Абдульвапова З.Н.

ФГБУ «Эндокринологический научный центр» Минздрава России, Москва, Российская Федерация

Артемова Е.В.

ФГБУ «Эндокринологический научный центр» Минздрава России, Москва

Горбачева А.М.

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва, Российская Федерация

Галстян Г.Р.

ФГБУ "Эндокринологический научный центр", Москва

Токмакова А.Ю.

ФГБУ "Эндокринологический научный центр" МЗ РФ

Гаврилова С.А.

ФГБО УВО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова», Москва, Россия

Сравнительная оценка различных моделей дистальной диабетической полинейропатии у крыс: преимущества и недостатки

Журнал: Проблемы эндокринологии. 2018;64(3): 188-193

Просмотров : 146

Загрузок : 2

Как цитировать

Абдульвапова З. Н., Артемова Е. В., Горбачева А. М., Галстян Г. Р., Токмакова А. Ю., Гаврилова С. А. Сравнительная оценка различных моделей дистальной диабетической полинейропатии у крыс: преимущества и недостатки. Проблемы эндокринологии. 2018;64(3):188-193. https://doi.org/10.14341/probl9284

Авторы:

Абдульвапова З.Н.

ФГБУ «Эндокринологический научный центр» Минздрава России, Москва, Российская Федерация

Все авторы (6)

Развитие осложнений сахарного диабета (СД) приводит к значимым социально-экономическим потерям. По данным Международной федерации диабета (IDF), распространенность СД среди взрослого населения планеты (20—79 лет) составляет примерно 9% (415 млн человек). По прогнозам экспертов, к 2040 г. число взрослых больных СД достигнет 642 млн. Неуклонный рост распространенности СД требует разработки эффективных лекарственных средств, методов своевременного выявления и профилактики заболевания. По данным IDF, в России С.Д. страдают 12,1 млн человек, но зарегистрировано всего около 4 млн пациентов. Помощь больным с диабетическим поражением стоп является одной из самых актуальных проблем, поскольку число ампутаций нижних конечностей в большинстве развитых стран неуклонно растет. Это ведет к увеличению численности инвалидов и смертности лиц с СД, существенным образом увеличивает расходы на здравоохранение и социальное обеспечение.

Диабетическая полинейропатия (ДПН) является одним из наиболее распространенных поздних осложнений СД, а также главной причиной формирования язвенных дефектов стоп [1]. Данные о распространенности нейропатии среди лиц с СД варьируют от 28 до 65% и зависят от длительности заболевания и методов диагностики. Начальные признаки повреждения периферической нервной системы обнаруживаются уже у лиц с предиабетом [2].

Сведения о механизмах повреждения нервного волокна при СД достаточно ограничены. Неясно также, какие типы нервных волокон поражаются первыми, и как нарушаются регулируемые нервной системой репарация тканей и местный иммунный статус.

Важным шагом на пути решения этих вопросов является детальный анализ экспериментальных моделей СД (у крыс и мышей), арсенала методов диагностики ДПН и оценки влияния гипергликемии на сроки развития ДПН [3].

СТЗ-индуцированный СД — одна из самых часто используемых моделей для изучения ДПН. СТЗ — 2-деокси-2-([(метилнитрозоамино) каринил]амино) —D-глюкопираноза — представляет собой антибиотик, продуцируемый Streptomycetes achromogenes. Гибель β-клеток под его влиянием обусловлена в основном алкилированием и последующим фрагментированием ДНК. В попытках восстановления поврежденной ДНК активируются процессы поли-АДФ-рибозилирования, истощается пул НАД+, нарушается работа митохондрий. Метилирование митохондриальной ДНК отягощает повреждение. Дополнительным механизмом действия СТЗ является активация ксантиноксидазы, что способствует развитию окислительного стресса и гибели клеток. Экспериментальный диабет развивается при однократной внутрибрюшинной или внутривенной инъекции СТЗ в дозе 40—80 мг/кг массы животного. Развитие С.Д. документируется уровнем гликемии выше 15 мМ/л (270 мг/дл). Аллодиния и замедление проведения нервного импульса возникают уже на 2—4-й неделе после введения СТЗ, однако для формирования структурных изменений в нервных волокнах необходимо до 8—16 нед. Хотя высокие дозы СТЗ нейротоксичны, убедительно доказано, что нейропатия, развивающаяся при СТЗ-диабете, наиболее сопоставима с ДПН у человека [4].

