Адренокортикальный рак (АКР) — сравнительно редкая злокачественная опухоль коры надпочечника, характеризующаяся агрессивным клиническим течением и плохим лечебным прогнозом.

Гетерогенность морфологического строения АКР часто обусловливает диагностические ошибки. Ведущим методом лечения больных с АКР остается хирургический. Однако возможности хирургического лечения существенно ограничены в связи с поздним выявлением заболевания, когда распространенность опухолевого процесса соответствует III и IV стадиям. Частота рецидивирования после радикальных (R0) операций достигает 85%, а показатель общей выживаемости составляет всего 18—48% и в последние 10—15 лет не обнаруживает существенной тенденции к улучшению [1—3].

В качестве адъювантного лечения местно-распространенного АКР, а также в случаях диссеминированного опухолевого процесса применяют терапию митотаном [4, 5]. В России изучена эффективность митотана в 57 случаях АКР [6]. Стабилизация процесса и частичный эффект (по критериям RECIST) отмечены только у 48,7% больных; влияние терапии на продолжительность жизни больных не исследовалось.

Для лекарственной терапии АКР предложен и ряд таргетных препаратов, опосредующих свое действие через специфические рецепторы, однако их применение ограничивается сравнительно небольшим числом наблюдений и в целом низкой эффективностью [6, 7].

Таким образом, ограниченные возможности и сравнительно невысокая эффективность хирургического лечения АКР и предлагаемых лекарственных препаратов диктуют необходимость поиска новых путей улучшения результатов терапии пациентов с подобными новообразованиями. Одним из таких путей являются молекулярно-биологические и генетические исследования с целью выявления новых клеточных мишеней лекарственной терапии АКР.

В последние годы появились сообщения об экспрессии рецепторов к соматостатину (РССТ) в ткани АКР, а также о влиянии синтетических аналогов соматостатина на рост клеточных линий карциномы коры надпочечников in vitro [8, 9]. Имеющиеся данные, однако, неоднозначны, что и послужило основанием для проведения собственного исследования.

Цель исследования — оценить экспрессию РССТ 2-го и 5-го подтипов в АКР и образованиях коры надпочечников с неопределенным потенциалом злокачественности.

В обсервационное одномоментное неконтролируемое моноцентровое пилотное исследование были включены 13 пациентов 28—68 лет с опухолями коры надпочечников.

В исследование включали пациентов старше 18 лет с гистологически подтвержденным диагнозом АКР или новообразованием коры надпочечников с неопределенным потенциалом злокачественности.

Морфологическая диагностика АКР проводилась в соответствии с критериями Weiss (для АКР) и Lin—Weiss—Bisceglia (для онкоцитарных опухолей). Критерии Weiss для дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных новообразований коры надпочечника включают: высокий ядерный Grade (Grade 3 и 4 по Fuhrman и др.), митозы (более 5 на 50 репрезентативных полей зрения), атипические митозы, содержание светлых клеток менее 25%, диффузную архитектуру (более 1/3 опухоли), некрозы, инвазию вен, синусоидальную инвазию, инвазию капсулы. Три и более признака коррелируют со злокачественным потенциалом [10—12].

Критерии Lin—Weiss—Bisceglia для онкоцитарных новообразований коры надпочечников подразделяются на большие (более 5 митозов на 50 репрезентативных полей зрения, атипические митозы, инвазия вен) и малые (размер опухоли более 10 см и/или масса более 200 г, некрозы, инвазия капсулы, синусоидальная инвазия). Наличие одного из больших критериев свидетельствует о злокачественности, присутствие от 1 до 4 малых критериев — о неопределенном потенциале злокачественности [10—12].

Гистогенез опухолей был подтвержден с помощью иммуногистохимического (ИГХ) метода с использованием тканеспецифических маркеров: антител к мелану-А и ингибину-α. Для дифференциальной диагностики с новообразованиями нейроэндокринной природы проводили ИГХ-типирование с антителами к синаптофизину и хромогранину А. В случаях изолированной экспрессии мелана-А для исключения первичной меланомы дополнительно проводили исследование с антителами к HMB-45 и тирозиназе.

Морфологическая верификация диагноза с ИГХ-исследованием была выполнена в патологоанатомическом отделении ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского. Оценка гистологических препаратов и ИГХ-реакции проводилась независимо двумя патологами с последующим обсуждением результатов и вынесением коллегиального заключения.

Исследование проводилось с 2016 по 2017 г.

