тканью. Кровь для исследования получали из кубитальной вены в стандартных условиях у всех пациенток утром перед операцией.

Иммуногистохимический анализ. Окрашивание эктопического эндометрия проводилось в условиях стандартного протокола, как описано нами ранее [25]. Неспецифического окрашивания не было. Серия образцов была изучена как минимум 2 раза.

Пролиферативная активность. В качестве первичных антител были использованы моноклональные мышиные антитела Ki-67 (MIB-1, «Immunotech», Марсель, Франция, 1:300), в качестве вторичных — биотиниированные лошадиные антимышиные антитела («Vector Laboratories», Burlingame, CA, США). Иммуногистохимическое окрашивание криообразцов аденокарциномы яичника человека было использовано в качестве позитивного контроля. Экспрессия Ki-67 оценивалась двумя независимыми исследователями в 10 областях при 400-кратном увеличении микроскопа. Пролиферативный индекс (ПИ) рассчитывался как процент Ki-67 позитивных клеток.

Регуляторы апоптоза. В качестве первичных антител были использованы мышиные anti-Bcl-2 (Clone 124, No M0887, «Dako», Glostrup, Дания, 1:200), кроличьи anti-Bax (d21,sc-6236, 1:200), кроличьи anti-Bak (G-23: sc-832, 1:200) и кроличьи anti-Bcl-х (S-18: sc-634, 1:200) («Santa Cruz Biotechnology», Santa Cruz, CA, США). Позитивным контролем при окрашивании для Bcl-2, Bcl-x, Bax и Bak являлись криообразцы аденокарциномы яичника. Группа позитивного контроля показала ожидаемое окрашивание.

Нервные микроволокна. Окрашивание эутопического эндометрия проводилось в условиях стандартного протокола. Оценка результатов осуществлялась по наличию или отсутствию специфического окрашивания нервных микроволокон в ткани эутопического эндометрия [17].

Интенсивность окрашивания. Интенсивность иммуногистохимического окрашивания в баллах (SCORE) оценивалась в 5 предлежащих областях при 400-кратном увеличении: 0 — сравнима с негативным контролем; 1 — при слабом окрашивании (едва видно, но не более); 2 — между слабым и сильным окрашиванием; 3 — сильное окрашивание. Исследователь, определяющий SCORE, был независим от экспериментальных данных.

Определение гормонов сыворотки крови. Исследование содержания эстрадиола и прогестерона в сыворотке крови проводилось с использованием метода иммунной хемилюминесценции в соответствии с рекомендациями производителя (Immunlite, «Diagnostic Products Corporation, CA», США).

Статистический анализ. Для анализа результатов использовали статистические компьютерные программы PASW Statistics 18. Результаты исследования представлены как средние±стандартное отклонение (М±SD). В зависимости от конкретных условий применялся: парный или непарный t-тест Стьюдента, парный критерий Вилкоксона, U-критерий Манна—Уитни для независимых групп, попарное сравнение — критерием Манна—Уитни. Различия между группами считались достоверными при p<0,05.

Характеристика обследованных больных. Сравнительный анализ клинических данных у больных 1-й и 2-й групп показал, что во многом картина была однородной, но вместе с тем по ряду признаков имелись различия. Достоверных различий в жалобах больных между двумя группами не выявлено. Жалобы на бесплодие предъявляли 17 больных в 1-й группе, при этом у 7 — наблюдалось первичное бесплодие, у 10 — вторичное. Достоверных различий, касающихся жалоб на бесплодие, по отношению ко 2-й группе выявлено не было: у 3 отмечалось первичное, у 4 — вторичное бесплодие. Достоверных различий в жалобах на болевой синдром также не зарегистрировано, однако отмечено увеличение числа больных с устойчивой болью в 1-й группе. Дисменорея наблюдалась у 17 женщин 1-й группы и у всех больных 2-й группы. Диспареуния и хронические тазовые боли отмечались у 18 женщин в 1-й группе и у 8 — во 2-й группе. Достоверных различий в содержании прогестерона и эстрадиола в сыворотке крови между группами не установлено в пролиферативную и секреторную фазы цикла, и эти данные соответствовали нормативным значениям.

Во всех образцах эутопического эндометрия было обнаружено положительное окрашивание нервных микроволокон на PGP 9,5, расположенных в функциональном слое среди клеток стромы и вблизи микрососудов. Эти результаты подтвердили факты наличия у обследованных больных признаков эндометриоза, что соответствует данным литературы о положительной реакции на нервные микроволокна PGP 9,5 в эутопическом эндометрии при выявлении роста на брюшине эктопического эндометрия [5, 32].

Первый этап. Оценка экспрессии протеинов группы Вcl-2 в железистом эпителии эктопического эндометрия у больных с активной и неактивной формами перитонеального эндометриоза представлена в табл. 1.

