Изменения структуры активного центра лактоферрина из перитонеальной жидкости у больных генитальным эндометриозом

Лактоферрин — Lf (молекулярная масса человеческого Lf около 80 кД) является членом семейства трансферринов — железосвязывающих и транспортирующих белков, которые имеют специфичную антимикробную активность. Содержащая два атома железа кристаллическая структура Lf представляет собой два гомологичных конца цепи, каждый из которых имеет железосвязывающий домен. Таким образом, механизм, которым (апо)Lf реализует свою антимикробную активность, в основном связан с лишением микроорганизмов необходимого для их развития и роста ингредиента — железа. Однако антибактериальная активность Lf против Streptococcus mutans не ингибируется добавлением ионов железа к питательной среде. Это свидетельствует, что Lf также обладает антибактериальной активностью помимо хелатирования железа [1]. N-конец цепи, в частности в области остатков 28—34 (так называемый лактоферрицин), ответствен за высокоэффективное связывание Lf с Escherichia coli [2]. Lf также способен проявлять фунгицидную активность (in vitro) против определенных штаммов Candida spp. [3] и может ингибировать рост паразита Toxoplasma gondii [4]. Большое внимание в настоящее время в различных публикациях уделяется способности Lf регулировать клеточный рост и его антиопухолевой и иммуномодулирующей активности [5]. Кроме вышеперечисленных свойств, Lf обладает еще аналгезирующей [6] и гипотензивной активностью [7], зависящей от действия оксида азота, поскольку он обладает способностью активировать NO-синтазы (NOS) — ферменты, производящие оксид азота. Lf входит в состав всех эндотелиальных секретов человека.

Причиной женского бесплодия в 20—75% (по различным оценкам) случаев может явиться генитальный эндометриоз [8]. Это заболевание, как известно, характеризуется наличием вне матки тканей, гистологически подобных эндометрию, и ассоциировано с воспалительным процессом. Многие вопросы этиологии и патогенеза заболевания, в том числе роль воспаления в генезе очагов эндометриоидного поражения, еще не ясна. Следует отметить, что развитие первых симптомов заболевания Э (I—II стадия по классификации Научного центра акушерства, гинекологии и перинатологии,1993) может протекать бессимптомно. Поэтому раннее выявление заболевания может сыграть значительную роль в профилактике как развития заболевания, так и его последствий в виде бесплодия и тазовых болей.

Обмен железа в организме женщины при эндометриозе в значительной мере нарушается. Кроме железодефицитной анемии (возможно, вследствие нарушений менструального цикла в виде дисменореи и менометроррагий), в тканях, имеющих очаги поражения, фиксируют конгломераты железа [8]. Изучение и моделирование возникновения и поведения этих конгломератов [9] показало, что они тождественны по структуре так называемому «нетрансферринсвязанному железу» [10]. Как правило, такого рода структуры регистрируют в тканях при различных трансферринемиях (генетически обусловленных нарушениях структуры железотранспортирующих и депонирующих систем). Также характерным для такого типа патологий является сочетание железодефицитных анемий и конгломератов железа в тканях. В генотипе пациенток с эндометриозом различной степени тяжести обнаруживали полиморфизм гена трансферрина *С2 (ТФ×С2) [11]. Гены именно этого семейства белков (трансферрина, овотрансферрина и Lf) являются наиболее эстрогензависимыми [12] и могут претерпевать заметные нарушения при гинекологических и андрогенных патологиях.

Все вышеизложенное побудило нас исследовать методом ЭПР (электронный парамагнитный резонанс)-спектроскопии структуру железосвязывающего центра Lf в перитонеальной жидкости больных эндометриозом.

В гинекологическом отделении Городской клинической больницы №50 Москвы с января 2011 г. наблюдались 32 пациентки с диагнозом эндометриоза 2-й степени (21 больная) и 3-й степени (11). Наиболее частой жалобой были хронические тазовые боли (76%). Практически все больные отмечали усиление болей с течением времени. Также частой жалобой была менометроррагия (32%). Психоэмоциональные и вегетососудистые нарушения отмечались у подавляющего большинства пациенток (84%). Бесплодие зафиксировано у 7 (4,3%) больных наружным эндометриозом. Отмечена высокая частота различных внутриматочных вмешательств в анамнезе (47%), неоднократное лечение по поводу воспалительных заболеваний придатков матки (54%).

Всем больным проводилось хирургическое лечение лапароскопическим доступом: вылущивание эндометриоидной кисты яичников — 29 больным, коагуляция очагов наружного генитального эндометриоза — 24. Во всех случаях диагноз верифицирован гистологически. Во время операции у всех 32 пациенток взяты образцы ПЖ для изучения структуры Lf. Во время операции было зарегистрировано увеличение объема ПЖ до 25±3,5 мл.