Основным исходом исследования считалось наличие или отсутствие экспрессии РССТ 2-го и/или 5-го подтипов в ткани новообразования коры НП.

В соответствии с экспрессией РССТ2 или РССТ5 пациенты были разделены на подгруппы РССТ2+ и РССТ5+. В случаях сочетанной экспрессии РССТ2 и РССТ5 пациенты не выделялись в отдельную группу из-за малого количества наблюдений, а включались в каждую подгруппу.

Оценка экспрессии рецепторов к соматостатину в опухолевых клетках проводилась по шкале M. Volante и соавт. [13]: 0 баллов — отсутствие экспрессии, 1 балл — только цитоплазматическое окрашивание, 2 балла — полное или частичное окрашивание мембраны до 50% опухолевых клеток (независимо от наличия цитоплазматического окрашивания) и 3 балла — полное мембранное окрашивание более 50% опухолевых клеток (независимо от наличия цитоплазматического окрашивания). Положительной считалась реакция в 2 и 3 балла (рис. 1,).

Оценка экспрессии и определение индекса Ki-67 проводились по стандартной методике (вычисляли среднее количество меченных этим маркером ядер из 100 ядер опухолевых клеток при учете 500 клеток в репрезентативных полях зрения при ув. 400).

ИГХ-исследование было проведено на автоматизированной системе Ventana Benech Ultra («Roche», Швейцария) по стандартным протоколам с антителами к мелану-А (клон A103; разведение 1:100; «CellMarque», США), ингибину-α (клон MRQ-63; разведение 1:100; «CellMarque», США), синаптофизину (клон MRQ-40; разведение 1:100; «CellMarque», США), хромогранину A (клон LK2H10; разведение 1:100; «CellMarque», США), Ki-67 (клон MIB-1; разведение 1:100; «Dako», Великобритания), РССТ2 (клон EP149; разведение 1:100; «Epitomics», США), РССТ5 (клон ID-UMB4, разведение1:100; «Epitomics», США) с использованием набора для визуализации REVEAL Biotin-FreePolyvalent DAB («Roche», Швейцария).

Все пациенты подписывали добровольное информированное согласие на использование биологического материала в научных целях и на обработку персональных данных. Протокол исследования одобрен этическим комитетом ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского от 15.12.16 (протокол заседания № 10).

Принципы расчета размера выборки: размер выборки предварительно не рассчитывался.

Методы статистического анализа данных: использовалась программа Statistica for Windows v.12.0 («StatSoft Inc.», США). Количественные данные представлены в виде медианы (Ме), моды (Мо) и квартилей (25-й и 75-й процентили, Q25—75), качественные — в виде долей.

Сравнительный анализ двух независимых групп по количественному признаку проводили с помощью критерия Манна—Уитни, по качественному признаку — с использованием двустороннего точного критерия Фишера. Взаимосвязь изученных признаков определяли по коэффициенту корреляции Спирмена (r_s). Статистически достоверными считались различия при р<0,05.

В исследование вошли 13 пациентов (4 мужчин и 9 женщин) 28—68 лет с опухолями коры надпочечников (Me=46 [38; 55]).

Среди исследованных новообразований было 10 первичных АКР (из них 1 онкоцитарный вариант карциномы коры надпочечника), 1 метастаз АКР в печень и 2 онкоцитомы надпочечников с неопределенным потенциалом злокачественности. В 3 случаях АКР характеризовался гиперпродукцией глюкокортикоидов с развитием синдрома Кушинга, в 1 случае отмечалась сочетанная гиперпродукция глюкокортикоидов и андрогенов, еще в 8 случаях образования были гормонально-неактивными (6 карцином, 2 онкоцитомы). В 1 случае достоверно судить о функциональной активности новообразования не представлялось возможным (см. таблицу).

В работу были включены 9 АКР с оценкой по системе Weiss от 3 до 8 баллов (Me=5; Mo=5; 25;75Q) [4, 6], 1 онкоцитарная карцинома (1 большой критерий — атипический митоз), 2 онкоцитомы с неопределенным потенциалом злокачественности (1 и 2 малых критерия; в первом случае — синусоидальная инвазия, во втором — синусоидальная инвазия и инвазия капсулы) и 1 метастаз АКР в печени. При ИГХ-исследовании экспрессия тканеспецифического маркера мелан-А была выявлена в 100%, ингибина-α — в 54% опухолей. cинаптофизин экспрессировался в 90% случаев, а экспрессия хромогранина, А не была выявлена ни в одной опухоли.