У данной модели СД есть ряд очевидных преимуществ. Наибольшее количество исследований проводилось именно на этой модели. Определенным плюсом является и невысокая стоимость эксперимента. У таких животных наблюдаются ранние признаки нейропатии, выявляемые в ходе электрофизиологических тестов, и умеренные изменения в структуре нервных волокон. Однако введение СТЗ не приводит к демиелинизации и потере волокон в нервных пучках (кроме случаев очень длительной патологии). Животные стремительно теряют в весе, у них развивается кетоз, что (при необходимости длительного эксперимента) требует применения поддерживающих доз инсулина [3].

Аллоксан

Для моделирования СД используют и аллоксан (2,4,5,6-оксипиримидин). Это вещество токсично для β-клеток, структурно сходно с глюкозой и легко транспортируется GLUT-2 в клетки поджелудочной железы. В клетках аллоксан восстанавливается и запускает цепочку окислительно-восстановительных реакций с образованием супероксид аниона, который превращается в гидроксил-радикал, обладающий чрезвычайной реакционной способностью. Аллоксан ингибирует глюкокиназу, снижает чувствительность клеток поджелудочной железы к глюкозе и нарушает синтез инсулина [5]. После введения аллоксана у животных быстро развивается стойкая гипергликемия. В настоящее время из двух «химических» моделей чаще используют стрептозотоциновую, так как СТЗ более избирательно действует на β-клетки и менее токсичен для других клеток организма. С помощью ДТЗ можно вызвать частичную гибель β-клеток и спровоцировать «умеренно выраженный» С.Д. Кроме того, аллоксан менее стабилен в растворах и оказывает токсическое действие на гепатоциты.

Крысы BB/Wor

У склонных к развитию СД крыс BB/Wor отсутствуют Т-лимфоциты, экспрессирующие RT6-аллоантиген, который препятствует аутоиммунной реакции к клеткам собственной поджелудочной железы. У самцов крыс этой линии в возрасте 70—80 дней спонтанно развивается СД1 с абсолютной недостаточностью инсулина/С-пептида, так что им необходима ежедневная инсулинотерапия. Нарушения нервной проводимости развиваются спустя 2 нед от начала заболевания, а через 4 мес наблюдаются потеря нервных волокон и структурные изменения в икроножном нерве [6]. После развития СД животных можно наблюдать более года, поддерживая инсулином необходимый уровень гликемии. Ключевым преимуществом модели BB/Wor является максимальное приближение к естественному развитию СД1. Однако такие животные довольно дороги, а уход за ними трудоемок.

Преимуществом мышиных моделей СД является возможность использования разных генетических линий, имитирующих различные механизмы развития патологии. Недостатком же является небольшой размер животных, что требует применения специальных экспериментальных техник.

СД может быть смоделирован у мышей как инбредных, так и аутбредных линий однократным введением СТЗ в дозе 150—200 мг/кг или последовательным в течение нескольких дней его введением по схеме 90+90, 85+70+55 или 100+40+40 мг/кг. Наиболее удачными моделями на сегодняшний день являются линии Swiss—Webster (аутбредные), С57/В16 и CD1 (инбредные). Снижение скорости проведения по нервному волокну, нарушение ответа в сенсорных тестах, потеря нервных волокон происходит на 2—8-й неделе С.Д. Спустя несколько месяцев возникают истончение миелиновой оболочки и аксональная атрофия. После введения СТЗ у мышей может восстановиться эугликемия, обусловленная пролиферацией остаточных β-клеток, но в отсутствие инсулинотерапии смертность животных достаточно высока.