Контрольные образцы ПЖ (1,5 мл) были получены от больных, подвергавшихся лапароскопической операции по поводу других заболеваний (общее число образцов контрольной группы — 8). Признаков эндометриоза у этих пациенток выявлено не было.

Исследование ПЖ проводили методом ЭПР-радиоспектроскопии, пользуясь прибором фирмы «Брукер» 3-см диапазона ECS-10⁶ в кварцевом дьюаре при температуре –196°С (жидкий азот). Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета программ Windows Excel.

ЭПР-спектры нативных образцов ПЖ человека характеризуются сигналами негемового железа (Fe³⁺) железотранспортного белка Lf [13] в области g=4,3 (рис. 1).

Работы, проведенные при помощи ЭПР-спектроскопии на чистых образцах различных трансферринов и их мутантах [20, 21], показывают, что N-конец цепи трансферрина более легко достижим и легче поддается реконструированию путем полимеразной цепной реакции, нежели С-конец. Некоторые изменения последовательности аминокислот N-конца значительно отражаются на геометрии центра, из-за чего сигнал приобретает характер синглета [20]. Мы не наблюдали ни в одном из спектров различных образцов ПЖ подобных полных изменений, хотя изменение формы сигнала присутствует в спектрах всех ПЖ больных эндометриозом. Полученный нами сигнал представляет собой сложную суперпозицию двух сигналов: синглета с g-фактором 4,3 и деформированного исходного дублета с g-суммарным 4,3.

Здесь возможны два толкования полученных изменений — это может быть частичное наложение на исходный чужеродного синглетного сигнала со смещенным в сторону более сильных полей g-фактором (например, комплекса одного из гормонов катехоламинового стресса с трехвалентным железом) или сигнал от измененного железосвязывающего центра С-конца полипептидной цепи Lf [21]. Данные литературы [22] показывают, что при значительном мутационном изменении аминокислотного состава и конфигурации С-конца цепи (с возникновением синглетного сигнала от измененного центра) могут иметь место оба случая. Но в нашем случае возникновение синглетного сигнала от комплекса железа с адреналином маловероятно, поскольку все данные указывают на то, что обусловленная эндометриозом общая трансферринемия отрицательно сказывается на доступности ионов железа для комплексования с адреналином и норадреналином.

Одним из признаков воспаления при эндометриозе может быть снижение защитной функции ПЖ и обнаружение в урогенитальном и колоректальном трактах, а также в брюшной полости возбудителей разнообразных болезней [17, 18]. Однако, если сопоставить эти данные с антивирусной способностью не только Lf, но и его олигопептидной части, относящейся к N-концу цепи, — лактоферрицина [19], то становится ясным, что частичное повреждение активного центра Lf влечет за собой неполную утрату всех его антиинфекционных функций. Поскольку антибактериальные функции сохраняются при наличии хотя бы одного атома железа на молекулу, а антивирусные (даже при полной потере железа) — при сохраняющемся неповрежденным более легко доступном N-конце цепи, следует считать, что наличие чужеродной флоры свидетельствует о повреждении одного из активных центров Lf. Об этом же косвенно может свидетельствовать воспалительный процесс брюшины при эндометриозе, поскольку при нормальных условиях Lf выступает как мощный антивоспалительный фактор [23].

Интересным представляется вопрос о связи присутствия дефектного Lf в ПЖ больных эндометриозом и выделением в ходе воспалительного процесса сигнальной молекулы — монооксида азота. Единственная найденная нами работа [24], касающаяся взаимодействия Lf с NO и выполненная методом ЭПР-спектроскопии, порождает ряд вопросов и в первую очередь о структуре полученного авторами комплекса, поскольку предполагаемая ими структура должна быть диамагнитной. Предпринятая нами обработка NO (в вакууме, с предварительным откачиванием кислорода и других газов) образцов ПЖ, полученной от больных эндометриозом и контрольной группы, не показала изменения формы сигнала (на рис. 3 не показано). Из этого следует, что в данном случае NO не взаимодействует с трехвалентным железом из активного центра Lf.

1. В ПЖ больных эндометриозом концентрация активных центров Lf значительно снижена по сравнению с концентрацией этих же центров у больных с другой гинекологической патологией.

2. Изучение ЭПР-спектров Lf из ПЖ показывает, что при эндометриозе наиболее вероятно нарушение геометрии С-конца полипептидной цепи Lf.

3. Изменения структуры Lf могут явиться патогенетическим обоснованием применения антиоксидантов и противовоспалительных средств в комплексном лечении генитального эндометриоза.

Работа выполнена при финансовой поддержке Президентской программы, грант № MD 2958.2011.7, и гранта программы Президиума РАН «Фундаментальные науки в медицине» 2012.