Индекс пролиферации Кi-67 в АКР варьировал от 5 до 30% (Me=21 [8; 24]), а в онкоцитомах с неопределенным потенциалом злокачественности составлял 6 и 12% (см. таблицу). Экспрессия РССТ2 исследовалась в 13 случаях, а РССТ5 — в 10. Экспрессия РССТ2 выявлена в 8 (61,5%) из 13 опухолей: в 4 образцах — 1 балл и в 4 — 2 балла. Ни в одном случае не было выявлено экспрессии с оценкой в 3 балла (см. таблицу).

Экспрессия РССТ5 была выявлена в 9 (90%) из 10 образцов и оценивалась в 1 балл — в 3 случаях, в 2 балла — в 1 и в 3 балла — в 5 случаях (см. таблицу).

Поскольку диагностически значимой является экспрессия в 2 и 3 балла, то реакция с антителами к РССТ2 была расценена как положительная в 4 (31%) случаях, а к РССТ5 — в 6 (60%). Коэкспрессия рецепторов обоих типов была выявлена в 2 случаях (см. таблицу).

Экспрессия РССТ была диффузной в большинстве опухолей (60% случаев); по 20% приходилось на очаговую и фокальную экспрессию этих рецепторов (в отдельных клетках или небольших группах). В 2 последних случаях экспрессия считалась положительной, так как более 30% клеток в поле зрения были иммунопозитивны (см. таблицу).

Экспрессия РССТ была зафиксирована как в первичных АКР, включая онкоцитарный вариант, так и в метастазе АКР в печени (рис. 2,).

В ходе данного пилотного исследования, включавшего 13 пациентов, было показано наличие экспрессии РССТ в АКР различной морфологической структуры, в том числе и в онкоцитарном варианте карциномы, а также в метастазе АКР в печень. При этом опухоли характеризовались более частой и выраженной экспрессией РССТ5, чем РССТ2.

Из рекомендуемых тканеспецифических маркеров коры надпочечника, таких как SF1 (steroidogenic factor-1), ингибин-α и мелан-А, в нашей работе применялись мелан-А и ингибин-α. По нашим данным, экспрессия мелана-А наблюдалась в 100% исследованных опухолей, в то время как ингибина-α — лишь в 54%. A. Weissferdt и соавт. [14] при изучении иммунофенотипа 40 АКР нашли экспрессию ингибина-α в 92,5%, синаптофизина — в 72,5%, а мелана-А — в 65% случаев. Можно предположить, что различия в экспрессии тканеспецифичных маркеров связаны с разным числом наблюдений и разным гистогенезом новообразований коры надпочечников. Известно, что ингибин-α в нормальной коре надпочечников экспрессируется преимущественно в клетках сетчатой зоны надпочечников [15].

Наиболее широко используемая система морфологической диагностики АКР основывается на оценке микроскопических критериев в баллах и вычислением суммарного индекса по шкале Weiss [12]. Редким вариантом является онкоцитарный АКР, который изучен недостаточно. Онкоцитомы — новообразования коры надпочечников, характеризующиеся диффузной архитектурой, крупными клетками с обильной плотной эозинофильной цитоплазмой, очаговым ядерным плеоморфизмом и хорошо различимыми ядрышками [12, 16]. Для диагностики этой группы опухолей бальная шкала морфологической оценки злокачественности, разработаннная Weiss и соавт., не подходит, и для этого предложены критерии морфологической стратификации Lin—Weiss—Bisceglia [12]. По этим критериям опухоли в нашем исследовании были верифицированы как АКР в 9 случаях, онкоцитарная карцинома — в 1, онкоцитома с неопределенным потенциалом злокачественности — в 2. Метастаз АКР в печени был диагностирован в 1 случае на основании данных анамнеза и по результатам ИГХ-исследования с тканеспецифическими маркерами. Как свидетельствует практика, морфологическая диагностика и оценка степени злокачественности онкоцитарных новообразований коры надпочечников связаны с максимальными трудностями; в ряде случаев устанавливается ошибочный диагноз, что приводит к неверной тактике ведения пациентов.