Существует две основные генетические мышиные модели СД1 NOD (non-obese diabetic) и Akita [7—9]. NOD отличаются спонтанным развитием аутоимунного диабета; у мышей Akita наблюдается мутация в гене инсулина. Сроки развития нейропатии у мышей этих линий недостаточно выяснены. У мышей линии Akita развивается средняя или тяжелая нейропатия. Соответствующих животных дорого и трудно содержать; им необходимо ежедневное введение инсулина.

Крысы линии Zucker

Крысы линии Zucker — стандартная модель для изучения метаболического синдрома и СД2. При спонтанной рецессивной мутации fa в гене Lepr гипоталамический рецептор лептина содержит пролин вместо глутамина. Лептин теряет способность взаимодействовать со своим рецептором, что приводит к отсутствию насыщения, и крысы едят в течение всего периода бодрствования [10]. В возрасте 8—10 нед у них развиваются ожирение и гипергликемия [11, 12]. Данную линию крыс использовали для изучения механизмов развития болевой нейропатии [13, 14] и для оценки эффективности различных методов лечения ДПН [15—19].

В 1988 г. у 5-годовалых крыс линии Sprague—Dawley (SD), страдающих ожирением, развились полидипсия, полиурия и глюкозурия. Для закрепления данной линии животные были скрещены с молодыми самками того же штамма и было получено первое поколение крыс с СД. В 1991 г. у некоторых самцов этой колонии в возрасте 4—5 мес спонтанно развился СД с глюкозурией. В 1997 г. был получен новый инбредный штамм крыс, страдающих ожирением и СД2. Эта линия крыс получила название Torii (SDT) [20]. В настоящее время дистрибьютером крыс линии Torii является «Clea Japan, Inc.» (Токио, Япония). В процессе селекции штамма распространенность СД2 у крыс-самцов в генерации F4 составила 90%, в генерации F9 и последующих — 100%. В генерации F7 СД развивается примерно у 4-месячных самцов. Выживаемость животных с гипергликемией без инсулинотерапии среди самцов к 65 нед составляет 92%, среди самок — 97% [21]. Гликемия натощак значимо увеличивается, достигая к 30 нед 38 ммоль/л (700 мг/дл) и более. У животных регистрируются полидипсия, полифагия, полиурия, глюкозурия. Гипергликемия в большей степени обусловлена снижением секреции инсулина, чем инсулинорезистентностью [22]. На 35-й неделе и позже отмечается значимое увеличение уровня гликированного гемоглобина, степени протеинурии, уровней мочевины и триглицеридов в крови [21]. Таким образом, линия крыс SDT является моделью СД2 с нарушенной секрецией инсулина, но без ожирения.

Признаки ДПН в эксперименте манифестируют в острую метаболическую фазу, которая чаще всего обратима. На этой стадии замедляется распространение возбуждения по нервному волокну и развивается гипералгезия. При сохранении гипергликемии нарушения прогрессируют и формируются структурные изменения нерва (хроническая «структурная» фаза).

При электрофизиологических исследованиях скорость проведения импульса по двигательному волокну у крыс SDT моложе 6 мес не отличалась от нормальных SD крыс, но к 10-му и 12-му месяцам резко снижалась [20, 23]. Скорость проведения по чувствительному волокну также снижалась. Увеличение содержания сорбитола и фруктозы в нерве и снижение миоинозитола указывает на роль полиолового пути в развитии ДПН. Ранирестат (ингибитор альдозоредуктазы) снижает уровень сорбитола в седалищном нерве и увеличивает скорость проведения импульса по двигательному волокну [24].