Второй этап. Оценка экспрессии протеинов группы Вcl-2 в строме эктопического эндометрия у больных с активной и неактивной формой перитонеального эндометриоза представлена в табл. 2.

Равновесие обновляющихся тканей связано с двумя динамическими разнонаправленными процессами: митотической активностью и гибелью клеточных популяций. Нарушение нормального контроля гибели клеток вызывает изменение гомеостаза и приводит к различным патологическим заболеваниям. Апоптоз, являясь запрограммированной гибелью клеток, вызывается внутренними и внешними сигналами и требует затраты энергии, транскрипции генов и синтеза белка de novo. Индукция апоптоза зависит от накопления поврежденной ДНК клеток, элиминации или недостатка ростовых факторов, связывания специфических рецепторов R. Каждый из индукторов приводит к активации аспарагинспецифических протеаз — каспаз с последующим переходом в необратимую фазу. До активации каспаз апоптоз может быть обратимым [26, 28]. Известно, что опухолевые клетки обладают пониженной способностью запускать механизмы клеточной гибели вследствие независимости их от факторов, регулирующих апоптоз. Наблюдающаяся повышенная экспрессия белков семейства Bcl-2 приводит к повышению жизнеспособности клеток. Ген Bcl-2 является проонкогеном, однако повышение его экспрессии не приводит к онкогенному росту, так как, препятствуя апоптозу, не влияет на пролиферативную активность. Способность Bcl-2 предотвращать гибель клеток путем апоптоза, индуцированного отсутствием факторов роста, ультрафиолетового и радиоактивного облучения, теплового шока, химиотерапии, оксидативного стресса связана с блокадой общего конечного пути гибели клеток — высвобождением митохондриальных факторов, запускающих апоптоз.

Установлено, что апоптоз в эктопическом эндометрии ниже, чем в эутопическом, у тех же самых больных и по отношению к контролю [29].

Наши многолетние исследования по эндометриозу позволили опубликовать в международных журналах и в рецензируемых журналах СССР и России в 1983—2011 гг. наиболее значимые данные, приведенные в табл. 3.

В течение последних десяти лет идентифицированы некоторые гены, регулирующие процесс апоптоза [36]. Показано достоверное соответствие в последовательности аминокислот в пептидах, участвующих в ранней регуляции апоптоза. Некоторые из них являются ингибиторами апоптоза (Bcl-2), другие — активаторами (Bax, Bak). Вовлечение клеток в апоптоз зависит от текущего баланса между активаторами и ингибиторами. Измененное проявление генов, связанных с апоптозом, у женщин с эндометриозом может объяснить индивидуальную восприимчивость к болезни и ответить на вопрос, почему только у некоторых женщин развивается эндометриоз. Хотя те основные механизмы, при которых эндометриозные клетки приобретают антиапоптотические свойства, не были убедительно объяснены. Можно предположить два возможных механизма: 1) эндометриозные клетки являются генетически стойкими к некоторым апоптозным стимулам, или 2) перитонеальная жидкость у больных с эндометриозом ингибирует апоптозные стимулы в эндометриальных тканях.

Разнообразные экспериментальные исследования с использованием веществ, влияющих на апоптоз эндометриозных клеток, показали, что эти воздействия позволяют получать стойкие положительные эффекты. Показано, что часть из этих потенциальных агентов обладают апоптозстимулирующим свойством и могут быть рекомендованы в качестве потенциальных лекарственных форм для применения в клинической практике лечения эндометриоза в будущем [33, 34].

Несомненно, что дополнительные и детализированные исследования по изучению апоптоза необходимы для установления его особенностей в различных по локализации местах повреждений для разграничения соотношения эффектов между дисрегуляцией апоптоза и патогенезом эндометриоза.

Таким образом, проведенное исследование позволило показать участие апоптоза в процессах пролиферации в эктопическом эндометрии у больных с перитонеальной формой эндометриоза в зависимости от активной или неактивной его формы. Экспрессия белков, связанных с пролиферацией и апоптозом, в эктопическом эндометрии приводит к избыточному накоплению разнонаправленных сигналов, регулирующих эти функции, что изменяет его течение и реализуется в активной форме заболевания, способствуя прогрессированию и отягощению. Разграничение двух форм перитонеального эндометриоза с учетом пролиферативной и апоптотической активности будет способствовать как обоснованному прогнозу заболевания, так и выбору тактики лечения с учетом избирательной модуляции апоптоза или хирургической ее составляющей.

Благодарности. Выражаю благодарность проф. M. Olovsson и сотрудникам Department of Women’s and Children’s Health, Uppsala University, Uppsala, Sweden за многолетнее сотрудничество, участие, обсуждение и поддержку. Финансовая, научная, правовая и политическая помощь осуществлялась со стороны Шведской Королевской Академии наук, Шведского медицинского Исследовательского Совета (проект №8683), Университета Уппсалы, Швеция, Российской Академии медицинских наук, ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России.