Результаты выявления различных подтипов РССТ в АКР зависят от метода их идентификации (полимеразная цепная реакция, ИГХ). На результаты ИГХ-метода влияет выбор антитела (производитель, клональность) и системы детекции, а также критериев оценки ИГХ-реакции. Так, в работе A. Germano и соавт. [9] экспрессия РССТ2 отмечалась у 17 (29%) из 58, а РССТ5 — у 19 (35%) из 55 АКР. В более раннем исследовании B. Mariniello и соавт. [8] РССТ2 выявлены в 100% (6/6) АКР, а РССТ5 — в 83% (5/6). N. Unger и соавт. [17] продемонстрировали экспрессию РССТ2 в 12% из 25 АКР, а РССТ5 — в 24%. В настоящем исследовании диагностически значимая экспрессия РССТ была выявлена у 8 (61,5%) из 13 опухолей, при этом в 2 случаях была отмечена их коэкспрессия (РССТ2+/РССТ5+). Экспрессия РССТ5 встречалась в 1,5 раза чаще, чем РССТ2, однако эта разница не достигала статистической значимости (р=0,28), что можно объяснить малой выборкой. Обращает на себя внимание тот факт, что экспрессия РССТ5 была значимо более выраженной (р=0,048) и в 5 случаях соответствовала 3 баллам, тогда как для РССТ2 максимальный уровень экспрессии был оценен в 2 балла. Можно предположить, что более низкая частота экспрессии РССТ2 в исследованных нами опухолях связана с влиянием гиперкортицизма. Сильное подавляющее действие избыточного количества глюкокортикоидов на экспрессию РССТ2 и менее значительное на РССТ5 было продемонстрировано в эксперименте C. De Bruin и соавт. [18] с использованием человеческих нейроэндокринных клеточных линий. В этом же исследовании было отмечено увеличение экспрессии РССТ2 уже через 2—4 дня после устранения влияния глюкокортикоидов. Однако в нашей группе синдром Кушинга был лабораторно подтвержден у 4 пациентов с АКР, у 2 из которых была выявлена экспрессия РССТ2.

Таким образом, по данным большинства исследований, РССТ5 экспрессируются в АКР чаще, чем РССТ2, что отличается от нейроэндокринных опухолей различной локализации, в которых наблюдается существенное преобладание РССТ2 с интенсивностью в 2 и 3 балла [19].

A. Germano и соавт. [9] при изучении 58 АКР показали, что наличие РССТ5 связано с худшим прогнозом. Мы оценивали связь экспрессии РССТ2 и РССТ5 с уровнем индекса пролиферации Ki-67, высокие значения которого считаются неблагоприятным фактором прогноза. АКР, экспрессирующие РССТ2, имели индекс пролиферации Ki-67 от 23 до 26%, а АКР, экспрессирующие РССТ5, — от 5 до 24%. Экспрессия РССТ5 отрицательно коррелировала с уровнем индекса Ki-67 (r_s= –0,32), тогда как экспрессия РССТ2 коррелировала с более высокими значениями этого индекса (r_s=0,625). Столь противоречивые данные могут быть связаны с малой выборкой и трудностями подсчета Ki-67. К тому же, как недавно показано, значения индекса Ki-67 в АКР, по данным разных авторов [20], значительно расходятся; вариируются также результаты подсчетов у одного и того же патолога.

Исследование статуса рецепторов к соматостатину в АКР и опухолях коры надпочечников с неопределенным потенциалом злокачественности является подготовительным этапом для поиска новых мишеней и путей лечения АКР. Необходимы дальнейшие исследования с включением большего числа случаев.

Долгое время применение аналогов соматостатина у пациентов с АКР рассматривалось как метод купирования гормональной гиперпродукции. По одним данным, аналоги соматостатина значительно снижают продукцию гормонов, по другим — такой эффект отсутствует [21, 22]. В каждой из работ исследовался высокогетерогенный по особенностям гистогенеза и иммунофенотипа набор АКР. При этом высока вероятность диагностических ошибок, что еще раз подчеркивает необходимость очень точной верификации опухолей данной группы.

В последнее время рассматривается возможность применения при АКР аналогов соматостатина, что обусловлено их антипролиферативным действием. Блокирование пролиферативной активности опухолевых клеток посредством активации РССТ может быть связано с подавлением выделения опухолевыми клетками и окружающим опухоль матриксом ростовых факторов и различных трофических гормонов (СТГ, ИРФ-1, инсулин, гастрин, эпидермальный ростовой фактор) [23]. Активация РССТ2 может запускать механизм апоптоза опухолевых клеток через р53-независимый путь. Активация РССТ2 и РССТ5 может индуцировать блокаду клеточного цикла за счет индукции ингибитора циклинзависимой киназы 1B (р27^Kip1), гипофосфорилирования Rb, ингибирования циклина/cdk2 и гуанилилциклазы [24].