При морфометрическом анализе у крыс линий SD и SDT моложе 6 мес не отмечалось нарушений структуры миелина, однако в возрасте 12 мес у крыс SDT регистрировалось снижение миелинизации. Количество кровеносных сосудов в оболочке нерва у животных обеих линий не отличалось, однако у крыс SDT наблюдались окклюзированные и истонченные эпиневральные артериолы. Утолщение интимы, возможно, приводит к снижению перфузии нерва, что играет роль в развитии ДПН у SDT крыс. Таким образом, у крыс линии SDT после дебюта СД2 наблюдается ДПН с функциональными и морфологическими изменениями периферических нервов и сосудов [23].

Гастроинтестинальная форма ДАП у крыс проявляется диареей. В диагностических тестах (charcoal propulsion test) у крыс линии SDT на 28-й неделе регистрируется усиление моторики желудочно-кишечного тракта [25]. У них увеличены масса тонкой кишки и слизистых оболочек, а также диаметр просвета и высота ворсинок [26].

Крысы линии Zucker, как отмечено выше, несут рецессивную мутацию fa в гене Lepr, что приводит к отсутствию насыщения. Однако у людей, как правило, дефицит рецепторов лептина отсутствует. С учетом этого обстоятельства путем скрещивания крыс линии Sprague—Dawley (c алиментарным ожирением) и крыс линии Zucker получены крысы Zucker Sprague—Dawley (ZDSD). Эти животные предрасположены к ожирению и развитию СД на 15—21-й неделе жизни при высококалорийном питании [27, 28]. У них не нарушен сигнальный путь лептина и накапливается меньше жира. Хроническая гипергликемия у крыс ZDSD сопровождается повреждением нервов и сосудов, как и в других моделях СД2 [29—32].

Однако хроническая гипергликемия у крыс этой линии не приводит к снижению плотности интраэпидермальных нервных волокон, хотя и снижает количество клеток Лангерганса в эпидермисе. После дебюта СД у животных уменьшается количество нервов в субэпителиальном слое роговицы (суррогатный маркер диабетической нейропатии). Крысы линии ZDSD с сохранным сигнальным путем лептина служат хорошей моделью для исследований терапии диабетической нейропатии (ДН).

Крысы линии GK являются одной из лучших моделей ожирения и СД2 [33]. У крыс этой линии на фоне нарушенной толерантности к глюкозе и дефицита инсулина развивается повреждение периферических нервов, прогрессирующее при нарастании гипергликемии. Нормализация гликемии улучшает состояние нервов. У крыс линии GK наблюдалось также повреждение нервов роговицы [34]. Предполагается, что повреждение нервов роговицы способствует развитию диабетической кератопатии у пациентов с СД.

Крысы линии BBZDR/Wor были получены путем скрещивания резистентных к развитию СД крыс BB/Wor с крысами линии Zucker (дефект рецепторов лептина и инсулинорезистентность) [35]. Линия BBZDR/Wor также характеризуется развитием СД у самцов в возрасте 70—80 дней. Однако диабету у них предшествует ожирение, что позволяет считать это моделью СД2. У этих крыс наблюдаются инсулинорезистентность, гиперинсулинемия, гипергликемия, гиперхолестеринемия, дислипидемия и (на поздних сроках) артериальная гипертензия. Снижение скорости распространения возбуждения по нервному волокну и терминальная гипералгезия развиваются уже к концу 4-й недели заболевания. Структурные изменения, включая потерю волокон икроножного нерва, качественно отличаются от таковых в модели BB/Wor. Основным преимуществом линии BBZDR/Wor является спонтанное развитие гипергликемии, которая длительно сохраняется [6, 35]. К недостаткам модели относится стоимость животных и необходимость инсулинотерапии.

У крыс OLETF в возрасте 10 мес отмечено значительное снижение тепловой чувствительности и скорости проведения нервного импульса по двигательному волокну [36]. Включение в рацион сахарозы приводило к прогрессированию ДПН, снижению кровотока в седалищном нерве и активности в нем Na+, K+-АТФазы [37].