Агонисты соматостатина могут также влиять на ангиогенез в опухоли, подавляя выделение проангиогенных факторов и экспрессию соответствующих рецепторов, таких как сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) и его рецептор-2 (VEGFR-2), фактор роста фибробластов (bFGF), гормон роста/инсулиноподобный фактор роста 1 (ИРФ-1) [24] и др.

Применение аналогов соматостатина при АКР как в виде монотерапии, так и в комбинации с другими препаратами рассматривалось многими авторами. C. Ziegler и соавт. [25] показали существенное влияние RC-160 (вапреотида) на рост и выживание опухолевых клеток в культуре SW-13 (митотан-нечувствительный АКР). Однако B. Mariniello и соавт. [8], изучив влияние пасиреотида (SOM 230) на клеточные линии АКР (первичная культура и линии SW13 и H295R), пришли к заключению, что аналог соматостатина подавляет гормональную продукцию клеток АКР, но не влияет на их жизнеспособность. В более поздней работе A. Germano и соавт. [9] с использованием клеточных линий АКР, чувствительных (H295R) и нечувствительных (SW13) к митотану, также не выявили влияния пасиреотида на жизнеспособность клеток АКР. В то же время митотан и пасиреотид синергично тормозили пролиферацию клеток линии SW13 (резистентных к митотану). Напротив, в митотан-чувствительной культуре (H295R) эти препараты препятствовали действию друг друга на рост клеток.

Коллектив авторов допускает, что определенное влияние на доказательность полученных результатов оказал малый объем исследуемой выборки. Однако специфичность реакции с антителами к РССТ не позволяет сомневаться в качестве ИГХ-исследования и наличии РССТ, по крайней мере, в определенной части АКР.

Подтверждено наличие РССТ в АКР и опухолях коры надпочечника с неопределенным потенциалом злокачественности и выявлено преобладание в них экспрессии РССТ5. Полученные данные могут служить основой для дальнейших исследований экспрессии РССТ в карциномах коры надпочечников с целью анализа ее взаимосвязи с морфологическими и иммуногистохимическими характеристиками опухолей и роли в прогнозе заболевания.

Источник финансирования. Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант РНФ № 15−15−30032).

Конфликт интересов: авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Участие авторов: проведение и оценка гистологического и иммуногистохимического исследований, обработка данных, написание текста, подготовка иллюстраций — Воронкова И.А., оценка гистологического и иммуногистохимического исследований, обработка и анализ полученных данных, написание и редактирование текста, подготовка иллюстраций — Гуревич Л.Е., сбор материала, обработка данных, анализ полученных данных, написание и редактирование текста — Бритвин Т.А., сбор материала, обработка данных, редактирование текста — Кривошеев А.В., концепция и дизайн исследования, анализ полученных данных, редактирование текста — Мельниченко Г.А..

Сведения об авторах

*Воронкова Ия Александровна — к.м.н. [Iya A. Voronkova, MD, PhD]; адрес: Россия, 117036 Москва, ул. Дм. Ульянова 11 [address: 11 Dm. Ulyanova street, Moscow 117036, Russia]; ORCID: http://orcid.org/0000-0001-6687-3240; eLibrary SPIN: 9685-1371;

e-mail: iya-v@yandex.ru

Гуревич Лариса Евсеевна — д.б.н., проф. [Larisa E. Gurevch, PhD, Professor]; ORCID: http://orcid.org/0000-0002-9731-3649;

eLibrary SPIN: 8615-0038; e-mail:larisgur@mail.ru

Бритвин Тимур Альбертович — д.м.н [Timur A. Britvin, MD, PhD]; ORCID: http://orcid.org/0000-0001-6160-1342; eLibrary SPIN: 1207-2935; e-mail: t.britvin@gmail.com

Кривошеев Алексей Викторович — [Alexey V. Krivosheev]; ORCID: http://orcid.org/0000-0003-3643-6810; eLibrary SPIN: 6166-8406;

e-mail: doc275@mail.ru

Мельниченко Галина Афанасьевна — д.м.н., проф., акад. РАН [Galina A. Mel’nichenko, MD, PhD, Professor];

ORCID: http://orcid.org/0000-0002-5634-7877; eLibrary SPIN: 5873-2280; e-mail: teofrast2000@mail.ru