Заключение

На съезде Европейской группы по изучению ДН были сформулированы минимальные требования к дизайну экспериментальных исследований с оценкой влияния нарушений углеводного обмена на развитие ДПН [3]. Следует рандомизировать животных в группах и подбирать нужное их количество для обеспечения статистически и биологически значимых результатов. Важно анализировать исследуемые параметры до индукции СД, а также предусматривать сопоставимую по возрасту и полу группу контроля. Необходимо проводить динамическую оценку массы тела, уровня глюкозы в крови, гликированного гемоглобина и, в зависимости от типа СД, измерять артериальное давление, содержание инсулина и липидов в крови. Исследователи должны указывать условия содержания животных (светлое время суток, продолжительность сна/бодрствования, особенности рациона, количество животных в клетке). План статистического анализа с определением конечных точек исследования должен оставаться неизменным, учитывая и положительные и отрицательные результаты работы. Диагностика ДПН в экспериментальной группе должна проводиться в сравнении с контрольной и подтверждаться наличием как минимум двух из трех исследуемых параметров: поведенческих тестов, скорости проведения импульса по нервному волокну и/или морфологии нервов. Учитывая стремительно растущую заболеваемость преимущественно СД2, необходимо проводить больше экспериментальных исследований на моделях именно этого типа СД2, сопровождающегося гиперлипидемией и другими метаболическими нарушениями, а также артериальной гипертензией.

Важнейшим аспектом доклинических исследований является определение четких критериев инструментальной диагностики ДПН для своевременного выявления обратимых и необратимых функциональных нарушений, а также морфологических изменений на клеточном уровне. Моделирование дистальной ДПН у животных позволяет анализировать различные стороны патогенеза этого распространенного осложнения СД и открывает возможность поиска и разработки новых лекарственных препаратов.

Дополнительная информация

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с проведенной работой и публикацией настоящей статьи.

Источники финансирования. Поисково-аналитическая работа по подготовке рукописи проведена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант РНФ № 161510365).

Участие авторов: поиск и анализ информации в международных базах данных, написание текста публикации — Абдульвапова З.Н., Артемова Е.В., Горбачева А.М., написание текста публикации, редактирование рукописи — Галстян Г.Р., Гаврилова С.А., Токмакова А.Ю.

Все авторы прочли и одобрили финальную версию рукописи перед публикацией.

Сведения об авторах

*Артемова Екатерина Викторовна [Ekaterina V. Artemova, MD]; адрес: Россия, 117036 Москва, ул. Дм. Ульянова 11, [11 Dm. Ulyanova street, Moscow 117036, Russia]; ORCID: http://orcid.org/0000-0002-2232-4765; eLibrary SPIN-код: 4649-0765; e-mail: profilaktika@bk.ru

Абдульвапова Зера Нусредовна [Zera N. Abdulvapova, MD]; ORCID: http://orcid.org/0000-0002-1129-8995; eLibrary SPIN-код: 4455-5667; e-mail:zera1987@mail.ru;

Горбачева Анна Максимовна [Anna M. Gorbacheva, MD]; ORCID: http://orcid.org/0000-0001-6581-4521; eLibrary SPIN-код: 9815-7509; e-mail:ann.gorbachewa@yandex.ru

Галстян Гагик Радикович, д.м.н., проф. [Gagik R. Galstyan, PhD, professor]; ORCID: http://orcid.org/0000-0001-6581-4521;

eLibrary SPIN-код: 9815-7509; e-mail: galstyangagik964@gmail.com

Токмакова Алла Юрьевна, д.м.н. [Alla Yu. Tokmakova, PhD]; ORCID:http://orcid.org/0000-0003-2474-9924; eLibrary SPIN-код: 7479-7043; e-mail: alla-tokmakova@yandex.ru

Гаврилова Светлана Анатольевна, к.б.н., доц. [Svetlana A. Gavrilova, PhD]; ORCID: http://orcid.org/0000-0002-8776-6062;

eLibrary SPIN-код: 9212-1137; e-mail: sgavrilova@mail.ru

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail